심장 세포 외 기질 (ECM) 생활 내내 개장 하는 생리 적 지속 하는 동안 조직 및 장기에서 핵심 프로세스를 조정 하는 분자의 복잡 한 네트워크입니다. 태아 및 성인 심 혼의 표준된 decellularization는 네이티브 아키텍처 및 biomechanical 속성을 포착 하 여 3D 컨텍스트에서 두 조직의 비교 실험 연구를 허용 합니다.
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방법 논문
시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
세포 외 기질 (ECM)의 현재 정보-셀 통신 변환 큰 2 차원 (2D) 생체 외에서 문화 연구 ECM 구성 요소 표면 코팅으로 표시 됩니다. 이러한 문화 시스템 구성 조직 구조, 생 화 확 적인 구성과 기계적 특성을 포함 하는 ECM의 복잡 한 자연의 단순화. 더 나은 심장 microenvironment를 형성 하는 ECM 셀 통신 에뮬레이션, 우리 전체 태아 심장의 decellularization에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 하 고 성인 좌 심 실 조직 explants 비교 연구에 대 한 동시에. 프로토콜 전문된 기술 이나 장비에 대 한 소형 버퍼, 음이온 계면 활성 제 속성, 그리고 어떤 요구 사항 없이 DNase 처리의 세제를 사용 하 여를 결합합니다. 다양 한 나이의 과목에서 조직 샘플에서 동일한 decellularization 전략의 응용 프로그램은 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 이다. 현재 의정서 태아 및 성인 심장 ECM 메쉬 및 생물 세포 응답에 걸쳐 독특한 구조 차이 식별을 허용 한다. 또한,는 여기 방법론 성공적으로 적용 되 다른 조직 및 사소한 조정 종에와 같은 인간의 내장 biopsies을 마우스 폐에 광범위 한 응용 프로그램을 보여 줍니다.
서론
세포 외 기질 (ECM) 중요 한 세포질 과정, 즉 운명 결정, 확산 및 감 별 법1,2를 조절 하는 분자의 동적 네트워크입니다. 세포-ECM 상호 작용의 조사는 비보에네이티브 ECM 속성의 단순화 구성 2 차원 (2D) ECM 구성 요소와 코팅 생체 외 문화에서에서 주로 수행 되었습니다. Decellularization 세포 외 건축과 네이티브 조직 및 장기3,4의 크게 보존 acellular 3D 같은 ECM bioscaffolds를 생성 합니다. 조직 공학에 대 한 생리 활성 공중 발판으로 봉사 이외에 decellularized 3D ECM 생체는 그 병렬 vivo에서 환경 생물학 세포-ECM을 평가 하기 위해 새로운 플랫폼으로 등장 하고있다.
뚜렷한 조직, 기관 및 나이의 ECM 구성 요소의 차동 역할의 평가 네이티브 bioscaffolds 생성의 유사한 프로토콜의 사용으로 도움이 됩니다. 마음에 우리 기관 microenvironment의 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 방식으로 태아와 성인 파생 된 샘플의 decellularization에 대 한 다양 한 프로토콜을 개발 했습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 우리는 네이티브 심장 microenvironment를 점령 하 고 태아 ECM 심장 세포5의 더 높은 repopulation 수익률을 촉진 했다. Decellularization는 더 거주 구조와의 차이점 지하실 lamina 및 pericellular 매트릭스 메쉬 배열 수준에서 태아 및 성인 ECM 섬유 구성5식별 제공. 이 작품 전에 동일한 decellularization 접근을 사용 하 여 다른 ontogenic 단계에서 조직의 머리 비교만 붉은 털 원숭이 신장 및 설치류 마음 보고 되었습니다. 또한, 제한 된 수의 연구 보고서 태아 조직/기관 decellularization se 당5,,67. 이 독특한 decellularization 에이전트로; SDS를 사용 하 여 달성 되었습니다. 그러나, 뚜렷한 SDS 농도 태아와 성인 심장 조직7,8decellularization 위해 사용 되었다. SDS 세포질 및 핵 자료의 정리에 대 한 가장 효과적인 이온 세제 중 하나 이며 다른 조직 및 표본9,10decellularization에서 널리 이용 된다. 높은 SDS 농도 노출의 연장된 기간을 포함 하는 솔루션은 단백질 변성, glycosaminoglycan (개 그) 감소와 콜라겐 소10,11의 상관 되었다 있다 따라서는 ECM 보존 및 셀 제거 사이의 균형은 필요 합니다. 태아 및 성인 심장 조직에 동일한 절차를 적용 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 3 순차적 단계에서 나누어져: 삼투성 충격 (소형 버퍼); 세포를 세포 지질 단백질, DNA-단백질 및 단백질 단백질 상호 작용 (0.2 %SDS);의 가용 화 그리고 핵 재료 제거 (DNase 치료)입니다.
