신경 대 식 세포 공동 문화 Neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포를 활성화 하

요약

현재 프로토콜 neurite 결과 홍보 하는 분자 요인 출시 용량 부여 배양된 세포를 자극 하는 실험 절차를 제공 합니다. 치료 신경 macrophage 공동 문화 캠프의 강한 neurite 결과 활동을가지고 바른된 매체를 생산 하는 세포를 유도 합니다.

초록

세포 재생 또는 손상 신경 복구에 참여할 수 있는 강력한 증거가 있다. 여기, 우리 세포 생산 조절 매체 (CM) neurite 결과 촉진 유도 된다 프로토콜을 설명 합니다. 성인 지 루트 신경 절 (DRG) 뉴런 심하게 해리 하 고 도금. 뉴런 안정적으로 연결 하 고, 후 복 막 대 식 세포는 잘 동일한 중첩 셀 문화 삽입에 공동 경작. Dibutyryl 순환 앰프 (db-캠프) 후 세포 배양 삽입 대 식 세포를 포함 하는 24 시간에 대 한 공동 문화에 적용 됩니다 다른 잘 CM 72 h에 대 한 수집을 이동 합니다. 별도 성인 DRG 신경 문화에 적용 될 때 db-캠프로 치료 공동 문화에서 CM 강력한 neurite 결과 활동을 전시 한다. 혼자 단일 셀 형식의 구성 된 db 캠프 대우 문화에서 얻은 CM, DRG의 신경 또는 복 막 대 식 세포, neurite 결과 활동을 전시 하지 않았다. 이 신경 세포와 세포 사이의 상호 작용은 CM에 neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포의 활성화를 위한 불가결 하지 나타냅니다. 따라서, 우리의 공동 문화 패러다임 프로 재생 형으로 부여를 대 식 세포를 자극 하 신경-대 식 세포의 상호 작용에서 세포 신호 공부 유용할 또한.

서론

다양 한 연구는 척수 또는 뇌의 부상 후 CNS 축 삭 재생을 강화 하고자 했다. 염증 성 반응, 신 경계에 상해를 필연적으로 동반 해로운 결과^1,2에 지도 하는 보조 병 적인 프로세스에 참여 하도록 전통적으로 생각 된다. 실제로, 염증 반응 억제 수 있습니다 methylprednisolone 급성 척수 부상³에 대 한 유일한 승인 된 치료입니다. 그러나, 최근 연구 제공 증거 대 식 세포, 대표적인 염증 성 세포 유형, 재생 또는 부상된 신 경계^4,,56의 수리에 참여할 수 있습니다. 예를 들어 다음과 같은 렌즈 부상 생산 프로 재생 분자 망막 신경 절 신경^7,8의 재생을 촉진 하는 대 식 세포 침투. 또한, 이식된 DRG 신경 축 삭 성장 세포 zymosan⁹에 의해 활성화 된 지역까지 증가. 또한, 병 변 사이트에서 대 식 세포는....

프로토콜

모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 아주 대학의과 대학에 의해 승인 되었다.

1. 문화 준비 해리 성인 DRG 신경의

1. 문화를 설정 하기 전에 미리 폴 리-D-리와 laminin 6 잘 플레이트 코트. 밤새 0.01% 폴 리-D-리 또는 2 h 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 6 잘 플레이트를 품 어. 다음, 증류수로 두 번 접시 세척.
2. 실 온에서 2 h 3 µ g/mL의 농도에서 laminin 솔루션 접시를 품 어 그리고 증류수와 두 번 접시를 세척. 1 시간 이상 실 온에서 접시를 건조.
3. 압축된 CO₂ 가스 실린더에 연결 된 투명 한 공동₂ 챔버에 마우스 안락사 Incise 수술 칼 날 척추 열을 overlying 피부와 척추 뼈를 양측 paravertebral 근육 해 부. 척추 뼈는 Drg 완전히 노출 될 때까지 꼼꼼하게 좁은 밀고 수술 rongeur를 사용 하 여 제거 합니다.
   참고: 성인 Drg 신경 성인 C57BL6 남성 쥐 8 주 12 주 오래 된 사이에서 얻을 수 있습니다.
4. Iridectomy 위와 뾰족한 집게 해 현미경을 사용 하 여 c 1 수준까지 s 1에서 양자는 Drg를 제거 합니다.....

