Ipecac의 위치인 문화 중 생 Auxin 및 시 토 키 닌의 정량화

요약

우발적인 촬영 phytohormone 치료 없이 ipecac의 internodal 세그먼트에 유도 될 수 있다. 우발적인 촬영 형성 동안 phytohormone 역학을 평가 하기 위해 내 생 auxin 및 LC-MS/MS에 의해 internodal 세그먼트에서 시 토 키 닌을 측정 했습니다.

초록

우발적인 촬영 형성 유전자 변형 식물의 재생 및 경제적으로 중요 한 작물의 전파에 대 한 중요 한 기술입니다. Phytohormone 치료는 대부분의 종에서 우발적인 촬영의 유도 필요 합니다. Auxin과 시 토 키 닌 (CK) 사이의 균형에 의해 결정 됩니다 여부 우발적인 촬영 유도 될 수 있는 수준. 많은 노력 결정 최적 농도 및 explants로 사용 하는 각 조직에 각 식물 종에 phytohormones의 조합으로 간다. 그러나 Ipecac에서, 우발적인 촬영 수 유도 될 phytohormone 치료 없이 문화 매체에서 internodal 세그먼트에. 평가할 셀 차별화 ipecac의 고유한 소성 수 있습니다. Ipecac 우발적인 촬영 유도, 우리 phytohormone 무료 B5 중간 5 주 동안 0.2 %gellan 껌으로 고형화에 14 h 빛/10-h 어두운 주기에 internodal 세그먼트 15 µmol m^{−2의 − 1} 의 빛에서 24 ° C에서 경작. 우발적인 촬영 형성 동안 phytohormone 역학 조사, 우리 생 indole-3-아세트산 및 CKs 세그먼트에 의해 측정 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 LC-MS/MS. 이 메서드는 간단한 방식으로 생 indole-3-아세트산 및 CKs 레벨의 분석을 수 있습니다. 그것은 다른 식물 종에 organogenesis 동안 내 생 auxin과 CK의 역학 조사에 적용할 수 있습니다.

서론

고트 Haberlandt (1854-1945 년) "totipotency", 어떤 식물에 의해 세포 수, 차별화, 분열과 성숙한 식물¹에서 특정 세포 유형으로 차별화 그들의 이전 후에 전체 식물을 재생성의 개념을 제안 했다. 조직 문화에서 조합 및 성장 매체에 적용 된 것 phytohormones의 농도 의해 결정 됩니다 여부 식물 재생 여부 유도 될 수 있다. Skoog와 밀러 우발적인 뿌리 매체 포함 된 낮은 비율²에 유도 될 수 있는 반면 우발적인 촬영에 auxins, CKs의 높은 비율을 포함 하는 문화 매체에 굳은 살 담배에서에서 유도 될 수 있는 발견. 그 발견 이후 조직 문화는 널리 이용 된다 경제적으로 중요 한 작물의 전파 및 유전자 변형 식물³의 재생. 우발적인 촬영 촬영 정점 분열 조직, 잎, 뿌리, internodes 등 다른 조직에서 유도 될 수 있다. Phytohormone 치료는 대부분의 식물 종에서 우발적인 촬영의 유도 필요 합니다. 그러나, 최적 농도 조합 다 종에 의해 및 explants로 사용 하는 조직 중. 따라서, 많은 노력 결정 최적 농도 실험에 대 한 phytohormones의 조합으로 간다.

Carapichea ipecacuanha (Brot) L. 앤더슨 (ipecac)는 emetine 등 뿌리⁴에 주로 cephaeline, 알 카 로이드를 포함 하는 약용 식물 이다. 루트 추출 물 expectorant, 토 제, 그리고 amoebicide⁵로 사용 됩니다. 비록 ipecac 브라질의 열 대 우림에 자연적으로 성장, 문화, 씨앗을 설정 하기를 꺼 려 이며 발 아 율 감소는 추운 기후⁶일본, 씨앗 보관. 대신, 조직 문화에 의해 전파, 어떤 우발적인 촬영 internodes에 가장 효율적인 방법^7,8. 흥미롭게도, 우발적인 촬영 phytohormone 치료⁸없이이 종에서 유도 될 수 있다.

우발적인 촬영 표 피 기저 지역⁹에 callusing, 없이 internodal 세그먼트의 꼭대기 지역에 형성 된다. 이 차이 아마도 phytohormonal 규정 internodal 세그먼트에서 조직 극성을 나타냅니다. Ipecac 문화 시스템 우발적인 촬영 형성 동안 내 생 phytohormone 레벨에 변화를 분석 하는 독특한 기회를 허용 합니다. 한 auxin (indole-3-아세트산 (IAA)) 및 4 개의 CKs 생 레벨의 분석에 대 한 우리의 방법을 소개 (isopentenyl 아데닌 (iP), isopentenyl 아데닌 아 (iPR), 트랜스-제 (tZ), 및 트랜스-제 아 (tZR)) 액정-MS/MS 사용 internodal 세그먼트.

