현재 프로토콜 neurite 결과 홍보 하는 분자 요인 출시 용량 부여 배양된 세포를 자극 하는 실험 절차를 제공 합니다. 치료 신경 macrophage 공동 문화 캠프의 강한 neurite 결과 활동을가지고 바른된 매체를 생산 하는 세포를 유도 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 재생 또는 손상 신경 복구에 참여할 수 있는 강력한 증거가 있다. 여기, 우리 세포 생산 조절 매체 (CM) neurite 결과 촉진 유도 된다 프로토콜을 설명 합니다. 성인 지 루트 신경 절 (DRG) 뉴런 심하게 해리 하 고 도금. 뉴런 안정적으로 연결 하 고, 후 복 막 대 식 세포는 잘 동일한 중첩 셀 문화 삽입에 공동 경작. Dibutyryl 순환 앰프 (db-캠프) 후 세포 배양 삽입 대 식 세포를 포함 하는 24 시간에 대 한 공동 문화에 적용 됩니다 다른 잘 CM 72 h에 대 한 수집을 이동 합니다. 별도 성인 DRG 신경 문화에 적용 될 때 db-캠프로 치료 공동 문화에서 CM 강력한 neurite 결과 활동을 전시 한다. 혼자 단일 셀 형식의 구성 된 db 캠프 대우 문화에서 얻은 CM, DRG의 신경 또는 복 막 대 식 세포, neurite 결과 활동을 전시 하지 않았다. 이 신경 세포와 세포 사이의 상호 작용은 CM에 neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포의 활성화를 위한 불가결 하지 나타냅니다. 따라서, 우리의 공동 문화 패러다임 프로 재생 형으로 부여를 대 식 세포를 자극 하 신경-대 식 세포의 상호 작용에서 세포 신호 공부 유용할 또한.
서론
다양 한 연구는 척수 또는 뇌의 부상 후 CNS 축 삭 재생을 강화 하고자 했다. 염증 성 반응, 신 경계에 상해를 필연적으로 동반 해로운 결과1,2에 지도 하는 보조 병 적인 프로세스에 참여 하도록 전통적으로 생각 된다. 실제로, 염증 반응 억제 수 있습니다 methylprednisolone 급성 척수 부상3에 대 한 유일한 승인 된 치료입니다. 그러나, 최근 연구 제공 증거 대 식 세포, 대표적인 염증 성 세포 유형, 재생 또는 부상된 신 경계4,,56의 수리에 참여할 수 있습니다. 예를 들어 다음과 같은 렌즈 부상 생산 프로 재생 분자 망막 신경 절 신경7,8의 재생을 촉진 하는 대 식 세포 침투. 또한, 이식된 DRG 신경 축 삭 성장 세포 zymosan9에 의해 활성화 된 지역까지 증가. 또한, 병 변 사이트에서 대 식 세포는 부상된 주변 신경10성장 허용 환경을 만들 수 있습니다.
우리의 일은 또한 대 식 세포는 인접 한 뉴런의 축 삭 재생의 용량에 기여할 수 있는 강력한 증거 제공. 우리 느 루트 신경 절 (DRG)에서 대 식 세포의 활성화 했다 나타났습니다 DRG의 향상 된 재생 능력에 필수적인 감각 신경을 따라 늘어진 주변 신경 상해11. 비슷한 연구 독립적으로 다른 실험실12에서 보고 되었다. 우리는 또한 dibutyryl 축 삭 재생13의 용량을 강화 하는 잘 알려진 분자 인 순환 앰프 (db-캠프)의 intraganglionic 주입 대 식 세포의 활성화를 유발을 보여주었다. 대 식 세포의 비활성화 폐지 neurite 결과 활동에 db 캠프의 효과. 후속 작품 부상 유도 식 CCL2의 뉴런에 프로 재생 형14,15대 식 세포를 자극 하는 신호를 확인.
위의 실험 결과 바탕으로, 우리는 체 외에서 모델 닮은 Drg preconditioning 부상 모델11,14다음에 발생 하는 분자 이벤트를 설립 했다. 이 모델에서는 db-캠프 프로 재생 형으로 대 식 세포의 활성화에 이르게 신호 세포 도출 신경 macrophage 공동 문화에 적용 됩니다. 여기, 우리는 우리가 분자 요인 홍보 neurite 결과 (그림 1)을 분 비 하는 세포를 생성할 수 있습니다 자세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험적인 모델 세포 자극 하 하거나 신 경계에 상해 다음 축 삭 재생을 지원 하기 위해 유도 수 개념을 보여 줍니다. 우리의 모델 프로 재생 세포의 활성화에 지도 하는 세포 신호 메커니즘을 공부에 유용할 것 이다.
