방법 논문

준비 번데기 기간 및 초파리 guttifera 의 날개 색소 측정 방법

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⸱

DOI:

10.3791/56935

⸱

2018년 1월 24일

 ,  ,  , 
1Graduate School of Science, Kyoto University, 2Graduate School of Science, Osaka City University, 3The Hakubi Center for Advanced Research, Kyoto University, 4Graduate School of Environmental Science, Hokkaido University

이 논문에서

요약

번데기 기간 및 측정 초파리 guttifera 의 날개 염색의 준비에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 준비와 염색의 정량화 성인 특성의 발달 기계 장치를 공부에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 특성 개발의 interspecific 비교 사용.

초록

다양 한 종의 초파리 (과일 파리) 개발 및 유전자 변화 진화 변화에 대 한 책임의 메커니즘을 연구 하는 기회를 제공 합니다. 특히, 성인 무대 날개 착 색 비교를 포함 하 여 interspecific 비교 형태학 상 특성의 풍부한 원천입니다. 공부 하 고 종 간의 발달 차이, 자세한 관찰과 적절 한 준비는 정확한 비교 필요 합니다. 여기 우리가 번데기 기간의 준비 및 폴카 점 과일 파리, 초파리 guttifera착 색 날개의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 첫째, 자세한 형태 관찰 및 형태학에 따라 번데기 단계의 정의 방법을 설명 합니다. 이 방법은 외부 chitinous 사건의 번데기, 번데기 형태학의 상세한 관측을 사용 하는 puparium를 제거 하기 위한 기술을 포함 합니다. 둘째, 우리는 정의 된 번데기 단계 기간을 측정 하기 위한 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 디지털 이미지 및 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석에 따라 날개 염색의 정량화에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 방법으로, 우리는 번데기 단계 동안 성인 특성의 발달 과정을 비교 하기 위한 견고한 기초를 설정할 수 있습니다.

서론

초파리 의 형태학 특성 중 일부는 종1,2,3,,45중 다양. 우리는 질문에 접근할 수 있다 어떻게 형태학 상 다양성의이 형태학의 세대의 메커니즘을 비교 하 여 발생. 이러한 형태학의 예로 애벌레 trichomes, 성인 섹스 빗, 외부 생식 기 기구, 복 부 착 색, 및 날개 염색6,7,,89, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 성인 간의 형태학 적 차이 연구, 관찰 및 번데기 단계 분석, 때문에 중요 하다 성인 특성의 운명을 후반 애벌레 단계에서 결정 되 고 후속 morphogenesis 번데기 기간 동안 진행.

초파리 melanogaster의 발달 생물학 연구에서 "시간 APF" (번데기 형성 후 시간)16번데기 단계 표시 하는 일반적인 방법입니다. 이 시스템 번데기 형성 후 절대 시간을 고용 하 고 일상적인 실험에 대 한 매우 편리 하다. 그러나, 발달 속도 pupae, 사이 다를 수 있습니다 약간의 유전적, 후 또는 microenvironmental 차이 의해 영향을 받을 수 있고 따라서 같은 데 번데기 형성 후 절대 시간을 보장 하지 않습니다 pupae 동시는 발달 단계입니다. 대부분의 경우, 형태학 상 특징에 의해 정의 하는 단계는 여러 개인 비교를. 특히, 종 사이 비교에 해당 (동종) 단계 중 비교 정확한 준비 필요합니다.

베인 브리지 및 Bownes17 인식 20 번데기 단계 (P15(ii)) P1 초파리 melanogaster pupae의 형태학 적 특징에 따라. 이 발판은 형태학 상 발달 준비18의 가장 널리 사용 되는 시스템 이다. 이전 연구에서 우리는 날개 염색 연구19에 대 한 기초 확립 초파리 guttifera 의 번데기 준비 수행. D. guttifera 그것의 날개에 검은 물방울 패턴 있으며 날개 색소 형성20모델 종 중 하나입니다. 우리가 형태학 기준에 설명 된 간주 브릿지 Bownes' 연구17, 우리는 직접 직렬 관찰19, 베인 브리지 및 Bownes의 추정 단계 기간을 사용 하는 대신 단계 기간을 측정 주파수를 관찰 했다. 여기 우리가 번데기 준비의 방법 및 측정의 Fukutomi 외19에 사용 되는 초파리 의 번데기 단계의 기간을 설명 합니다.