우리의 프로토콜 몇 가지 장점을 보여줍니다: 내가) 나이 특정 심장 조직의 동일한 decellularization 전략; 응용 프로그램에 의해 동등한 decellularization의 가능성 특수 방법이 나 장비에 대 한 ii) 요구 사항 iii)로 인간의 내장 biopsies12 와 마우스 폐13;에서 사소한 변경으로 성공적으로 적용 된 다른 조직 및 종 적응 준비 그리고, 중요 한 것은, iv) 더 밀접 하 게 기본 조직 microenvironment의 분자 기능을 모방 하는 3D와 같은 organotypic 문화의 어셈블리를 사용 하는 동안 ECM biomechanical 속성을 해결할 수 있습니다.
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프로토콜
I3S 동물 윤리 위원회 및 Direção Geral 드에 의해 설명 하는 모든 방법론 승인 했다 Veterinária (DGAV)와 따라 유럽 의회 지침 2010/63/유럽 연합.
1입니다. decellularization 솔루션의 준비
참고: 모든 decellularization 솔루션 0.22 μ m 멤브레인 필터를 통해 필터링 해야 하 고 제외 하 고 3 개월의 최대 저장 지정 그렇지 않으면.
- 1 x pbs: NaCl, 나2HPO4 KCl, 200 밀리 그램의 1.01 g 8 g을 혼합 및 이온된 물 (디)의 900 mL와 함께 KH2포4 의 200 밀리 그램. 1 나 필터, 압력솥, 그리고 게 실 온 (RT)에서 솔루션에 최대 해결책 pH 7.5 및 최종 솔루션 볼륨을 조정 합니다.
- 소형 버퍼 (10 mM Tris, 0.1 %EDTA)에 대 한: 1.21 g의 TrisBASE와 이온된 물 900 mL에 EDTA의 1 g을 분해. 솔루션에 pH 7.8 NaOH/HCl와를 및 1 나 필터를 최종 솔루션 볼륨 조정, 압력솥에 의해 소독 하 고 실시간 저장
- 0.2 %SDS 솔루션 (0.2 %SDS, 10 mM Tris): 디 물 400 mL에 0.6 g의 TrisBASE와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 1 g을 추가 하 고 60 ° C에서 완전 한 용 질 해산 때까지 저 어. 솔루션 실시간 조정 솔루션 pH 7.8 하 고 최종 솔루션 볼륨 500 mL을 진정 하자. 여과 하 여 솔루션을 소독.
참고: SDS 솔루션 사용 하기 전에 준비 되어야 한다. 필터 솔루션만 후 SDS 해산 완료, 그렇지 않으면 SDS 불용 성 입자 필터, 최종 SDS 농도 변경 하 고 따라서 조직 decellularization 효율성에 영향을 미치는 포화 됩니다. - 침투성 워시 버퍼 (10 mM Tris): 믹스 디 900 mL에 TrisBASE의 1.21 g 물. 솔루션에 pH 7.8 및 1 나 필터를 최종 볼륨 조정, 오토 클레이 브에서 소독 하 고 실시간 저장
- DNase 치료 (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): 2.42 g TrisBASE의와 디 물 900 mL에 1 M MgCl2 의 2 개 mL를 분해. 7.8 pH와 최종 솔루션 볼륨 1 나 필터를 조정 하 고 압력솥에 의해 솔루션을 소독. 실시간 추가 DNase에서 솔루션을 저장 나 (50 U/mL)을 사용 하기 전에.