프로토콜

참고: Ipecac (C. ipecacuanha)에 사용 되었다이 연구 생 phytohormones의 분석을 용이 하 게 하기 때문에.

1. 성장 조건 Ipecac의 우발적인 촬영 유도

1. PH 5.7¹⁰, 조정 phytohormone 무료 B5 매체를 준비 하 고 0.2 %gellan 껌을 추가. 압력가 마로 소독 하 여 소독.
2. 멸 균 페 트리 접시 (90 m m × 20 m m)에 압력가 하는 매체의 25 mL를 붓으십시오.
3. Ipecac plantlets 수술 메스를 사용 하 여 살 균 아크릴 플레이트에 블레이드 번호 22의 8 밀리미터 internodal 세그먼트를 잘라내어 매체 (그림 1)에 배치.
4. 24 ° C 15 µmol m^{−2의 − 1} 5 주 동안 14 h 빛/10-h 어두운 주기에서 빛의 아래에 B5 매체 phytohormone 무료에 문화.
5. 지역 식별 난 (꼭대기) 4 (기저) 각 세그먼트 (그림 1B). 일주일에 한 번 우발적인 촬영 > 0.3 m m 길이 현미경으로 각 지역에서의 수를 계산 합니다.

2. 추출 및 Phytohormones의 정화

1. 각 4 개의 2 mL 샘플 튜브 5 m m 지 르 코니 아 비드를 넣어.
2. 지역으로 세그먼트를 잘라 iv (각 2 m m에 길이) 수술 메스를 사용 하 여 살 균 아크릴 판에 나.
3. 별도 샘플 튜브 (10-30 mg 신선한 무게)에 각 지역의 8 개 세그먼트를 수집 합니다.
4. 무게, 그리고 그 후 액체 질소에 샘플을 동결.
5. 비드 기반 균질 화기를 사용 하 여 얼음된 샘플을 짝사랑.
6. Auxin의 각 내부 표준의 500 pg와 紀 (d₅-IAA, d₅tZ, d₅tZR, d₆-iP, d₆-지적재산권)를 포함 하는 1 mL 이기에 짓 눌린된 샘플 일시 중지와 동 믹서를 사용 하 여.
7. 1 시간에 4 ° C에서 누른 다음 실 온에서 5 분 동안 3500 × g 에서 원심.
8. 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 80% (v/v) 이기에 펠 릿을 세척. 원심 분리기 다시 3500 × g 에서 실 온에서 5 분. 일회용 유리 튜브에서 (2.7, 2.8 단계)에서 supernatants 결합.
9. 추가 600 µ L 각 결합된 상쾌한을 포함 1% (v/v) 초 산 물이 고 이기는 진공 집중 장치를 사용 하 여 증발.
10. 이기, 메탄올, 및 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 물의 1 mL를 각각 적용 하 여 친수성 닥터지-평형 (HLB) 열 카트리지를 equilibrate.
11. Equilibrated HLB 카트리지 당 하나의 샘플 솔루션을 적용 합니다.
12. 1 mL 물 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 카트리지를 씻어.
13. 포함 하는 유리 튜브에 1% (v/v) 초 산 2 mL 80% (v/v) 이기와 모든 호르몬을 elute.
14. 포함 하는 1% (v/v) 초 산 진공 집중 장치를 사용 하 여 물에 추출 eluate에 이기를 증발.
    참고:이 완전히 건조 하지 않습니다.
15. 1 mL 이기, 1 mL 메탄올, 0.5 mL를 적용 하 여 혼합 모드, 강한 양이온 교환 (MCX) 열 카트리지 equilibrate 0.1 M HCl, 그리고 포함 하는 1% (v/v) 초 산 1 mL 물.
16. Equilibrated MCX 카트리지 당 하나의 샘플 솔루션을 적용 합니다.
17. 1 mL 물 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 카트리지를 씻어.
18. 포함 하는 유리 튜브에 1% (v/v) 초 산 2 mL 30% (v/v) 이기와 IAA elute.
19. 씻어 카트리지 포함 하는 1% (v/v) 아세트산 2 mL 80% (v/v) 이기.
20. 씻으십시오 2 mL 물, 1 mL 물 5% 수성 암모니아를 포함 하는 카트리지.
21. 유리 튜브에 5% 수성 암모니아를 포함 하는 2 mL 60% (v/v) 이기와는 CKs을 elute.
22. 진공 농축 기를 사용 하 여 각 호르몬 분수의 용 매를 증발 하 고 LC-MS/MS 분석까지 −30 ° C에 저장 합니다.