날개 착 색의 개발 메커니즘 연구, 번데기 또는 성인 단계에서 색소 발생 시 알아야 합니다. Fukutomi 외. 19 날개 이미지의 이미지 분석에 의해 번데기 및 성인 단계 동안 착 색의 광학 밀도 (ODs)을 측정할. 초파리 날개의 착 색 검은 멜 라 닌21의 축적으로 인 한 것으로 생각 된다. ODs의 정량화, 그레이 스케일 이미지와 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)22 사용 되었다. 인식 하 고 계량 자리 전용 착 색 (ΔOD), 우리는 세 자리 세 자리 내부에서 외부 감. 확인 하려면이 방법을 재현 하 고 객관적인, OD 측정의 랜드마크로 서 날개 정 맥을 사용 하 여 결정 한다. 이 문서에서는, 우리가 자세히 설명 초파리 guttifera착 색 날개의 정량화의이 방법.

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프로토콜

1. 비행 사진

  1. 초파리 guttifera 를 사용 하 여 다음과 같은 프로토콜의 모든.
  2. 플라스틱 튜브를 사용 하 여 (직경 25 m m x 높이 96 m m) 및 셀 루 로스 플러그 (직경 mm x 높이 23 26 m m) 재고 유지 보수에 대 한. 표준 옥수수 가루/설탕/효 모/천 식품을 사용 하 고 따라 발행물이 종의23 다른 대체 조리법 설명.
    참고: D. guttifera (재고 번호 15130 1971.10) 초파리 종 재고 센터, 샌디에고가 주 대학에 의해 제공 됩니다. D. guttifera 는 immigrans-먼 관련이 D. melanogaster 내 속23,tripunctata 방사선에 속해 있지만 그것이 D. melanogaster 공통점이 많은 생물 속성 . 이 따라,이 프로토콜 일부 종 특정 음식 및 기술 팁 그들에 게2를 유지 하기 위해 필요 하지만 많은 초파리 종에 대 한 적용할 수 있습니다.

2. 번데기와 번데기 단계의 정의의 관찰

참고: 관측 번데기 25 ° c.에서 h 명암 주기 12:12 유지 비행 주식에서 가져온 것입니다. 베인 브리지 및 Bownes17 D. melanogaster pupae pupation moistened 휴지 (946 이동된 pupae의 97% 생존)의 조각에의 원래 장소에서 이동의 낮은 위험을 설명 합니다. D. guttifera pupae 본질적으로 같은 방법으로 준비 될 수 있다.