- DNase 대 나 재고 솔루션: 50% 글리세롤, 20 mM Tris HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2를 포함 하는 DNase 버퍼를 준비 하 고 디 물 10 mL의 최종 솔루션 볼륨 조정. 층 류 두건에서 DNase 버퍼에 파우더와 섞어 부드럽게 완전 한 해체까지 DNase를 추가 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 소독. 1 mL aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장
2. 조직의 채취 및 cryopreservation
- CO2 질을 통해 임신 (E18 태아)의 18 일 성인 임신 여성을 안락사. 수술 시저와 함께 여성에 제왕 섹션을 수행 하 고 곡선된 팁 (경적 양끝을 한 트위터)와 두 개의 톱니 모양의 핀셋을 사용 하 여 차가운 1 x PBS와 페 트리 접시에 태아 쥐 베어링 자 궁 뿔을 수집 합니다.
- 자 궁 뿔 및 분리는 태아를 양수 sac를 엽니다. 그들을 anesthetize 하는 시저와 함께 목을 벨 얼음 1 x PBS 가진 새로운 배양 접시에는 태아를 전송.
- 7-8 주 오래 된 남성 C57BL/6 마우스 사용 하 여 CO2 질 안락사 각 마우스 가슴에 절 개를 수행 하 고 마음을 수집 합니다.
- 짧게 씻어 얼음 감기 1 x PBS 가진 태아 및 성인 마음.
- 메스의 도움으로 성인 심장의 심 방 제거 합니다. 우 심 실에 절 개를 수행 하 고 바로 작은 위를 사용 하 여 그것을 제거. 심장 제거 하 여 좌 심 실 내부 벽을 노출 합니다. 새로운 페 트리 접시에 2 m m 두께와 좌 심 실 무료-벽에 경도 스트립을 분할 하 고 젖꼭지 근육 곡선 팁 메스와 톱니 모양의 핀셋을 사용 하 여 제거.
- 소비 세 작은 조직 explants 2mm x 2mm 눈금 (자세한 설명 보충 그림 15에)를 사용 하 여 메스의 도움으로. 간단히 1 x PBS 가진 조직 explants 린스.
- 압력가 1.5 mL microcentrifuge 튜브 복합 최적의 절삭 온도 (10 월)의 ~ 250 µ L를 추가 합니다. 10 월의 250 µ L 튜브를 전체 태아 심 혼 그리고 성인 심장 explants 전송 및 드라이 아이스 냉각 isopentane 그리고-80 ° C (최대 6 개월)에 게 그들을 동결.
참고: 심장 조직 explants 6 개월 이상 cryopreserved를 사용 하 여 decellularization 효율성, 특히 성인 심장 조직 explants 줄일 것 이다.
3. 조직 decellularization
참고: 심장 조직 decellularization 잘 당 하나의 샘플 24-잘 조직 배양 접시에서 수행 됩니다. 각 decellularization 솔루션의 1 mL는 잘 각 개인에 추가 됩니다. 그렇지 않으면 지정 하지 않으면 모든 decellularization 단계 165 rpm (20 m m의 궤도 직경 인큐베이터 통)와 25 ° C에서 동요와 함께 수행 되어야 한다. 자세한 내용은 그림 1A에 구성표를 참조 하십시오. 암포 B (예: fungizone) 및 gentamicin은 갓에 추가 2.5 μ g/mL, 0.01 μ g/mL의 최종 농도를 사용 하기 전에 모든 decellularization 솔루션 각각. Decellularized 조직, decellularization 프로토콜을 시작 하기 전에 결정 될 샘플 대량 요구 내에서 유지 하는 DNA의 양을 계량 하. DNA 정량화 프로토콜 추가에 대 한 자세한 섹션 5.1입니다.
-
제 1 일
- -80 ° C 냉장고에서 조직 샘플을 제거 합니다. 유지 1.5 mL 튜브 microcentrifuge RT 10 월 되 면 부분적으로 녹을 때까지 합니다. 1 x PBS와 페 트리 접시에 여전히 냉동의 심장 조직 블록을 전송 합니다.
- OCT 녹아 심장 조직 1 x PBS 가진 새로운 배양 접시에 이동. 워시 샘플 60 rpm 10-15 분에 대 한 셰이 커와에서 PBS x 1에 두 번 이상 반복합니다.
- 살 균 24-잘 조직 배양 플레이트의 당 소형 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 집게의 도움으로 잘 당 하나의 샘플을 전송 합니다.
