방법 논문

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

DOI:

10.3791/56932

⸱

2018년 5월 6일

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

초록

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종양 microenvironment 내 거주 또는 모집 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 여러 암 종류에 악성 진행에 기여 한다. 특정 환경 신호 영향이 성인 줄기 세포 paracrine 중재자 가속된 종양 성장 및 전이 해제할 수 있습니다. 종양 및 MSCs 사이 누화를 정의 암 진행을 기본 메커니즘을 이해 하 고 치료 적 개입에 대 한 새로운 목표를 식별 하려면 기본 중요성 이다.

암 세포 생성 높은 양의 extracellular 소포 (EVs), 뿌리깊은 대상 세포 종양 microenvironment에 또는 먼 사이트에서의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 종양 EVs 염증 성 RNAs 등 (onco) 단백질, 암 세포의 전이 행동을 강화 하거나 미리 전이성 틈새 시장 형성에 참여 stromal 세포 교육 수 기능 생체를 묶습니다. 이 문서에서는, 우리는 EV 중재 누화 종양 사이의 중간 엽 줄기 세포의 특정 평가 가능 하 게 하는 전 임상 암 마우스 모델의 개발을 설명 합니다. 첫째, 우리는 정화 및 종양 분 비 EVs의 특성화 및 MSCs에서 EV 국제화 평가 설명합니다. 우리 다음 게 암 EVs에 의해 유도 된 다중 구슬 기반 immunoassay MSC cytokine 식 프로필 변경을 평가 하의 사용. 마지막으로, 우리이 종양-msc와 상호 작용 하는 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 기여를 표시.

우리의 모델 암 EVs 종양 지원 환경 형성 하는 방법을 정의 하 고 종양 및 MSCs 간의 EV 중재 통신의 봉쇄 암 진행을 방지 하는 여부를 평가 기회를 제공 한다.

서론

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종양 microenvironment tumorigenesis 및 암 진행, 전이 형성 등의 치료제1저항 개발의 대부분, 그렇지 않으면 모두, 측면에서 적극적으로 참여 합니다. 이 종양 틈새에서 발생 하는 복잡 한 종양-기질 상호 작용의 해 부를 수 있는 전 임상 orthotopic 암 마우스 모델에 대 한 필요성을 강조 하고있다.

종양 microenvironment의 많은 세포 구성 성분 중에서 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 강하게 유방암, 전립선 암, 뇌종양, 다 발성 골 수 종, 및 다리2 등 여러 암 종류의 암 진행에 기여 ,3,,45,,67. MSCs는8,9골 수, 지방 조직, 태 반, 탯 줄 혈액, 등을 포함 하 여 다양 한 성인 그리고 태아 조직에 있는 multipotent 줄기 세포 이다. 염증 신호 암 생성에 대 한 응답, MSCs 종양 사이트 쪽으로 마이그레이션할 종양 microenvironment에 통합 고 궁극적으로 암 지원 셀10으로 차별화 합니다. 이러한 암 관련 된 MSCs 종양 진행 행동 종양 세포에 및 주변 기질2, 에 대 한 필수적인 요인 (즉, 성장 요인, 발산, cytokines, 면역 중재자) 제공 3 , 11 , 12 , 13. 동안 종양 증진 효과 암 관련 된 MSCs의 수많은 암 모델에서 조사 되어, 종양 세포는 암 홍보 틈새를 형성 하는 MSCs 재 설 정할 메커니즘 제대로 이해 하는. 여기는 orthotopic이 종이 식 모델을 구체적으로 extracellular 소포 (EVs) 통해 뼈 암 세포와 MSCs의 프로 tumorigenic 상호작용 연구의 생성에 설명 합니다.