  1. 플라스틱 병에 신선한 음식 (표준 옥수수 가루/설탕/효 모/천 식품)에 초파리 의 건강 한 성인을 배치 (직경 25 m m x 높이 96 m m) 고 알. 7 일 늦은 3 instars를 기다립니다.
  2. 각 1.5 mL microtube에 표준 옥수수 가루/설탕/효 모/천 식품의 1 mL를 놓습니다. 호흡 수 있도록 푸시 핀 관통에 의해 microtubes의 뚜껑에 2 mm 간격으로 3 핀 홀을 확인 합니다.
  3. 7 음식 microtubes 원심 미니 microcentrifuge (860 x g)에 s.
  4. 반전 하 고 유리병에서 모든 성인을 제거 하는 튜브를 누릅니다.
  5. DdH2O의 5-10 mL를 붓고 (또는 역방향 삼 투 물) 유리병에.
  6. 애벌레는 플라스틱 페 트리 접시에 물으로 밖으로 부 어 (직경 90 mm x 높이 15 m m). 그들의 큰 신체 크기 (길이 3-4 m m)에 의해 늦은 3 instars를 식별 합니다.
  7. 부드럽게 늦은 3 탈피 애벌레 집게와 음식 microtubes 이동 (10 애벌레 / microtube). 25 ° c.에서 그들을 밤새 품 어
  8. DdH2O로 습 하 게 되 고 플라스틱 페 트리 접시에에서 배치 된 티슈 페이퍼의 조각에 새로 형성된 된 pupae 이동 (직경 35 mm x 높이 10 m m).
  9. 습 한 챔버 (ddH2O 하단에서의 10 mL를 포함), 페 트리 접시를 놓고 번데기 원하는 단계에 개발 될 때까지 기다립니다.
  10. 플라스틱 페 트리 접시에에서 moistened 휴지 조각에 번데기를 이동 (직경 60 m m x 높이 15 m m).
    참고: 단계 정의 주로 만들 수 있습니다 기반으로 D. melanogaster17의 단계에. 일반적으로, 초파리 의 번데기 기간 단계 정의의 일부 수정 사용 하는 종류에 따라 필요한 것 P1-P15(ii)로 분류 될 수 있다. 만약에 가능 하다 면, 제거는 puparium 정확 하 고 상세한 관측을 수 있습니다. (3 단계) 아래 내용을 참조 하십시오.
  11. 스테레오 현미경 pupae를 관찰 합니다. 스테레오 현미경에 부착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 사진을 가져가 라.

3. 제거 puparium

주: 초파리 의 번데기는 puparium 라고 하는 구조에 의해 적용 됩니다. Muscomorpha (파리)의 곤충 pupation;에서 애벌레의 표 피를 흘리지 않는 대신, 그것은 apolysis, 후 표 피를 견고 하 고 번데기, puparium24의 보호 커버로 사용. puparium 안에 있는 번데기는 매우 부드러운이 고 불안정 한 진정한 번데기 표 피가 있다. Apolysis P4(ii) 주위 일어나기 전에 epithelia 및 puparium 함께, 연결 그리고 그러므로 손상 없이 puparium를 제거 하는 것은 매우 어렵습니다. P5, 후 제거는 puparium 이지만 힘 드는, 형태학 관찰과 번데기 단계를 정의 하는 데 유용. 과정은 다음과 같이 실시 됩니다.

  1. 한 조각의 종이 타월의 조각에 양면 테이프 부착
  2. 이중 면 테이프 복 부 쪽 (그림 1A)에 번데기를 놓습니다.
  3. puparium의 앞쪽 측면 및 내부 번데기 사이 공간을 찾습니다. 파악 및 집게를 사용 하 여이 간격 주위 puparium를 제거 하 고 번데기의 머리의 앞쪽 측면을 노출.
  4. 이전 후부 축에 평행 이동 하 여는 집게의 끝을 삽입 합니다. puparium를 로컬로 집게 끝을 들어올립니다. 파손은 puparium의 후부 부분에 도달할 때까지이 작업을 반복 합니다. 격차 또한 puparium와 번데기 다리 사이 형성 했다 확인 하 고 브레이크는 puparium의 복 부 측 내부 번데기 (그림 1B)에 피해를 최소화.
  5. puparium을 가능한 한 많이 깨는 후 좋은 붓 (#5/0) (그림 1C)을 사용 하 여 번데기를 꺼내.
  6. DdH2O 적신 되었으며 플라스틱 페 트리 접시에 휴지 조각에 번데기를 배치 (직경 60 m m x 높이 15 m m). 걸릴 사진을 최대한 빨리 노출 된 번데기는 취약 하 고 쉽게 건조 된다.
    참고:는 puparium 없이 Pupae 적합 하지 않습니다 번데기 기간 (4 단계)의 기간을 측정 하기 때문에 스트레스 (예: 건조) 및 물리적 손상 정상적인 발달을 방해할 수 있습니다.