- 25 ° C에서 인큐베이터 셰이 커를 예제와 함께 24-잘 조직 배양 플레이트를 이동 하 고 소형 버퍼 18 h 부 화를 시작.
-
제 2 일
- 1.3 섹션에 설명 된 대로 0.2 %SDS 솔루션을 준비 합니다.
- 소형 버퍼를 발음 하 고 1 x PBS와 샘플 1 h. 반복 3 번 세척.
참고: 일시 중지 포인트: decellularization에서 조직 18 h 정적 조건에서 4 ° C에서 1 x PBS에 보관 하실 수 있습니다. - 1 x PBS를 제거, 잘 당 갓 만든된 SDS 솔루션 (1.3 단계)의 1 mL을 추가 하 고 24 시간에 대 한 샘플을 품 어.
참고: (체크 포인트) 게시물 SDS 인큐베이션 샘플 반투명 외관 백색 전시를 확인. 이 단계에서 SDS 처리 샘플 젤라틴 모양의 일관성을 보여주는 DNA에 젖어 있다. 피 펫 팁을 샘플 접착 하지 않으려면 천천히 SDS 솔루션을 제거 합니다.
-
제 3 일
- 20 분 반복 3 번 소형 워시 버퍼 (우물 당 1 mL) 샘플을 씻으십시오.
참고:이 단계에서 그것은 정상 세포 잔재의 제거로 인해 샘플 크기 감소를 관찰 하는 것. 일시 중지 포인트: 조직 decellularization에서 보관할 수 있습니다 소형 워시 버퍼에 18 h 정적 조건에서 4 ° C에서. - 잘 당 DNase 치료 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 품 어
- DNase 치료 솔루션을 발음 하 고 20 분 반복 3 번에 대 한 샘플 1 x PBS (우물 당 1 mL)을 씻어. RT와 60 rpm에서 떨고 하룻밤 1 x PBS (우물 당 1 mL)으로 최종 세척을 수행 합니다.
- (체크 포인트) DNase 치료 후 decellularized 샘플 젤라틴 모양의 일관성을 잃 었 확인 합니다.
참고: DNase 치료 후 제거 하 고 추가 1 x PBS 부드럽게 샘플을 쉽게 침투 하 고 피 펫 팁에 연결 된 수 있습니다.
- 20 분 반복 3 번 소형 워시 버퍼 (우물 당 1 mL) 샘플을 씻으십시오.
4입니다. decellularized 조직 세포 제거의 평가
- 실시간에 2.5-3 h에 대 한 0.03% 수성 오신와 갓 만든된 10% 포 르 말린 중립 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 24-잘 조직 문화 접시, 잘, 당 1 샘플에에서는 샘플 수정
참고: 오신 decellularized 조직 얼룩을 단면화 및 조직학 얼룩 동안 샘플 시각화를 쉽게 정착 액에 추가 됩니다. 어느 방해 조직학 얼룩도 면역 형광 검사 기술로 오신의 추가. 또는, 고정에서 수행할 수 있습니다 하룻밤 4 ° c. - 통 솔루션을 제거 하 고 씻어 샘플 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 일회용 비닐 견본 몰드를 사용 하 여 조직학 처리 젤에 고정 된 bioscaffolds를 캡슐화 합니다.
- 뚜껑 생 처리/포함 카세트 형 및 전송에서 포함 된 샘플 조직학 젤을 제거 합니다.
참고: 조직 조직학에서 포함 및 젤 처리 대신 작은 구멍으로 두 생 스폰지에 각 샘플을 처리 하는. 샘플 검색 사용 하려면 생 스폰지의 중심을 지역화 해야 합니다. 메모의 일부 샘플이이 접근을 사용 하 여 지역화 하려면 어려울 수 있습니다. - Isoparaffinic 지방 족 탄화수소 솔루션 (2 화 역) (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), 알코올 농도의 시리즈에 연속 외피 솔루션 마다 (30 분)를 통해 포함 하는 파라핀 파라핀 (2 부 화에 대 한 샘플 처리 56 ° c.에 역)
- 파라핀 블록에 샘플을 탑재 합니다.
- 톰에 3 μ m 두께 파라핀 섹션을 잘라 고 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 수집 합니다.
