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방법 논문

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

10.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56932

⸱

2018년 5월 6일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

초록

종양 microenvironment 내 거주 또는 모집 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 여러 암 종류에 악성 진행에 기여 한다. 특정 환경 신호 영향이 성인 줄기 세포 paracrine 중재자 가속된 종양 성장 및 전이 해제할 수 있습니다. 종양 및 MSCs 사이 누화를 정의 암 진행을 기본 메커니즘을 이해 하 고 치료 적 개입에 대 한 새로운 목표를 식별 하려면 기본 중요성 이다.

암 세포 생성 높은 양의 extracellular 소포 (EVs), 뿌리깊은 대상 세포 종양 microenvironment에 또는 먼 사이트에서의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 종양 EVs 염증 성 RNAs 등 (onco) 단백질, 암 세포의 전이 행동을 강화 하거나 미리 전이성 틈새 시장 형성에 참여 stromal 세포 교육 수 기능 생체를 묶습니다. 이 문서에서는, 우리는 EV 중재 누화 종양 사이의 중간 엽 줄기 세포의 특정 평가 가능 하 게 하는 전 임상 암 마우스 모델의 개발을 설명 합니다. 첫째, 우리는 정화 및 종양 분 비 EVs의 특성화 및 MSCs에서 EV 국제화 평가 설명합니다. 우리 다음 게 암 EVs에 의해 유도 된 다중 구슬 기반 immunoassay MSC cytokine 식 프로필 변경을 평가 하의 사용. 마지막으로, 우리이 종양-msc와 상호 작용 하는 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 기여를 표시.

우리의 모델 암 EVs 종양 지원 환경 형성 하는 방법을 정의 하 고 종양 및 MSCs 간의 EV 중재 통신의 봉쇄 암 진행을 방지 하는 여부를 평가 기회를 제공 한다.

서론

종양 microenvironment tumorigenesis 및 암 진행, 전이 형성 등의 치료제1저항 개발의 대부분, 그렇지 않으면 모두, 측면에서 적극적으로 참여 합니다. 이 종양 틈새에서 발생 하는 복잡 한 종양-기질 상호 작용의 해 부를 수 있는 전 임상 orthotopic 암 마우스 모델에 대 한 필요성을 강조 하고있다.

종양 microenvironment의 많은 세포 구성 성분 중에서 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 강하게 유방암, 전립선 암, 뇌종양, 다 발성 골 수 종, 및 다리2 등 여러 암 종류의 암 진행에 기여 ,3,,45,,67. MSCs는8,9골 수, 지방 조직, 태 반, 탯 줄 혈액, 등을 포함 하 여 다양 한 성인 그리....

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프로토콜

중간 엽 줄기 세포 분리에 대 한 인간의 지방 조직 기관 윤리 위원회에 의해 승인 후 Tergooi 병원 (쉼, 네덜란드)의 성형 수술의 부서에서 얻은 고 서 면 통지 해준 동의. GFP-긍정적인 많은 MSCs는 어린이 성인 (모 데 나 대학와 레지오 에밀리 아)에 대 한 부의 의료 및 외과 과학에서 얻은 했다.

동물 실험, 동물 실험에 네덜란드 법률에 따라 수행 하 고 프로토콜 VU 대학 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드의 동물 실험에 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 세포 외 소포 종양 분 비의 격리.

  1. FBS 70000 x g 하룻밤 사이에 (16 시간), 초 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에서 아무 브레이크 centrifuging EV 고갈 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 준비 (기대 감속에 대 한 1 시간). 신중 하 게는 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 (EV 고갈 FBS)를 수집 합니다. 0.22 μ m 필터 EV 고갈 FBS를 필터링 합니다.
  2. Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 2mm 글루타민을 보완 하 여 EV 고갈 문화 매체를 준비 (1 x P/S/G) 및 5%....

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결과

이 연구에서 우리는 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형으로 MSCs 교육 다리 분 비 EVs 수 탐험. 우리 다리 셀 MSCs에 의해 내 면화는 exosome 같은 EVs 릴리스 보여줍니다. 우리 암 EVs에 의해 유도 된 MSC cytokine 식 프로필의 변경을 측정 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 효과 평가. 연구 디자인의 일반적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.

EVs 발표 143B 다리 셀 또는 컨트롤 인간의 섬유 아 세포 차등 원심 분리에 의해 순화 되었다. EV 순도 계시는 준비는 주로 40-100 nm (그림 2A) 사이 배열 하는 직경을 가진 소포를 포함 하는 전자 현미경으로 .......

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토론

종양-분 비 세포 외 소포 (EVs) 종양 지원 환경 생성 하 현지와 먼 중간 엽 세포의 생리학을 변경할 수 있습니다. 여기 우리가 종양 세포 간의 EV 중재 한 상호 작용의 해 부를 수 있는 다리의 전 임상 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) vivo에서. 우리는 인간의 종양 마우스 다리 xenografts 강하게 베어링의 EV 교육 MSCs의 조직의 주입7일-6/STAT3 신호 통로 활성화 하 여 암 성장과 전이 형성 촉진을 보여줍니다.