4. 번데기 단계의 기간을 측정

  1. 2 단계에서에서 설명한 대로 번데기 단계의 기간을 측정 하기 위한 pupae를 준비 합니다. 1-2, 2-3, 및 번데기 형성 (각 20 pupae) 후 3-4 일의 번데기를 수집 합니다. 확인을 위해 pupae를 개별 식별 번호 (1-60)를 제공 합니다. 20 더 젊은 pupae를 얻으려면 다음 단계 동안 번데기를 형성 하는 새로 수집 계속. 새로 형성된 된 pupae를 개별 식별 번호 (61-80)를 제공 합니다. DdH2O moistened 티슈 페이퍼 (1 번데기/글쎄, 12 pupae/접시) 12-잘 셀 문화 판의 잘 (3.9 c m2)의 조각에는 번데기를 놓습니다. DdH2O 습도 유지, 뚜껑, 위에 판 25 ° C, 지속적인 빛 (24:0 h 명암) 조건에에서 배치 하로 판 간 잘 공간을 채우십시오.
    참고:는 puparium 없이 번데기는 번데기 기간의 기간을 측정 하기 위한 적합 하지 않습니다. puparium를 제거 하지 마십시오.
  2. 형태학 기능 등 색, bristles, 말 tubules 노란색 신체의 모든 pupae 일단 매 30 분, 그리고 기록 관찰 집계 시트에서 (P1-P15(ii), 참조17,19에 따라) 하는 단계를 관찰 합니다.
  3. 계속 3 개의 (또는 그 이상)의 회전 변화에 의해 4 일 연속 (96 h)를 기록 합니다.
  4. 특정 단계의 각 레코드의 숫자를 계산 하 고 그들의 평균 (관측의 수 평균 / pupae). 다음 단계 (h)의 예상된 길이 결과 0.5 (h)에 의해 그들을 곱하면 됩니다.

5. 날개에 검은 반점의 강도 측정

참고: 번데기 또는 성인 날개에 검은 반점의 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 하나는 날개의 디지털 이미지에서 특정 영역의 OD를 계산할 수 있도록 교정25, 알려진된 ODs (단계별된 밀도 필터)와 유리 필터 사용 됩니다. 자리에서 세 자리 밖에 OD 측정, 그리고 후자는 자리 (ΔOD)의 강도를 전에서 뺍니다. 여기, 해 부, 측정 및 ΔOD의 계산 방법을 설명합니다. 2 단계, 3 단계 및 4 단계에서 독립 후이 절차를 수행할 수 있습니다. 일단 하나 2 단계 수행 하 고 모든 번데기 단계를 이해 하 고, 하나 직접 시작 하거나 5 단계를 반복 수 있습니다.