3. LC-MS/MS 분석 IAA 및 CKs

1. 각 호르몬 추출 메탄올의 600 µ L 튜브에 녹이 고 나사 목 총 복구 유리병에 솔루션을 전송. 진공 집중 장치를 사용 하 여 용 매를 증발.
2. 20 µ L 30% (v/v) 이기, IAA 분수와 CK 분수 나사 목 총 복구 튜브에 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 20 µ L 물에 용 해.
3. HPLC 시스템 트리플 4 극 자 MS 시스템에서 긍정적인 이온 모드에서 샘플을 분석 합니다.
   표 1에 나열 된 참고: 우리 HPLC 조건을 설정 합니다.
   1. IAA 차입에 대 한 5%-50% 용 매 B 7 분 이상의 이진 그라디언트를 사용 하 여 다음 98% 용 매 B에 의해 증가 1 분 동안 누른 다음 둥지를 주입 하 여 5% 용 매 B에 2 분 동안 equilibrate.
   2. CK 차입에 대 한 2%-40% 용 매 B 5 분 이상 40%-70% 용 매 B 7 분에서의 이진 그라디언트를 사용 하 여 다음 95% 용 매 B 늘려 1 분 동안 누른 다음으로 2% 용 매 B에 2 분 동안 equilibrate 주입을 중첩.
   3. 분무 이온화 (ESI) 설정-MS 이온 소스 표 2에 나열 된 매개 변수.
4. 여러 반응 (MRM) 전환 표 3에 나열 된 각 분석의 정량화에 대 한 모니터링을 사용 합니다.
5. 계량 중수소 라는 표준 레이블 없는 비율의 표준 곡선에 대 한 내 생 IAA 및 CK 수준.

결과

1^세인트 주에서 아니 우발적인 촬영 형성 했다. 2^{노스다코타} 주에 작은 쏘고 나타났다. 3^rd , 4^번째 주에 수 꼭대기 지역 (I 및 II)에서 주로 증가 쏘고 (그림 2A). 5^일 주에 수 촬영의 되었고 약 7 시내 지역 나 지역 II (그림 2B) 5. 대조적으로, 단지 몇 가지 촬영 영역 III 및 IV에에서 형성 되었다.

문화, 전에 IAA 수준 높았다 약간 지역에서 난 (4.1 pg/mg, 신선한 무게 (FW)) 보다 지역 II-4 (~ 2.5 pg/mg FW;

토론

Phytohormones의 분포를 식별 하기 위해 organogenesis에 관련 된 그것은 적용 될 때 phytohormones는 것 유도 위한 explants 때문에 있는 organogenesis phytohormone 무료 매체에 관찰 될 수 있다 식물 재료를 사용 하는 것이 중요 촬영 또는 뿌리, 그들은 전체 explant을, 세포 분화 및 organogenesis에 있는 식물의 고유한가 소성을 평가 하 고 어려운 영향을 미칩니다. 우발적인 촬영 phytohormone 무료 문화 미디어 Dianthus caryophyllus L.¹¹, Aegle marmelos (L.) 코레아¹², Bacopa monnieri (L.) Pennell¹³, 다른 식물 종에서에 유도 될 수 있다 노박 paniculatus Willd.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
[2H5]인돌-3-아세트산	Olchemlm Ltd	031 1531	LC-MS/MS에 대한 내부 표준
[2H5]trans-zeatin	Olchemlm Ltd	030 0301	LC-MS/MS에 대한 내부 표준
[2H5]trans-zeatin riboside	Olchemlm Ltd	030 0311	LC-MS/MS에 대한 내부 표준
[2H6]N6-isopentenyl adenine	Olchemlm Ltd	030 0161	내부 표준 LC-MS/MS
[2H6]N6-이소펜테닐 아데노신	Olchemlm Ltd	030 0171	LC-MS/
MS 인돌-3-아세트산	Wako	098 00181	LC-MS/
MS 트랜스-제틴	표준 SIGMA-ALDRICH	Z0876 5MG	표준 LC-MS/
MS 트랜스-제틴 리보사이드	Wako	262 01081	표준 LC-MS/MS
N6-이소펜테닐 아데닌	SIGMA-ALDRICH	D7674 1G	표준, LC-MS/MS
N6-이소펜테닐 아데노신	ACROS ORGANICS	22648 1000	LC-MS/MS
용 표준, LC-MS용 아세토니트릴 하이퍼그레이드, LiChrosolv	MERCK	1.00029.1000	LC-MS/MS용 용매
크로마토그래피용 물, LiChrosolv	MERCK	1.15333.1000	LC-MS/MS HPLC
	용 용매SHIMADZU	Prominence
MS	Sciex	3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc	Waters	WAT094225	카트리지 컬럼
Oasis MCX 30 mg/1 cc	Waters	186000252	카트리지 컬럼
스크류 넥 총 회수 바이알	Waters	186002805
블루, 12 x 32mm 스크류 넥 캡 및 PTFE/실리콘 격막	Waters
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