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프로토콜
모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 아주 대학의과 대학에 의해 승인 되었다.
1. 문화 준비 해리 성인 DRG 신경의
- 문화를 설정 하기 전에 미리 폴 리-D-리와 laminin 6 잘 플레이트 코트. 밤새 0.01% 폴 리-D-리 또는 2 h 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 6 잘 플레이트를 품 어. 다음, 증류수로 두 번 접시 세척.
- 실 온에서 2 h 3 µ g/mL의 농도에서 laminin 솔루션 접시를 품 어 그리고 증류수와 두 번 접시를 세척. 1 시간 이상 실 온에서 접시를 건조.
- 압축된 CO2 가스 실린더에 연결 된 투명 한 공동2 챔버에 마우스 안락사 Incise 수술 칼 날 척추 열을 overlying 피부와 척추 뼈를 양측 paravertebral 근육 해 부. 척추 뼈는 Drg 완전히 노출 될 때까지 꼼꼼하게 좁은 밀고 수술 rongeur를 사용 하 여 제거 합니다.
참고: 성인 Drg 신경 성인 C57BL6 남성 쥐 8 주 12 주 오래 된 사이에서 얻을 수 있습니다. - Iridectomy 위와 뾰족한 집게 해 현미경을 사용 하 여 c 1 수준까지 s 1에서 양자는 Drg를 제거 합니다. Schwann 세포 또는 섬유 아 세포의 오염을 최소화 하기 위해 Drg에서 완전히 뿌리를 잘라 하려고 합니다.
- 60 mm 페 트리 접시까지 모두는 Drg 수집 5 mL의 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 얼음에를 포함 하는 해 부 Drg를 저장 합니다.
참고: 그것은 중요 최대한 빨리는 Drg를 해 부하입니다. 한 마우스에서 모든 Drg의 컬렉션은는 안락사 후 30 분 30 분 보다 더 오래 걸릴 한다는 Drg 수집 중지 하 고 고 단계를 진행 하는 경우에 여전히 Drg 나머지는 수 없습니다. - 1.5 mL Eppendorf 관 푸른 피 펫 팁 (1000 µ L)을 사용 하 여 잘라 끝에 Drg를 전송. 미니 원심 분리기를 사용 하 여 몇 초 동안 빠른 스핀 후는 DMEM을 제거 합니다. DMEM 125 U/mL 유형 사이 콜라 포함의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 트위스터 셰이 커를 사용 하 여 부드러운 회전 (35-40 rpm) 90 분에 대 한 튜브를 품 어. 테이프를 사용 하 여 통 바닥에 튜브를 고정 하 고
- 콜라-포함 된 DMEM 버립니다 하 고 신선한 DMEM 1 mL를 추가 합니다. 부동 Drg 완전히 바닥에 가라앉 고 조직 파편과 DMEM 제거 될 때까지 기다립니다. 이 세척 단계 6 번 이상 반복 합니다.
참고:는 상쾌한을 완전히 삭제 하지 마십시오. 수 표면에 뜨는 DMEM와 어떤 Drg를 제거 하지 않도록 주의 하십시오. - 잘라 끝을 가진 파란 피 펫 팁 (1000 µ L)을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브에는 Drg를 전송. 그런 다음 아래로 부드럽게 플라스틱 적어도 15 번 블루 팁 (1000 µ L)를 사용 하 여 균질 세포 현 탁 액을 만들기 위해. 거품을 만드는 것을 방지 하 고 피 펫 팁 원뿔 튜브의 바닥을 터치 하지 않으려고.
- 239 x g 3 분에 튜브 원심 하 고 신중 하 게 떠 있는 잔해와 함께 상쾌한 삭제. Neurobasal 매체 B27 보충의 1 mL을 추가 (2.0 %v / v) 5 10 배를 위아래로 부드럽게 pipetting으로 셀 펠 릿을 resuspend 하 고.
- 세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브 위에 겹쳐 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 2 분 동안 기다립니다 그리고 Neurobasal/B-27 매체 피 펫 컨트롤러를 사용 하 여 여과기에 붓는 다.
- 모든 수집된 DRG 뉴런 (한 마우스에서 대략 2 x 106 DRG 신경 총) 6 잘 플레이트의 2 개의 우물에 접시 한 성인 마우스에서 DRG 신경 6 잘 플레이트에서 두 개의 우물을 커버. 다음 37 ° C에서 CO2 인큐베이터에 접시를 두고는 대 식 세포 공동 문화 때까지.
2. 공동 문화 P rimary 복 막 대 식 세포의 A 셀 문화 삽입에
참고: 해리 DRG 뉴런의 초기 도금 후 4 h 공동 문화 확립
- 기본 복 막 대 식 세포는 성인 C57BL6 남성 쥐 8 주 12 주 오래 된 사이에서 준비 된다. CO2 챔버에 동물 안락사 복 부 피부를 섬세 하 게 incise 하 고, 복 막 게 액체의 누설을 방지 하기 위해 복을 절단 하지 않도록.