- 건조 파라핀 섹션 37 ° c.에서 하룻밤
참고: (일시 중지 포인트) 파라핀 섹션 추가 사용 때까지 4 ° C에 저장 됩니다. - 프로토콜의 효율성을 확인 하려면 Hematoxilin 및 오신 (H & E) 및 decellularized 샘플 섹션 및 섹션 제조업체의 지침에 따라 조직의 비 조작 (MT) 얼룩 Masson의 Trichrome 수행 합니다.
참고: h 조 & 전자 얼룩 얼룩 세포 핵 파란색/보라색, 세포질 진한 핑크/레드 고 콜라겐 창백한 핑크와 MT 얼룩 핵 검은색, 빨간색, 세포질 및 콜라겐과 mucin 블루. 효율적인 decellularization 때 다공성 빛 핑크 (H & E, 몬태나) 달성 하 고 블루 (MT) 네트워크는 핵 얼룩의 부재에서 관찰.
5. decellularized 조직 핵 재료 제거의 평가
참고: decellularized 조직에서 DNA 콘텐츠의 정량화는 각각 조작 되지 않은 조직에 비해 수행 되어야 합니다.
- Decellularization, 전에 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 고정밀 디지털 규모에 무게. 튜브를 심장 조직 전송, 1 x PBS의 추가 금액을 제거 하 고 무게는 샘플 튜브. 샘플의 젖은 무게를 계산.
젖은 무게 샘플 무게 샘플 튜브 -무게 빈 관 = - 3 단계에에서 설명 된 대로 샘플을 decellularize.
- 후에 decellularization, decellularized 조직 microcentrifuge 튜브에 수집 합니다.
- 작은 크기와 개별 심장 샘플 및 키트 사양의 질량, 수영장의 각 샘플 상태 decellularized 조직 (태아 심장: 5 전체 마음; 성인 LV explants: 15 explants). 조작 아닌 조직으로 동일한 절차를 수행 합니다.
참고: (일시 중지 포인트) 샘플 수 DNA 추출 및 정량화는 수행 될 때까지-20 ° C에 저장.
- 작은 크기와 개별 심장 샘플 및 키트 사양의 질량, 수영장의 각 샘플 상태 decellularized 조직 (태아 심장: 5 전체 마음; 성인 LV explants: 15 explants). 조작 아닌 조직으로 동일한 절차를 수행 합니다.
- 비 조작 잘라내어 깨끗 한 페 트리 접시에 메스의 도움으로 작은 explants에서 조직 decellularized.
참고: 각 샘플에 대 한 개별 메스와 페 트리 접시를 사용 합니다. 메스와 샘플의 기계적 장애 그들의 후부 효소 소화 및 후속 DNA 추출 용이. - DNA 추출에 대 한 제조업체의 지침에 따라 스핀-열 기반 DNA 추출 메서드를 사용 합니다.
- 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 마스터 소화 버퍼 (소화 버퍼 및 가수분해 K) 페 트리 접시에서 기계적으로 천연된 샘플을 수집 합니다.
참고: 조직 세포 성분을 K 소화는 빨리 decellularized 샘플 에입니다. 동시에 다른 샘플을 처리, 모든 샘플은 성능 저하를 최소화 하기 위해 lysed 때까지 얼음에 lysed 샘플을 유지 합니다. 완전 한 샘플 세포 4-6 h 사이 이루어집니다. - 제조업체 지침에 따라 프로토콜 진행.
- Decellularized 및 decellularized 비 조직 샘플의 추출 된 DNA의 수율을 높이기 위해 25-50 μ 및 차입 버퍼의 100 μ에 DNA를 각각 elute. Eluted DNA를 수집 하 고 스핀 열 로드. 실시간 원심 분리기에서 1 분에 대 한 제조업체의 지침에 따라 샘플을 품 어.
참고: (일시 중지 포인트)는 DNA 샘플에서 추출 된 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
- 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 마스터 소화 버퍼 (소화 버퍼 및 가수분해 K) 페 트리 접시에서 기계적으로 천연된 샘플을 수집 합니다.
- 형광 성 dsDNA 탐지 키트 제조업체의 지침에 따라 샘플에서 추출 된 DNA를 계량.
- (Decellularization) 전에 초기 샘플 젖은 무게의 밀리 그램 당 nanograms의 DNA로 DNA 콘텐츠를 정상화.