  1. 이미지 준비
    1. 2 단계에서에서 설명한 대로 초점 무대의 새로운 번데기를 준비 합니다. 집게로는 puparium의 앞쪽 부분을 제거 합니다. 집게를 사용 하 여 번데기를 꺼내와 플라스틱 페 트리 접시에에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, 표 2)에 배치 (직경 35 mm x 높이 10 m m).
    2. 날개의 기저 관절을 잘라 (기저 합동은 날개의 좁은 인접 부분). 날개 접혀 플라스틱 페 트리 접시에 배치 (직경 35 mm x 높이 10 m m) ddH2O (날개 자체로 펼쳐져) 삼투성 압력에 의해 확장으로 가득.
    3. 재고 유리병에서 새로 eclosed 성인 10 분에 한 번 수집 합니다. CO2 CO2 anesthetizing 패드를 사용 하 여 비행 anesthetize, 부동에 의해 anesthetization를 확인 하 고 날개의 기저 관절을 잘라.
    4. 유리 슬라이드에 PBS의 장소 10 µ L 날개, 놓고 커버 슬립 (18 x 18 mm)와 함께 커버 합니다.
    5. 스테레오 현미경의 빛을 켜십시오. 빛이 최대 수준 수를 설정 합니다. 목표 렌즈 11.5 X 설정 합니다. 가장 열린 상태 수 다이어 프 램을 설정 합니다. 카메라를 켭니다. 카메라 설정 (ISO: 100, 2352 픽셀 x 3136 SHQ 모드 셔터 속도: 1/20 s). 현미경의 초점 손잡이 이동 하 여 샘플에 초점.
    6. 원격 제어 단위는 이미지의 셔터 버튼을 눌러. Campaniform sensillum, 경도 정 맥 자리 또는 후부 crossvein, 위치는 왼쪽에 날개의 원심 부분 및 상부에 날개의 앞쪽 부분에 중심 해야 합니다 각각의 날개 당 3 이미지를 가져가 라.
  2. 교정
    1. 날개 이미지를 가져오는 데 사용 하는 동일한 카메라 설정을 사용 하 여 단계별된 밀도 필터의 9 부품의 이미지를 가져가 라.
    2. ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)22를 시작 합니다.
    3. 파일을 클릭 | 오픈 | 그리고 단계별된 밀도 필터의 이미지 중 하나를 선택 합니다.
    4. 이미지 클릭 | 유형 | 8 비트 | 8 비트 이미지에는 이미지를 변환 합니다.
    5. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 지정 | 그리고 타원형 및 가운데 열을 확인 하십시오. Y 좌표 열에서 폭 열에 100 (픽셀), 100 (픽셀) 높이 열에서 X 좌표 열에 1568 및 1176를 작성 합니다. 확인을 클릭 합니다.
    6. 클릭 분석 | 측정 |. 선택 된 영역의 "의미 회색 값" 측정 됩니다.
    7. 5.2.3를 반복 합니다. 5.2.6 하. 8 이미지 나머지.
    8. 클릭 분석 | 보정 Rodbard25 함수 열에서 선택 하 고 중간에 오른쪽 열에 다음 번호를 작성 (0.04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408;이 숫자의 밀도에 따라 달라는 밟은 밀도 필터).
    9. 세계 교정 열을 확인 하 고 확인을 클릭 합니다.
      참고:이 절차를 수행 하 여 "회색 값 의미"로 변환 됩니다 "광학 밀도 (OD)" Rodbard 함수를 사용 하 여. 이 단계 후에 ImageJ 소프트웨어에서 특정 선택된 영역에 대 한 광학 밀도 계산할 수 있습니다.
  3. 측정의 영역을 선택
    참고: 관광 명소는 일반적으로 campaniform sensilla, 경도 정 맥 팁, 및 crossveins 같은 연관 된다. 이들과 다른 명소는 날개에 측정의 영역을 선택 하려면 사용할 수 있습니다. 여기에 예D. guttifera(그림 2)은 설명.
    1. A, campaniform sensillum 자리의 정의입니다.
      1. Campaniform sensillum 자리는 이미지의 중앙에 이미지를 엽니다. 이미지 클릭 | 유형 | 8 비트 | 8 비트 이미지에는 이미지를 변환 합니다.
      2. 사각형 영역 선택 도구 를 클릭 하 고 사각형을 그립니다. 그것은 세 번째 경도 정 맥의 후부 라인에 연결 된 더 원심 campaniform sensillum 자리에서 사각형의 왼쪽된 위 꼭지점을 설정 합니다. 그것은 자리 campaniform sensillum의 오른쪽에 있는 사각형의 오른쪽 면을 설정 합니다.
      3. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 관리자에 추가 |. 모두 표시 열을 확인 합니다.
      4. 각 도구 라인 선택 도구에서 클릭 합니다. 3 경도 정 맥의 후부 라인에 첫 번째 줄을 그립니다. 1 단계에서에서 그린 사각형의 꼭지점에 선의 왼쪽된 끝점을 설정 합니다. 사각형의 위쪽 면에 두 번째 줄을 그립니다. 이 단계에서 그려진 두 선 사이의 각도 측정 하는 "m" 키를 누릅니다. 컴퓨터의 화면에 이미지의 창을 클릭 합니다.
      5. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 관리자에 추가 |.
      6. 사각형 영역 선택 도구 를 클릭 하 고 약 1/9의 사각형을 그릴 이미지 창의 크기. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 회전 |. 작성 단계 5.3.1.4에서에서 측정 하는 각도의 빼기도 합니다. 각 열에이 단계에서 그린 사각형을 회전 하려면 확인 을 클릭 합니다.