EVs는 종양과 stromal 세포14사이 세포 커뮤니케이션의 중요 한 중개자. EVs의 원산지, 단백질, 지질, 및 규제 RNAs를 포함 하 여 세포의 기능 생체 나. 일단 세포 외 공간에서 발표,이 소포 주변 세포에 의해 채택 될 수 있다 또는 혈액 이나 림프 순환 통해 먼 사이트에 고 뿌리깊은 대상 셀 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 15 , 16 , 17 예를 들어, stromal 섬유 아 세포에 의해 암 EVs의 신생을 지원 하 고 종양 성장 을 vivo에서18,19, 내 피에 의해 국제화 가속 myofibroblast 차별화에 발생할 수 있습니다. 셀 수 있는 종양 혈관 신생을 자극 하 고 증가 혈관 침투성16,20, 그리고 면역 세포와의 상호 작용21antitumor 면역 반응 억제로 이어질 수도 있습니다.

우리는 최근 시연, 종양 세포 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형 얻으려고 MSCs 프롬프트 EVs의 높은 금액을 출시, 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델을 사용 하 여. 이 효과 MSC cytokine 식 프로 파일 ("MSC 교육" 라고도 함)에 있는 극적인 변화 때문 이며 치료 인터 루 킨-6 수용 체 (IL-6R) 항 체7의 행정에 의해 방지 될 수 있다. 우리의 일 암 EVs 다리 진행 중단 microenvironment 대상 접근에 대 한 근거를 제공 하는 MSC 행동의 중요 한 변조기는 설명 했다. 여기, 우리는 EV 중재 종양-MSC 상호 작용에서 vivo에서조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 모델을 것입니다: 1) 특히 종양 microenvironment 암 EV 유도 변경 MSC 행동의 정의 2) 어떻게이 상호 작용에 기여 뼈 종양 성장 및 전이 형성, 그리고 연구 3) 방해 하는 여부를 평가 vivo에서 EV 중재 누화 암 진행을 방지합니다.

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프로토콜

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중간 엽 줄기 세포 분리에 대 한 인간의 지방 조직 기관 윤리 위원회에 의해 승인 후 Tergooi 병원 (쉼, 네덜란드)의 성형 수술의 부서에서 얻은 고 서 면 통지 해준 동의. GFP-긍정적인 많은 MSCs는 어린이 성인 (모 데 나 대학와 레지오 에밀리 아)에 대 한 부의 의료 및 외과 과학에서 얻은 했다.

동물 실험, 동물 실험에 네덜란드 법률에 따라 수행 하 고 프로토콜 VU 대학 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드의 동물 실험에 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 세포 외 소포 종양 분 비의 격리.

  1. FBS 70000 x g 하룻밤 사이에 (16 시간), 초 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에서 아무 브레이크 centrifuging EV 고갈 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 준비 (기대 감속에 대 한 1 시간). 신중 하 게는 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 (EV 고갈 FBS)를 수집 합니다. 0.22 μ m 필터 EV 고갈 FBS를 필터링 합니다.
  2. Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 2mm 글루타민을 보완 하 여 EV 고갈 문화 매체를 준비 (1 x P/S/G) 및 5% FBS EV 고갈.
  3. 175 cm2 플라스 크에 3 x 106 143B 셀 씨 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 EV 고갈 문화 매체에 문화. 셀 (일반적으로 48 h 36 h) 후 80-90% 합칠 때, EV 격리는 상쾌한 8 x 175 cm2 플라스 크 (28 mL/플라스 크)에서 수집 합니다.
  4. 미리 다음 프로토콜에 따라 차등 원심 (말합니다 때마다 상쾌한 centrifuging)에 의해 세포 및 세포 잔해를 제거 하려면 셀 상쾌한 취소:
    1. 10 분 동안 500 x g에서 두번 상쾌한 원심
    2. 2000 x g 15 분에 두 번 상쾌한 원심
    3. 10000 x g 30 분에 두 번 상쾌한 원심
    4. 최대 가속 및 감속 속도 설정으로 4 ° C에서 모든 centrifugations를 수행 합니다. 각 단계 후 신중 하 게 포함 하는 EV 상쾌한, 약 1 mL를 남겨두고 수집 합니다. 1.5 또는 상점을 사전 허가 조건-80 ° C에서 매체 EV 절연까지 바로 진행 합니다.
  5. 사전 허가 조건된 매체 한번 70000 x g 1 h에서 centrifuging 여 EVs를 격리, 천천히 브레이크, 울트라 진동 물통 회전자를 사용 하 여 울트라 원심 분리기 튜브 (최종 볼륨 38.5 mL/튜브)에 4 ° C에서.
  6. 신중 하 게 나머지 볼륨에 뒤에, resuspend 약 1 mL EV 포함 된 펠 릿을 떠나 상쾌한 제거, 1 개의 ultracentrifuge 관에 모두 수영장 및 완벽 한 튜브 작성까지 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 추가 (최종 볼륨 38.5 mL).
  7. 브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 다시 한번 원심 분리기 (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 100-200 µ L을 남겨두고.
  8. Resuspend EV-펠 릿을 PBS (모든 EV-격리에 대 한 표준화)와 200 µ L 최종 볼륨을 조정 합니다. 즉시 EV 준비를 사용 하거나 사용22까지-80 ° C에 저장 합니다.
    참고: EVs 저장 될 수 있다-80 ° c.에 6 개월