6. decellularized 건설 기계 셀 시드
참고: 모든 솔루션/시 약 수 살 균 하 고 메 마른 조건에서 수행 하는 전체 절차.
- 암포 B와 1%의 2.5 μ g/mL로 1 x DPBS 준비 P/S (페니실린, 100 I.U.; 스 100 µ g/mL).
- 마지막 decellularization 세척 단계 (단계 3.3.3)에서 PBS 솔루션 x 1을 제거 하 고 암포 B/1% P/S 솔루션의 DPBS/2.5 μ g/mL x 갓된 1의 당 500 μ를 추가 합니다. 1-7 일에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
참고: 4 ° C에서 샘플 저장소는 불 임을 유지 해야 합니다. - P/S (FBS 보충 없이) 기저 미디어 1%의 최종 농도를 셀에 추가 합니다.
- Decellularized 샘플에서 암포 B/1% P/S 솔루션의 DPBS/2.5 μ g/mL x 1 발음 세포 기저 media/1% P/S의 당 500 μ를 추가 하 고 1 시간 또는 1 시간 이상 4 ° C에서 37 ° C에서 equilibrate 샘플을 보자.
- 관심의 셀 분할 및 원하는 셀 밀도에 셀의 작은 aliquots를 준비.
참고: decellularized 조직 시드 수행 되어야 합니다 입체 현미경 및 메 마른 조건에서. 세포 배양 1%를 포함 한다 P/s. - 3-4 μ DPBS 96 잘 접시의 우물의 센터의 플라스틱 얇고 직선 핀셋을 사용 하 여, decellularized 건설 기계 DPBS 드롭 전송, 포부, 여분의 DPBS 제거 및 샘플 접히거나 주름이 되지 있는지 확인. 그것은 잘 표면에 가장자리에 건조 될 하자.
참고: 분리 된 건설 기계 낮은 시드 효율이 있다. - 천천히 잘의 가장자리에 대 한 단일 셀 솔루션 pipetting으로 발판에 셀을 추가 합니다.
참고: 예를 들어 신생아 쥐 cardiomyocytes는 시드와 7500 셀/m m2 와 불멸 하 게 마우스의 밀도 60-1500 셀/m m2의 조밀도에 린− Sca-1+ 심장 조상 세포 (iCPCSca 1). 실험적 근거를 따라 셀 밀도 조정 합니다. - 빠른 미디어 증발을 피하기 위해 이웃 우물에 DPBS를 추가 합니다.
- 24 시간 사용 하는 셀 형식을 새로운 잘 bioscaffolds 옮겨 조직 문화 폴리스 티 렌 플레이트 (TCPS)을 셀 시드, 게시할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 비 부착 한 세포를 제거 하는 매체를 교체 합니다.
- 세포 종류의 특정 요구에 따라 미디어를 신중 하 게 변경 합니다.
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결과
세 가지 주요 기술을 통해 decellularization 효율성을 평가 합니다: 거시적인 관찰, 조직학 및 DNA 정량화. 샘플 게시물 SDS 처리의 거시적인 모양 세포 제거의 효능 직접적으로 영향을. SDS 인큐베이션, 샘플에 약간 (그림 1C) 흰 반투명으로 표시 됩니다. 태아 (E18) 성인 explants는 반투명 흰색 외관을 하는 동안 decellularized 조직 높은 반투명 구조 특징 이다. 하얀 외관 ECM 네트워크 높은 섬유와 콜라겐 콘텐츠, 예를 들면 성인 심 실 및 혈관 혈관 ECM 메쉬 전시 (그림 1C)에 일반적으로 상관 된다. 되며 & 오신 (H & E) 또는 Masson의 Trichrome (MT) 얼룩 다공성 메쉬 (밝은 분홍색, H & E; 빛 핑크와 블루, MT)의 관찰에 의해 효율적인 세포 ...