최근 연구 결과 암 EVs 로컬 또는 골 수 유래 기질 세포16,,2829의 동작을 변경 하 여 미리 전이성 틈새의 형성에 도움이 될 수 있습니다 나타났습니다. 이러한 연구 결과 암 파생 .......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

S.R. 발리는 유럽 연합에 의해 Cancro (AIRC) 공동 투자 라 검색 술 당 예술 우승에 의해 친교에 의해 지원 되었다. 또한,이 프로젝트 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 아무 660200 (S.R. 발리) 받았습니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Ultra CentrifugeBeckmanOptima L-90K
Rotor SW32TiBeckman369650원고에서 울트라 스윙 버킷 로터
투과 전자 현미경ZeissEM109또는 이와 유사한 TEM
디지털 카메라NikonDMX 1200F또는 유사한 카메라
이미징 소프트웨어 TEM NikonACT-1
형광 현미경ZeissImager.D2또는 이와 유사한 형광 현미경
이미징 소프트웨어 FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
CentrifugeHettickROTANTA 460R-80
FreezerThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScalibur또는 유사한 유세포 분석기
드릴FermFCT-3000.8mm 드릴
HSS 마이크로 트위스트 드릴, 0.8mmProxxon28 8520.8mm 드릴
IVIS 카메라XenogenIvis Lumina원고에서 생물 발광 카메라라고 합니다. Xenogen은 이제 Perkin Elmer
Living image software2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen은 이제 Perkin Elmer
10 µ의 일부입니다. L 주사기HamiltonNeuros 모델 1701 RN
바늘 : 주사기, 26 게이지, Pointstyle AS, 사용자 정의 길이 2cmHamiltonn.a.Caliper
MitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.Heat
LampPhilipsn.a.
Culture media
소 태아 세럼HycloneRYG35912
혈소판 용해물n.a.n.a.IMDM
배지LonzaBE12-722F
알파-MEM 배지LonzaBE02-002F
DMEM 배지LonzaBE12-614F
펜/스트렙/글루타민GIBCO10378-016
헤파린LEO012866-08
트립신/EDTA (10x)GIBCO15400-054
<강>세포
지방 탈리버 MSCn.a.n.a.GFP
양성 MSCn.a.n.a.
143B 세포ATCCCRL-8303
FLUC-143B 세포ATCCCRL-8303형질도입
<강력>일회용
배양 플라스크 175 cm2CELLSTAR660175
50 mL 튜브Greiner bio-one210261
Freeze 튜브Thermoscientific377224
Ultra-Clear 튜브Beckman344058원고에서 ultra-centrifuge tubes
0,22 µ로 언급되었습니다. m 필터MillexSLGV033RS
200 메시 Formvar-carbon-coated nickel gridsEMS (Electron Microscopy Sciences)
0.5 mL 인슐린 주사기와 29G 바늘TerumoU-100 
페트리 디쉬시그마 - AldrichP7612
여과지 Thermo fisher Scientific50363215
시약/키트
파라포름알데히드Alfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
글루타르알데히드EMS (Electron Microscopy Sciences)16300
uranyl oxalateEMS (Electron Microscopy 과학)22510
urany acetateEMS (Electron Microscopy Sciences)22400
methyl celluloseEMS (Electron Microscopy Sciences)1560
PKH67Sigmamini67-1kt원고에서 GFLD
BSASigmaA8412
CBA - human inflammatory cytokine kitBD551811로 지칭
포름 알데히드 37 %VWR104003100
탄소강 수술 용 블레이드Swann-Morton206원고에서 수술 칼
항 인간 vimentin 항체Santa Cruzsc-6260클론 V9
항체 희석제DAKOS0809
HRP 표지 안티 마우스 IgG 항체Life Technologies32230
DAB-kitDAKOK500711
hematoxyllinSigmaGHS232
EDTA 버퍼n.a.n.a.Citrate
버퍼n.a.n.a.rabbit
polyclonal anti-GFP 항체Abcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
파라세타몰, 120mg/5ml 시럽Bayern.a.Sinaspril, 어린이용 파라세타몰 용액
Isoflurane 1000mg/gVumc 약국n.a.
부프레노핀 염산염, 0.3mg/mlIndivior UK Limited
2%Vumc 약국n.a.70
% 에탄올VWR93003.1006
조직 접착제Derma+Flex, 공식화된 의료용 시아노아크릴레이트Vygon
LB604060 안약: Vidisec Carbogel, 2 mg/mlBausch+Lombn.a.D-luciferin
, 칼륨 염Gold BiotechnologyLUCK-1
유리 슬라이드Thermo scientific630-0954
스테인리스 스틸 루프 n.a.n.a.
Mice experiments
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,  female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASAENVIGOn.a.Paper-pulp
smart home (cage enrichment)Bio Servicesn.a.Alpha-dri
bedding materialShepperd Speciality Papersn.a.
마우스 사료 : Teklad 글로벌 18 % 단백질 설치류 다이어트ENVIGO2918-11416M
봉합사EthiconV926H
가위Sigma-AldrichS3146-1EA(또는 유사)
핀셋Sigma-AldrichF4142-1EA(또는 유사)
로 언급됨인간 섬유아세포 n.a.n.a. n.a.lidocaine-HCL

참고문헌

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. ....

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