2. EV의 특성화

순화 EVs는 전송 전자 현미경 (TEM)23에 의해 구상 될 수 있다.

  1. 인산 염 버퍼에서 4 %paraformaldehyde 동등한 양으로 혼합 EV preps.
  2. 코트 200 EV 정지 실 온에서 20 분의 5 µ L로 니켈 가장 격자 Formvar 카본 코팅 메쉬.
  3. 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.0), uranyl oxalate (pH 7.0) 대비 1%도 함께 가장 격자에 EV 샘플 흥분 하 고 4 %uranyl 아세테이트 및 2% 메 틸 셀 룰 로스 얼음에 1:9 비율에서의 혼합물에 포함.
  4. 스테인레스 스틸 루프와 격자를 제거 하 고 필터 종이 메 틸 셀 룰 로스 필름의 적절 한 두께 보장 하기 위해 초과 하는 액체를 되 리.
  5. 건조 후, 그리드 전송 전자 현미경으로 검사 하 고 해당 이미지를 소프트웨어를 결합 하 여 디지털 카메라 캡처 이미지.

3. 종양에서 파생 된 EVs에 의해 MSCs의 교육.

  1. 4 %EV 고갈 인간 혈소판 Lysate (hPL)24, 헤 파 린 (10 U/mL)와 1 알파-최소 필수 매체 (알파-MEM)을 보완 하 여 MSC 문화 매체를 준비 P/S/G. x
    참고: EV 고갈 hPL 1.1 섹션에 설명 된 절차에 따라 얻을 수 있다.
  2. 시드 1.4 x 106 75 cm2 플라스 크 당 MSCs 지방이 많은 파생 하 고 37 ° C에서 5 %CO2 인큐베이터에서 EV 고갈 MSC 문화 매체에 문화.
  3. 때 셀 70% 합류에 도달, 추가 143B 다리-또는 인간의 섬유 아 세포 (hf) 제어-EVs, 10 µ L EV 준비/cm2 문화 플라스 크의. 24 시간 동안 incubate 고 추가 6 시간에 대 한 EVs의 동일한 금액을 추가 합니다. 참고: 인간의 섬유 아 세포에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 교양 10 %FBS EVs 섹션 1에서에서 설명한 대로 격리 됩니다.
  4. MSC 상쾌한 수집, 1 x 4 ° C (최대 가속 및 감속 속도 설정)에서 5 분 동안 500 x g에서 원심, 새로운 튜브에 전송 및 저장 미래의 cytokine 분석 (섹션 5)을-80 ° C에서 지운된 상쾌한.
  5. 비보에 대 한 실험 (단원 6), 섹션 3.1을 3.3에에서 설명 된 대로 GFP-긍정적인 MSCs25 교육, 수집 셀 하 고 주입까지 얼음에 100 µ L. 계속 셀 당 106 셀의 최종 농도에 PBS에 그들을 resuspend.