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토론
세포 외 기질 (ECM) 수많은 생리 활성 펩 티 드 및 성장 요인 내포의 저수지로 구성 된 섬유와 접착제 glycoproteins의 매우 역동적이 고 복잡 한 채널 이다. 세포 접착, 골격 역학, 운동 성/마이그레이션, 확산, 감 별 법, apoptosis의 주요 변조기로 ECM 적극적으로 세포 기능 및 행동을 통제 한다. 세포질 행동 2D와 3D 문화에서 차이가 알면, 있었다 정확 하 게 자연 조직 환경을 복제할 수 소설 organotypic 모델을 개발 하는 노력. 마지막 년에서 조직 decellularization 조직 공학 및 재생 의학에 대 한 대체 방법으로 떠오르고 있다. 따라서, 조직 및 기관 decellularization은 현재 더 나은 조직 관련 microenvironmental 매개 변수 (생화학, 구조 및 기계)을 해 부를 선택의 도구와 생물 학적 활동 생체 외에서 그리고 vivo에서.
우리는 음이온 계면 활성 제 속성 DNase 치료
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 관련 중요 한 토론에 대 한 핀 토-마-Ó 연구소의 모든 구성원에 게 빚을. 이 작품 프로젝트 "CARDIOSTEM 설계 심장 조직 및 심장 혈관 응용 프로그램에 대 한 줄기 세포 기반 요법" 아래 프로그램이 MIT Fundação 파라 과학 전자 기술 (FCT)에 의해 지원 되었다 (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. [SFRH/BD/88780/2012] FCT 화목의 받는 사람 이며 M.J.O.은 FCT 동료 (FCT 탐정 2012).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shaker | IKA:3510001 | 추천된 |
| 형광측정기 | - | - | 사용 가능한 장비 |
| 디지털 체중계 | - | - | 사용 가능한 장비 |
| 도립 현미경 | - | - | 사용 가능한 장비 |
| 세포 배양 인큐베이터 | - | - | 사용 가능한 장비 |
| 냉장고(4º C) | - | - | 사용 가능한 장비 |
| 급속 냉동고 (-80°C; C) | - | -사용 가능한 장비 | |
| Microtome | - | - | 사용 가능한 장비 |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11272-30 | 추천 |
| 해부 가위, 직선 | - | - | 도구 사용 가능한 |
| 펜치, 톱니, 곡선 | - | - | 도구 사용 가능 |
| Materials | |||
| 24 웰 플레이트, 개별 포장 | VWR | 29442-044 | - |
| 96 웰 플레이트, 개별 포장 | VWR | 71000-078-Steriflip-GV | |
| , 0.22µ m, PVDF, 방사선 멸균 | Millipore | ||
| SE1M179M6-Eppendorff | - | -사용 가능한 재료 | |
| 15 mL Falcon 튜브 | Fisher Scientific | 430791-50 | |
| mL Falcon 튜브 | Fisher Scientific | ||
| 430829-4-Compartment 생검 처리/임베딩 카세트(뚜껑 포함 | 전자 현미경 과학 | 70075-B | - |
| Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | - |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | ||
| 6769006-2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L-Dry | |
| ice | - | - | |
| -Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364-Na | |
| 2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264-KH | |
| 2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g-KCl | |
| 시그마-알드리치 | P8041-1KG-TrisBASE | ||
| 시그마-알드리치 | T6066-500G | - | |
| 나트륨 도데실 설페이 | 트 시그마-알드리치 | L-4390-MgCl | |
| 2 | MERCK | 1.05833.1000-DNAse | |
| I | AplliChem | A3778,0050 | - |
| 겐타마이신 | Gibco | 15710-049 | - |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026-Deionized | |
| water (DI water) | - | - | |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P-Eosin | |
| Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | 알코올성 에오신 |
| Richard-Allan Scientific HistoGel로 대체 가능 검체 처리 젤 | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | - |
| 에탄올 에틸릭 알코올 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | - |
| 탈이온수(DI water) | - | - | |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915-Shandon | |
| Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | - |
| Kits | |||
| PureLink 게놈 DNA 미니 키트 | Thermo Fisher Scientific | ||
| K182001-Quant-iT PicoGreen dsDNA 키트 | Invitrogen | P11496 | - |
| 세포 배양 | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | - |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 100X | Labclinics | L0022-100-Fungizone | |
| Gibco BRL | 15290-026 | - | |
| 관심 세포의 세포 배양 배지- | - | - |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 4/23/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. The affiliations were updated.
The fourth affiliation was corrected from:
Gladstone Institutes, University of California San Francisco
to:
Gladstone Institute of Cardiovascular Disease
An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:
University of California San Francisco
