초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

요약

병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

초록

단백질 집계 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS)를 포함 하 여 대부분의 신경 퇴행 성 질병의 중앙 특징 이다. 정도 벗어난 단백질 집계 방해 정상적인 세포 항상성 정확한 메커니즘은 알려져 있지 있지만 단백질 집계는이 질병에 neuropathology와 밀접 하 게 관련. 데이터를 신흥 AD, PD, hd, 그 병원 성 집계 가설에 대 한 강력한 지원을 제공 하 고 ALS prions, 단백질만 전염 성 요원 전달할 수 면 encephalopathies에 대 한 책임에 많은 유사점을가지고. 자기 prions 집계 형의 확산을 일으키는 동일한 단백질의 기본적으로 접혀 버전의 변환 템플릿으로 복제. 어떻게 prions 그리고 광고, 프리온 같은 단백질 한 셀에서 다른 PD, HD, 및 ALS 이동 현재 강렬한 수 사의 영역입니다. 여기, HD와 관련 된 돌연변이 huntingtin (Htt)의 프리온 처럼, 셀 전송의 모니터링을 허용 하는 초파리 melanogaster 모델을 설명 합니다. 이 모델 transgene 식 많은 다른 초파리 조직에 조작 하기 위한 강력한 도구를 활용 하 고 돌연변이 체 Htt의 직접 보고서 프리온 같은 전송에 놓여있는지 태그 세포질 단백질을 이용 한다. 중요 한 것은, 우리가 여기에 대해 설명 하는 접근 소설 유전자와 단백질의 다양 한 셀 형식 비보사이의 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 신경 퇴행 성 질병 기초 및 치료 적 개입을 위한 새로운 기회를 공개 하는 병원 성 메커니즘의 제한 된 이해를 확장 됩니다.

서론

프리온 가설 상태에 전염성이 에이전트 전송 가능 해 encephalopathies (예를 들면, 인간에서 크로이츠펠트-야콥 병, 양, 사슴, 엘크, 만성 낭비 질병 및 "광우병" 가축에서 scrapie에 대 한 책임 )의 단백질 및 핵 산¹없는 전적으로 구성 되어 있습니다. 프리온 질병, 세포 프리온 단백질 (PrP^C) 가정 아닌, 안정적인 접이식 PrP (^Sc) 높은 베타 시트-부자 이며 자체 변환 및 안정 된 아 밀 로이드로 단위체 PrP^C 분자에 의해 전파 수 있습니다. 집계합니다. PrP^Sc 집계는 유기 체에 다른 세포 사이 및 개별 유기 체²사이 확산이 자기 복제 메커니즘을 사용 합니다.

단백질 misfolding 및 집계 또한 대부분 신경 퇴행 성 질환 (Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS))의 중앙 특징 이다³. 이러한 질병에 내부 또는 여분 cellular 집계 단백질 어셈블리의 형성은 시간⁵

프로토콜

1. 초파리 에 Gal4 QF 중재 Htt Transgene 식 커플링

1. 수집 또는 생성 하는 유전자 변형 초파리 melanogaster 조직 관련 Gal4 또는 QF "드라이버"를 포함 하는 라인으로 줄 야생-타입 또는 돌연변이 체 Htt transgenes 하류 Gal4 UAS³⁸ 또는³⁹QF-QUAS. 단백질이이 transgenes에서 표현 되는 형광 단백질을 융합 또는 동일한 비행에 돌연변이 야생-타입 Htt transgene 제품의 차별화에 대 한 있도록 피토 프 태그 인지 확인 합니다. 그림 1을 참조 하십시오.
   참고: 우리는 일반적으로 인간의 Htt 유전자²⁷의 exon 1 조각을 사용합니다. 그러나, 유전자 변형 파리 대신 원하는 경우 더 이상 Htt 조각 또는 다른 유전자를 표현 하기 위해 생성할 수 있습니다.
2. 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes 별개, 겹치지 않는 세포 인구에 표현 될 것 이다 그런 유전 전략을 계획 합니다.
   1. 어떤 식의 중복 발생, 돌연변이 및 야생-타입 Htt 단백질 같은 세포에서 ....

결과

여기에 설명 된 방법을 그대로 비행 CNS에서에서 다른 한 세포 인구에서 Htt의 단백질 프리온 같은 전송 시연 하는 강력한 데이터 생성. 야생-타입 Htt의에서 변환 확산 punctate 기증자 ORNs (그림 2A C 및 그림 4A, B)에서 HttQ91 mCherry 식의 결과로 받는 사람 명과에서이 YFP 융해 단백질의 직접 형광에 의해 관찰 됩니다. 이 두 세포 인구 사이 프리온 같은 전송 이벤트의 정확한 보고 유전자 변형 파리와 중 어떤 오버랩 없이 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 강한 식 수준의 생산 Gal4/QF 드라이버의 신중한 선택 필요 개발 또는 성인에서. 또한, 형광 단백질-Htt 퓨전 transgenes의 사려깊은 디자인 강력한 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다........

토론

신경 퇴행 성 질환으로 고통 받는 환자 수가 증가 하 고, 더 나은 치료법을 개발 될 수 있도록 이러한 질병의 분자 pathogenesis의 이해를 증가 하는 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 다른 세포 유형 사이 병원 성 단백질의 프리온 같은 전송 모니터링을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 최근 돌연변이 체 Htt 집계에서 vivo에서 의 프리온 같은 전송 설명 하 고 명과²⁷뉴런에서 이러한 집계의 확산을 중재 phagocytic 수용 체를 식별 하이 방법을 사용 했습니다. 우리의 접근 방식을 악용 초파리 를 사용 하 여 유전자 인간 질병 연구의 몇 가지 장점: 그것의 짧은 라이프 사이클 및 치료와 관련 된 기본적인 생물 학적 정보의 발견을 가속화할 수 있는 광대 한 유전 도구.

우리는 여기에 설명 하는 방법을 기존의 다른 동물에 비해 두 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수(PBS), 10X, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas	Scientific 2904F24
20% 파라포름알데히드(PFA)	전자 현미경 과학	15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered	Lampire Biological Laboratories	7332500	수령 시 분취 및 동결
Chicken anti-GFP	Aves Labs	GFP-1020	1:500 희석에서 사용
Rabbit anti-DsRed	Clontech	632496	1:2000 희석에서 사용; DsRed 기반 형광 단백질(예: mCherry, mStrawberry, tdTomato 등)을 인식할 수 있습니다.
마우스 안티-브루흐파일럿	발달 연구 하이브리도마 뱅크	nc82	1:100 희석에서 사용; 플라이 뇌
FITC 안티-치킨	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	1:250 희석시
사용 Alexa Fluor 568 안티-토끼	Life Technologies	A11011	1:250 희석시
사용 Alexa Fluor 647 안티-마우스 항체	Life Technologies	A21235	1:250 희석에서 사용
Slowfade Gold Antifade 시약	Life	S36936
현미경 슬라이드(25 x 75 x 1.0mm)	Fisher Scientific	12-550-143
커버 유리(22 x 22mm)	Globe Scientific	1404-15
Dumont 생물학 등급 겸자, 스타일 3	Ted Pella	503	비주로 사용하는 손에 사용
Dumont 생물학 학년 겸자, 스타일 5	Ted Pella	505	지배적 인 손에 사용
LAS X 이미지 분석 소프트웨어	Leica
Imaris 이미지 분석 소프트웨어	비트 플레인

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