4. EV 국제화의 시험

MSCs에서 EV 글귀를 시각화 하려면 제조 업체의 프로토콜에 따라 녹색 형광 링커 염료 (GFLD) (상용)와 EVs 레이블:

  1. 간단히, 200 µ L EV 준비에 희석제의 180 µ L를 추가 합니다. 희석제의 50 µ L에서 GFLD 염료의 1 µ L를 희석 하 고 추가 20 µ L 희석된 염료의 희석된 EV 준비.
  2. 부드럽게 pipetting으로 혼합 하 고 어둠 속에서 실 온에서 3 분 동안 품 어.
  3. PBS에서 0.1 %BSA 5 mL을 추가 하 고 울트라-원심 분리기 관에 전송 PBS (최종 볼륨 38.5 mL/튜브) 튜브를 채울.
  4. 원심 브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 1 x (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 200 µ L의 최종 볼륨에서 레이블이 EV-펠 릿 resuspend (PBS 가진 볼륨 조절).
  5. MSC 문화를 레이블이 EVs를 추가 하거나-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 야간 보육, 후 형광 현미경 검사 법에 의해 소포 국제화를 평가 하 고 flow cytometry7.

5입니다. MSC Cytokine 식 프로필의 평가입니다.

  1. 인터 루 킨-8 (IL-8)의 다중 정량화, 인터 루 킨-1β (IL 1β), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 인터 루 킨-10 (IL-10), 종양 괴 사 인자 (TNF) 및 MSC에서 인터 루 킨-12 p 70 (IL-12 p 70) 단백질 수준 조절 매체 (단계 3.4 참조) 사용 하는 상업적으로 사용할 수 있는 cytometric 구슬 배열 (CBA) 제조업체의 지침에 따라 인간의 염증 성 cytokines에 대 한.
  2. 간단히, 항 체 활용 된 캡처 구슬 혼합을 모든 분석 결과 튜브를 추가 합니다. Cytokine 표준 희석 또는 조건된 중간 샘플 튜브를 추가 합니다.
  3. 검출 시 약을 추가 하 고 실시간에 3 시간을 품 어
  4. 워시 제공 된 세척 솔루션 비즈. 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 측정 하 고 제조업체의 지침에 따라 데이터를 분석.

6. 다리의이 종이 식 Orthotopic 마우스 모델의 세대.