- 펑크 22 G 바늘과 주사기를 사용 하 여 복 막 및 복 막 구멍에 얼음 처럼 차가운 인산 염 버퍼 사린 (PBS)의 10 mL를 주입. 부드럽게 마사지 1-2 분 복. 다음, 바늘을 꺼내 바늘 찔린 사이트 통해 PBS에 밖으로 짜 내 고 50 mL 원뿔 튜브에 게 액체를 수집.
참고: 사용 하기 전에 PBS의 추위를 유지 하기 위해 얼음에 주사기를 넣어. - 239 x g 작은 세포질 분 대에 4 ° C에서 10 분에 게 액체 원심 실 온에서 3 분에 대 한 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 3 mL와 펠 릿을 resuspend. 그런 다음 다시 4 ° c.에서 10 분 동안 239 x g에 세포 현 탁 액을 원심 PBS의 3 mL와 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 나머지 RBC 세포의 용 해 버퍼를 제거 하는 다시 세포 현 탁 액을 원심.
참고: RBC 세포의 용 해 버퍼 완전히 제거 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면 나머지 RBC 세포의 용 해 버퍼 배양된 세포에 독성이 있을 수 있습니다. - Neurobasal/B-27 매체의 1 mL에 수송과 셀 resuspend 플레이트 모든 수집 된 대 식 세포 (3 × 106 6 x 106 세포의 총) 세포 배양에의 절반 4.2 cm2, 해리 DRG의 우물 위에 배치의 효과적인 지역으로 삽입.
참고: 공동 문화 기간 동안 세포 Neurobasal/B-27 신경 문화 매체에서 성장 된다. 이 조건 하에서 세포의 적절 한 생존 확인 됐다.
3. Db-캠프 및 Macrophage CM의 컬렉션의 치료
참고: 시작 신경 macrophage 공동 문화 후 db 캠프 치료 4 h.
- 신경 대 식 세포 공동 문화를 100 µ M db 캠프 솔루션의 2 µ L를 추가 합니다. 제어 실험에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
- 24 시간 후 빈 잘 동일한 6 잘 플레이트에 대 식 세포 배양의 1ml 채워 놓습니다. 대 식 세포 배양 매체와 빈 잘 신경 macrophage 공동 문화에 셀 문화 삽입 전송. 매체를 변경 하지 않고 72 h에 대 한 동일한 조건 하에서 세포를 유지.
참고: 우리는 수 있도록 CM 컬렉션 중 대 식 세포 배양의 1ml만 집중 CM 추가 합니다. CM 수집 하는 동안 필요한 경우, 우리는 추가 삽입 내 대 식 세포를 표지에 더 많은 것. - 72 h 후 macrophage CM 세포 구성 요소를 제거 하려면 5 분 동안 239 x g에서 원심. 어떤 나머지 세포질 파편 든 지 제거 하는 0.2 µ m 필터에는 상쾌한 통과. 사용까지-70 ° C에서 수집 된 CM을 저장 합니다.
4. Neurite 결과 분석 결과 수집 cm
- 별도 성인 DRG 신경 문화를 설정 하기 전에 미리 1.1 및 1.2에 설명 된 동일한 절차에 따라 8-잘 챔버 슬라이드 코트.
- Neurobasal 매체 B27 보충에 천연된 성인 DRG 뉴런을 얻을 1.10 1.3에서 설명한 동일한 방법을 사용 하 여. 미리 코팅된 8 잘 챔버 슬라이드에 잘 당 5 x 104 의 세포를 플레이트.
- 셀 아래에 연결할 수 있도록 2 h 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 놓습니다. 그런 다음 37 ° c.에 preheated 해 동된 CM 문화 매체를 바꿉니다
참고: 문화 매체를 제거 하는 때 8 잘 챔버 슬라이드의 하단을 터치 하지 않도록 주의 하 고 수집 된 CM을 추가. - 초기 도금 후 15 h 매체를 제거 하 고 PBS 가진 셀을 한 번 씻어. 다음, 웰 스, 얼음 4 %paraformaldehyde 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 셀 paraformaldehyde 솔루션 4 ° C에서 20 분을 품 어
참고: neurite 결과 분석 결과 대 한 DRG 신경 문화 15 h를 정확 하 게 제한 해야 합니다. 이 조건 하에서 거기 아무 감지할 neurite 결과가입니다. - 얼음 처럼 차가운 PBS로 세 번 세척 하 고 10% 차단 수행 정상 염소 혈 청 (NGS) 0.1% 트리톤-X 30 분에 대 한 1 차적인 항 체 (안티-Tuj-1) 솔루션 10% 희석 고정된 셀을 품 어 룸에서 4 h (1 µ g/mL의 농도)에서 NGS 온도 또는 4 ° c.에서 하룻밤
- PBS로 세 번 세척 하 고 실 온에서 2 h에 대 한 2 차 항 체 (염소-안티 마우스) 솔루션 셀을 품 어. 다음, PBS로 두번 세척 하 고 장착 솔루션을 사용 하는 coverslip (24 × 50 m m)와 문화 슬라이드를 탑재.