      7. 5.3.1.6 단계에서 그린 사각형을 이동 합니다. 사용 하 여 화살표 키. 사각형의 왼쪽 및 세 번째 경도 정 맥의 후부 라인에 연결 된 사각형의 하단 측면에 두 번째 경도 정 맥의 후부 선의 끝점을 설정 합니다. 확인 두 번째 경도 정 맥의 끝 지점에서 수직 라인 3 경도 정 맥의 후부 라인을이 절차에서 그려집니다. A (그림 2A)으로 수직 라인의 발을 정의 합니다.
      8. X 좌표와 y 좌표 점 A, 점 대답에 커서를 배치할 때 영역 선택 도구 아래 표시의 기록
    2. 경도 정 맥 팁 자리 포인트 B의 정의
      1. 경도 정 맥 끝 자리는 이미지의 중앙에 이미지를 엽니다. 이미지 클릭 | 유형 | 8-비트 | 8 비트 이미지에는 이미지를 변환.
      2. 5.3.1 단계에 설명 된 동일한 절차를 반복 합니다. (포인트 A의 정의 campaniform sensillum 자리) 이미지에 A를 찾을 수 있습니다.
      3. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 관리자에 추가 |.
      4. 사각형 영역 선택 도구 를 클릭 하 고 사각형을 그립니다. 3 경도 정 맥의 후부 선의 끝점에서 사각형의 왼쪽된 위 꼭지점을 설정 합니다.
      5. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 관리자에 추가 |.
      6. 각 도구 라인 선택 도구에서 클릭 합니다. 지점 A와 3 경도 정 맥의 후부 선의 끝점을 연결 하는 첫 번째 줄을 그립니다. 정의이 선 라인 A. 그릴로 두 번째 줄 단계 5.3.2.4에서에서 그린 사각형의 상단에. 두 선 사이의 각도 측정 하는 "m" 키를 누릅니다.
      7. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 관리자에 추가 |.
      8. 사각형 영역 선택 도구 를 클릭 하 고 약 1/9의 사각형을 그릴 이미지 창의 크기. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 회전 |. 작성 단계 5.3.2.6에서에서 측정 하는 각도의 빼기도 합니다. 각 열에이 단계에서 그린 사각형을 회전 하려면 확인 을 클릭 합니다. 화살표 키를 사용 하 여 사각형을 이동 합니다. 그것은 사각형의 왼쪽된 면에 있도록 A 라인과 4 경도 정 맥의 앞쪽 라인의 끝점에 연결 된 사각형의 위쪽 면을 설정 합니다.
      9. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 관리자에 추가 |.
      10. 사각형 영역 선택 도구 를 클릭 하 고 약 1/9의 사각형을 그릴 이미지 창의 크기. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 회전 |. 각 열에서 6 단계에서에서 측정 하는 각도의 빼기도 작성 하 고이 단계에서 그린 사각형을 회전 하려면 확인 을 클릭 합니다. 화살표 키를 사용 하 여 사각형을 이동 합니다. 그것은 단계 5.3.2.8에서에서 그린 사각형의 왼쪽된 위 꼭지점에 사각형의 하단 왼쪽된 꼭지점 설정., 결과 선 A. 정의 4 경도 정 맥의 앞쪽 라인의 끝점에서 수직 라인을 얻기에 수직 라인과 포인트 B (그림 2B)로 제 3 경도 정 맥의 후부 라인의 교차로 지점.
      11. X 좌표와 y 좌표 지점 B, B 지점에 커서를 배치할 때 영역 선택 도구 아래 표시의 기록
    3. 포인트 C, 후부 crossvein 자리의 정의
      1. 후부 crossvein 자리는 이미지의 중앙에 이미지를 엽니다. 이미지 클릭 | 유형 | 8-비트 | 8 비트 이미지에는 이미지를 변환.
      2. 후부 crossvein의 교차 영역에서 4 경도 정 맥 및 4 경도 정 맥 (그림 2C)의 앞쪽 라인의 후부 맨 지점으로 포인트 C를 정의 합니다.
      3. X 좌표와 y 좌표 포인트 C, 포인트 c에서 커서를 배치할 때 영역 선택 도구 아래 표시의 기록
    4. 점 d, 컨트롤 영역 정의
      1. Campaniform sensillum 자리는 이미지의 중앙에 이미지를 엽니다. 이미지 클릭 | 유형 | 8 비트 | 8 비트 이미지에는 이미지를 변환 합니다.
      2. 스트레이트 라인 선택 도구에서를 클릭 하 고 두 번째 경도 정 맥의 앞쪽 라인과 4 경도 정 맥의 후부 선의 끝점의 끝점을 연결 하는 선은 그립니다. 이 라인과 3 경도 정 맥 (그림 2D)의 후부 라인의 교차점으로 점 D를 정의 합니다.
      3. X 좌표와 y 좌표 포인트 D, 커서 포인트 d 배치할 때 영역 선택 도구 아래 표시의 기록
  4. 측정
    1. (대 한 점 A의 측정 센터에서 포인트와 이미지를 열고) 날개 명소의 이미지 중 하나를 엽니다. 이미지 클릭 | 유형 | 8 비트 | 8 비트 이미지에는 이미지를 변환 합니다.
    2. 사각형 영역 선택 도구 를 클릭 하 고 이미지 창의 약 1/9 크기의 사각형을 그립니다.
    3. 편집을 클릭 합니다 | 선택 | 지정 |. 타원형 및 가운데 열을 확인 합니다. 너비 와 높이 열에 100 (픽셀)를 작성, A (또는 B 지점 또는 지점 C)의 x 좌표를 작성 및 X 좌표 열 및 쓰기 y A 지점의 좌표 (포인트 B 또는 포인트 C) D와 D Y 좌표 열에. 확인을 클릭 합니다.
    4. 클릭 분석 | 측정 |. 5.2에서 설명한 보정 이미 완료 되었습니다, ODs 의미 열에 표시 됩니다.
    5. ΔODs 점 A, B 및 c.의 ODs에서 OD의 점 D를 빼서 계산
      참고: 포인트 D 날개의 투명 한 부분에 착 색, 포함 되지 않습니다 고 따라서 배경 컨트롤을 위해 적당 하다.