  1. 6 주 오래 된, 여성, Athymic 누드-Foxn1nu 쥐 실험 절차를 시작 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 순응을 허용 합니다.
  2. 1 일 peri 요원으로 수술 전과 진통 식용 수에 해 열을 추가 합니다. "아이 들을 위한 해 열 솔루션" 희석 ( 재료의 표참조) 2 mg/mL의 최종 농도를 물으로. 150 mL/kg의 평균 물 섭취 량에 따라/일, 20 g의 평균 몸 무게,이 복용량은 6 밀리 그램의 복용량에 도달 / 마우스 충분 한 일 (300 m g/k g/일).
  3. 수술 후, 또는 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 더 이상 24 시간까지 진통 치료를 계속 합니다.
  4. 수술 당일 10 분에 대 한 300 x g에서 centrifuging 여 교양된 luciferase 양성 (Fluc) 143B 셀 (이전 lentiviral 변환에 의해 생성 된)를 수집 하 고 PBS에서 2 x 105 셀 / µ L의 농도에서 세포를 resuspend. 6 시간 얼음에 세포 현 탁 액을 유지.
  5. 압력솥 수술 장비입니다. 준비 및 작업 영역을 청소 하 고 소독된가 위 핀셋 살 균 시트에 배치. 20 분 전에 수술 (6.8), 단계 주입 동물 피하 buprenorphine (0.05 mg/kg, 0.9% 식 염 수에 희석) 0.5 mL 인슐린 주사기 (29 게이지 바늘)을 사용 하 여 진통제로.
  6. 각 동물을 마비 직전 채워 10 µ L 주사기 집중된 (Fluc) 143B 셀 서 스 펜 션의 1 µ L (단계 6.4 참조).
  7. Isoflurane 흡입 마 취 (산소에 2-3%)와 함께 동물 anesthetize 발가락 꼬 집는 동물에 의해 마 취의 수준을 확인 합니다. 동물을 곤란 하 게, 즉, 그것은 깊은 마 취에 반응 하지 않는 연 고 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용.
  8. 동물 마 취 마스크에 머리와 운영자 쪽으로 다리의 뒷면에 위치. 왼쪽된 무릎을 플렉스. 70% 에탄올으로 피부를 닦 고 3 번 로컬 진통제로 목화 팁 lidocaine (2%)을 적용.
  9. 무 균 수술 칼을 사용 하 여 노출 경골을 무릎 바로 아래 피부에 작은 절 개 (약 5 m m)를 확인. 약 2 m m 0.8 m m 마이크로 트위스트 드릴을 사용 하 여 무릎 아래 경골에 작은 구멍을 드릴 합니다. 두 경골 외피가 드릴스루할 수 없습니다 주의 해야 합니다.
  10. 26-게이지 바늘을 사용 하 여 구멍에 천천히 (약 5 초)에서 1 µ L 세포 현 탁 액 (약 2 × 105 셀)를 주사. 현 탁 액의 역류를 방지 하기 위해 조직 접착제의 작은 물방울으로 구멍을 닫습니다.
  11. Monofilament 봉합 및 조직 접착제 한 방울 피부를 닫습니다. 잘가 열된 환경 (열 램프 사용)에서 동물 복구 하자. 두지 마십시오 동물 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지. 동물 마 취에서 완전히 복구는, 후에 그들의 자신의 감 금 소에 그들을 반환 합니다.
  12. 종양 접종 후 2 일 교육 EV 또는 순진한 GFP-긍정적인 MSCs를 주입 (100 µ L PBS에 106 세포 단계 3.5 참조) 쥐의 꼬리 정 맥에 0.5 mL 인슐린 주사기와 정 맥.
  13. 생물 발광 영상26 일주일에 두 번 여 종양의 성장에 따라. 이 위해, 150 µ L 마우스 i.p. 주입 D-인슐린 주사기 (30 mg/mL)를 소. 주입 후 10 분 이미징 시스템 생물 발광에 동물을 종양 세포에 의해 생성 된 광자 유량을 측정.
  14. 또한, 캘리퍼스 기본 뼈 종양의 직경을 측정 합니다. (M m3)에 종양 볼륨 x 0.5 x 길이2 폭으로 추정 된다.
  15. 참고: 인간적 끝점 종양 직경으로 정의 된다 > 15 m m 또는 체중 감소 > 15%.

7입니다. 폐 결 절 수의 평가

  1. 동물 중 하나에 정의 된 단계 6.14 (약 3-4 주) 인간적 끝점에 도달 하면, 실험을 종료 하 고 수집 하 고 분석 하는 모든 관련 조직.
  2. Euthanization, 전에 10 분 주사 150 µ L D-소 (30 mg/mL) 0.5 mL 인슐린 주사기.
  3. Anesthetize isoflurane 흡입 마 취와 함께 동물 (단계 6.7 참조). 발가락을 꼬 집는 마우스의 반응의 부재에 의해 마 취의 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위27여 쥐를 안락사.
  4. 폐, 간, 비장, 신장 소독된가 위 핀셋을 사용 하 여 수집 합니다. 혈액 자취를 제거 하 고 배양 접시에 그들을 넣어 PBS에 장기를 씻어.
  5. 이미징 시스템 생물 발광에 장기와 배양 접시를 놓습니다. 장기의 양쪽에 생물 발광 신호를 측정 합니다. 측정, 직후 미래 조직학 분석을 위해 그들에 게 (24-72 시간, RT) 흥분을 4% 포 르 말린에 장기 급락.
  6. 수동 임계 처리 하 여 적절 한 이미징 소프트웨어 얻은 그림을 처리 합니다. 각 사진에 폐 작은 혹의 수를 계산 합니다. 양쪽 폐에 폐 작은 혹의 총 수를 계산 합니다.