결과

우리 세포 neurite 결과 활동 분자 요인 은닉 할 수 생성할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 대 식 세포 CM db 캠프로 치료 공동 문화에서 얻은 강력한 neurite 결과 별도 DRG 신경 문화 (그림 2A)에 적용 될 때 귀착되는. 비교에서는, PBS 처리 공동 문화에서 얻은 CM는 우리의 15 h 문화 기간 (그림 2B)에 neurite 결과 유도 하지 않았다. Db-캠프는 혼자 대 식 세포와 문화에 처리 됩니다, CM이이 조건에서 얻은 neurite 결과 (그림 2C) 지원에 효과가 되지 않았습니다. 이것은 신경-대 식 세포 상호 작용은 필수 proregenerative 용량으로 부여를 대 식 세포를 자극 하는 제안. 우리는 또한 CM db 캠프 치료 신경 전용 문화에서 얻은 고 아무 neurit.......

토론

이 공동 문화 시스템의 생성에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 그것은 마우스 DRG 신경 및 복 막 대 식 세포가 신선한 준비는 되었는지 확인 하는 것이 중요 하 고 건강 한입니다. 우리 모든 Drg의 해 부 했다 30 분 이상 CM의 저하 neurite 결과 활동을 경험 했다. 또한, 복 막 대 식 세포 구성 요소 혈액의 오염 또한 CM에 neurite 결과 활동의 감소에 지도 했다. Db-캠프로 강력한 신경-대 식 세포 상호 작용을 유도 하기 위해 철저 한 세척 것도 조직 파편의 완전 한 제거 및 잠재적으로 남아 있는 세포 독성의 제거를 보장 하기 위해 중요 한 단계 콜라 또는 RBC 세포의 용 해 버퍼 등의 구성 요소. 또 다른 지점을 강조 되는 Drg에 연결 된 뿌리 제거 되어야 가능한 이다. 남은 뿌리의 스텁을 DRG 신경 문화에 Schwann 세포의 오염을 증가 했다. Schwann 세포는 결과 혼동할 지도 모른 문화에 neurotrophic 요인의 높은 금액을 생성할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 삽입 투명 PET 멤브레인 0.4μ m 기공 크기	Corning, Falcon	353090	0.4-&mu의 투명 PET 멤브레인; m 기공 크기, 6웰 플레이트
70-μ m 나일론 세포 스트레이너	Corning, Falcon	352350
8-well culture slide		<
적혈구 용해 완충액	Qiagen	158904
	Scientific, Gibco	21103-049	글루타맥스 1% 및 페니실린-스트렙토마이신
B-27 보충제 1% 함유, 무혈청	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	세포외 용액
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
페니실린-스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
폴리-D-라이신 하이드로 브로마이드	시그마 - 알드리치	P6407-5MG
라미닌	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
아데노신 3 ', 5'- 고리 형 모노 포스페이트, N6 < / sup >, O2'- 디부 티릴 -, 나트륨 염	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10 % 일반 염소 혈청	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	대정화학금속(주	8566-4405
안티 &베타; III tubulin (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	마우스 단클론 항체
염소 안티 마우스 IgG (H+L) 2차 항체	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
세포 배양 CO2 인큐베이터	Panasonic	N/A
해부 실체 현미경	Carl Zeiss	Stemi DV4
트위스트 쉐이커	FINEPCR	Tw3t
탁상용 원심분리기	Sorvall	N/A
컨포칼 현미경	Olympus America Inc	IX71
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