- Neurite 결과 시각화 하는 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 가져가 라.
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결과
우리 세포 neurite 결과 활동 분자 요인 은닉 할 수 생성할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 대 식 세포 CM db 캠프로 치료 공동 문화에서 얻은 강력한 neurite 결과 별도 DRG 신경 문화 (그림 2A)에 적용 될 때 귀착되는. 비교에서는, PBS 처리 공동 문화에서 얻은 CM는 우리의 15 h 문화 기간 (그림 2B)에 neurite 결과 유도 하지 않았다. Db-캠프는 혼자 대 식 세포와 문화에 처리 됩니다, CM이이 조건에서 얻은 neurite 결과 (그림 2C) 지원에 효과가 되지 않았습니다. 이것은 신경-대 식 세포 상호 작용은 필수 proregenerative 용량으로 부여를 대 식 세포를 자극 하는 제안. 우리는 또한 CM db 캠프 치료 신경 전용 문화에서 얻은 고 아무 neurit...
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토론
이 공동 문화 시스템의 생성에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 그것은 마우스 DRG 신경 및 복 막 대 식 세포가 신선한 준비는 되었는지 확인 하는 것이 중요 하 고 건강 한입니다. 우리 모든 Drg의 해 부 했다 30 분 이상 CM의 저하 neurite 결과 활동을 경험 했다. 또한, 복 막 대 식 세포 구성 요소 혈액의 오염 또한 CM에 neurite 결과 활동의 감소에 지도 했다. Db-캠프로 강력한 신경-대 식 세포 상호 작용을 유도 하기 위해 철저 한 세척 것도 조직 파편의 완전 한 제거 및 잠재적으로 남아 있는 세포 독성의 제거를 보장 하기 위해 중요 한 단계 콜라 또는 RBC 세포의 용 해 버퍼 등의 구성 요소. 또 다른 지점을 강조 되는 Drg에 연결 된 뿌리 제거 되어야 가능한 이다. 남은 뿌리의 스텁을 DRG 신경 문화에 Schwann 세포의 오염을 증가 했다. Schwann 세포는 결과 혼동할 지도 모른 문화에 neurotrophic 요인의 높은 금액을 생성할 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 프로토콜은 NRF-2015R1A2A1A01003410 사역의 과학, 정보 통신, 미래 계획, 한국에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 삽입 투명 PET 멤브레인 0.4μ m 기공 크기 | Corning, Falcon | 353090 | 0.4-&mu의 투명 PET 멤브레인; m 기공 크기, 6웰 플레이트 |
| 70-μ m 나일론 세포 스트레이너 | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | < | ||
| 적혈구 용해 완충액 | Qiagen | 158904 | |
| Scientific, Gibco | 21103-049 | 글루타맥스 1% 및 페니실린-스트렙토마이신 | |
| B-27 보충제 1% 함유, 무혈청 | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | 세포외 용액 |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| 폴리-D-라이신 하이드로 브로마이드 | 시그마 - 알드리치 | P6407-5MG | |
| 라미닌 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| 아데노신 3 ', 5'- 고리 형 모노 포스페이트, N6 < / sup >, O2'- 디부 티릴 -, 나트륨 염 | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10 % 일반 염소 혈청 | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | 대정화학금속(주 | 8566-4405 | |
| 안티 &베타; III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | 마우스 단클론 항체 |
| 염소 안티 마우스 IgG (H+L) 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| 세포 배양 CO2 인큐베이터 | Panasonic | N/A | |
| 해부 실체 현미경 | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| 트위스트 쉐이커 | FINEPCR | Tw3t | |
| 탁상용 원심분리기 | Sorvall | N/A | |
| 컨포칼 현미경 | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS(소 태아 혈청) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST(Fine Science Tools) | 16021-14 | 스테인레스 스틸, 14cm, 곡선, 단일 관절 동작 |
| 미세 가위 - 텅스텐 카바이드 & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | 날카롭고 톱니 모양의 |
| Dumont # 7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | 직선, 3mm 절삭 날, 날카로운 |
| Qualitron DW-41 마이크로 원심 분리기 | Artisan Technology Group | DW-41 | 입력 전압 : 115VAC |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