8. 조직학 분석

  1. 폐 조직의 조직학 분석:
    1. 파라핀에 포 르 말린 고정 장기를 포함 하 고 6 µ m 조직 슬라이드를 준비.
    2. Deparaffinate 폐 조직 슬라이드 하 고 0.01 M 구 연산 염 버퍼 (pH 6)에서 15 분 동안 그들을 비등 하 여 항 원 복구를 수행 합니다.
    3. 반대로 인간의 vimentin 항 체 (200 µ g/mL) 희석 1:150 항 체 희석 액 (상용)에 그 후 보조, HRP 표시 된 항 체 (0.5 mg/mL, 희석 1: 500) 실 온에서 가로로 슬라이드를 품 어. 조직 diaminobenzidine (DAB)-3'와 hematoxylin 카운터 얼룩 얼룩.
    4. 해당 카메라 및 이미지 소프트웨어를 결합 하는 광학 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 조직 슬라이드를 관찰 합니다.
  2. 마우스 tibias에 GFP-긍정적인 MSCs의 존재를 평가:
    1. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 0.24 M, pH 7.2-7.4 tibias 알려줍니다 뼈 유연 하 게 (약 1 주일)까지 매일 EDTA 버퍼를 새로 고칩니다.
    2. Tibias 탈수 하 고 파라핀을 침투. 파라핀 블록에 tibias (osteosarcoma 조직 포함)를 포함 합니다.
    3. 6 µ m 파라핀 섹션을 준비 하는 톰을 사용 합니다. 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 놓습니다. 건조 후, 실 온에서 하룻밤 슬라이드를 저장 합니다.
    4. 구 연산 염 버퍼를 사용 하 여 열 중재 항 원 검색 수행 (8.1.2 참조)와 1:900 항 체 희석 액에 희석에 안티-GFP 항 체 (전체 원으로)로 조직 얼룩. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 조직 counterstain
    5. 조직 슬라이드 해당 이미징 소프트웨어를 결합 하는 형광 현미경으로 관찰 합니다.

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결과

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이 연구에서 우리는 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형으로 MSCs 교육 다리 분 비 EVs 수 탐험. 우리 다리 셀 MSCs에 의해 내 면화는 exosome 같은 EVs 릴리스 보여줍니다. 우리 암 EVs에 의해 유도 된 MSC cytokine 식 프로필의 변경을 측정 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 효과 평가. 연구 디자인의 일반적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.

EVs 발표 143B 다리 셀 또는 컨트롤 인간의 섬유 아 세포 차등 원심 분리에 의해 순화 되었다. EV 순도 계시는 준비는 주로 40-100 nm (그림 2A) 사이 배열 하는 직경을 가진 소포를 포함 하는 전자 현미경으로 ...

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토론

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종양-분 비 세포 외 소포 (EVs) 종양 지원 환경 생성 하 현지와 먼 중간 엽 세포의 생리학을 변경할 수 있습니다. 여기 우리가 종양 세포 간의 EV 중재 한 상호 작용의 해 부를 수 있는 다리의 전 임상 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) vivo에서. 우리는 인간의 종양 마우스 다리 xenografts 강하게 베어링의 EV 교육 MSCs의 조직의 주입7일-6/STAT3 신호 통로 활성화 하 여 암 성장과 전이 형성 촉진을 보여줍니다.

최근 연구 결과 암 EVs 로컬 또는 골 수 유래 기질 세포16,,2829의 동작을 변경 하 여 미리 전이성 틈새의 형성에 도움이 될 수 있습니다 나타났습니다. 이러한 연구 결과 암 파생 ...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.R. 발리는 유럽 연합에 의해 Cancro (AIRC) 공동 투자 라 검색 술 당 예술 우승에 의해 친교에 의해 지원 되었다. 또한,이 프로젝트 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 아무 660200 (S.R. 발리) 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Ultra CentrifugeBeckmanOptima L-90K
Rotor SW32TiBeckman369650원고에서 울트라 스윙 버킷 로터
투과 전자 현미경ZeissEM109또는 이와 유사한 TEM
디지털 카메라NikonDMX 1200F또는 유사한 카메라
이미징 소프트웨어 TEM NikonACT-1
형광 현미경ZeissImager.D2또는 이와 유사한 형광 현미경
이미징 소프트웨어 FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
CentrifugeHettickROTANTA 460R-80
FreezerThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScalibur또는 유사한 유세포 분석기
드릴FermFCT-3000.8mm 드릴
HSS 마이크로 트위스트 드릴, 0.8mmProxxon28 8520.8mm 드릴
IVIS 카메라XenogenIvis Lumina원고에서 생물 발광 카메라라고 합니다. Xenogen은 이제 Perkin Elmer
Living image software2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen은 이제 Perkin Elmer
10 µ의 일부입니다. L 주사기HamiltonNeuros 모델 1701 RN
바늘 : 주사기, 26 게이지, Pointstyle AS, 사용자 정의 길이 2cmHamiltonn.a.Caliper
MitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.Heat
LampPhilipsn.a.
Culture media
소 태아 세럼HycloneRYG35912
혈소판 용해물n.a.n.a.IMDM
배지LonzaBE12-722F
알파-MEM 배지LonzaBE02-002F
DMEM 배지LonzaBE12-614F
펜/스트렙/글루타민GIBCO10378-016
헤파린LEO012866-08
트립신/EDTA (10x)GIBCO15400-054
<강>세포
지방 탈리버 MSCn.a.n.a.GFP
양성 MSCn.a.n.a.
143B 세포ATCCCRL-8303
FLUC-143B 세포ATCCCRL-8303형질도입
<강력>일회용
배양 플라스크 175 cm2CELLSTAR660175
50 mL 튜브Greiner bio-one210261
Freeze 튜브Thermoscientific377224
Ultra-Clear 튜브Beckman344058원고에서 ultra-centrifuge tubes
0,22 µ로 언급되었습니다. m 필터MillexSLGV033RS
200 메시 Formvar-carbon-coated nickel gridsEMS (Electron Microscopy Sciences)
0.5 mL 인슐린 주사기와 29G 바늘TerumoU-100 
페트리 디쉬시그마 - AldrichP7612
여과지 Thermo fisher Scientific50363215
시약/키트
파라포름알데히드Alfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
글루타르알데히드EMS (Electron Microscopy Sciences)16300
uranyl oxalateEMS (Electron Microscopy 과학)22510
urany acetateEMS (Electron Microscopy Sciences)22400
methyl celluloseEMS (Electron Microscopy Sciences)1560
PKH67Sigmamini67-1kt원고에서 GFLD
BSASigmaA8412
CBA - human inflammatory cytokine kitBD551811로 지칭
포름 알데히드 37 %VWR104003100
탄소강 수술 용 블레이드Swann-Morton206원고에서 수술 칼
항 인간 vimentin 항체Santa Cruzsc-6260클론 V9
항체 희석제DAKOS0809
HRP 표지 안티 마우스 IgG 항체Life Technologies32230
DAB-kitDAKOK500711
hematoxyllinSigmaGHS232
EDTA 버퍼n.a.n.a.Citrate
버퍼n.a.n.a.rabbit
polyclonal anti-GFP 항체Abcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
파라세타몰, 120mg/5ml 시럽Bayern.a.Sinaspril, 어린이용 파라세타몰 용액
Isoflurane 1000mg/gVumc 약국n.a.
부프레노핀 염산염, 0.3mg/mlIndivior UK Limited
2%Vumc 약국n.a.70
% 에탄올VWR93003.1006
조직 접착제Derma+Flex, 공식화된 의료용 시아노아크릴레이트Vygon
LB604060 안약: Vidisec Carbogel, 2 mg/mlBausch+Lombn.a.D-luciferin
, 칼륨 염Gold BiotechnologyLUCK-1
유리 슬라이드Thermo scientific630-0954
스테인리스 스틸 루프 n.a.n.a.
Mice experiments
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,  female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASAENVIGOn.a.Paper-pulp
smart home (cage enrichment)Bio Servicesn.a.Alpha-dri
bedding materialShepperd Speciality Papersn.a.
마우스 사료 : Teklad 글로벌 18 % 단백질 설치류 다이어트ENVIGO2918-11416M
봉합사EthiconV926H
가위Sigma-AldrichS3146-1EA(또는 유사)
핀셋Sigma-AldrichF4142-1EA(또는 유사)
로 언급됨인간 섬유아세포 n.a.n.a. n.a.lidocaine-HCL

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