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결과

D. guttifera 의 번데기 기간 17 단계 (P1-P15(ii), 단계 (P1, P5-6, P10) 그림 3, 그리고 모든 17 단계는 그림 4에 나와 있는 표시 됩니다 3 명의 대표자의 이미지)으로 나누어져 있습니다. 베인 브리지 및 Bownes17 20 단계 D. melanogaster인정, 이러한 단계 중 일부 수 하지에 적용할 D. guttifera. 2 개의 발달 이벤트의 순서, 노란 몸 (midgut26내 창 고 세포의 질량)의 모양 및 녹색, 터 닝 말 tubules의 타이밍 제어 되지 않습니다 엄격 하 게 D. guttifera에 그리고 그러므로 우리가 P5를 분리할 수 없었다 (i ), P5(i...

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토론

설명 여기 번데기 단계의 정의 대 한 프로토콜 번데기 단계의 기간 및 디 guttifera에서 날개에 검은 반점의 강렬의 측정 측정 자세한 관찰에 대 한 puparium를 제거 합니다. 이러한 프로토콜 많은 초파리 에 대 한 적용할 수 있으며 비행 종, 특히 종 날개 색소와 관련.

깊이 있는 관찰과 자세한 개발 이벤트의 설명 것 하위 단계의 추가 사용. 많은 경우에, 요구 해 부 나는 번데기의 단면 발달 이벤트 단계 정의에 적합 하지 않습니다, 그리고 개별 어렵다 하나 준비에 대 한 번데기를 죽 일 하 여 추가의 사용 때문에. 새로운 초파리 의 사용에 대 한 첫 번째 단계로 발달 이벤트는 puparium 외부에서 구별할 수를 고용 해야 하나. 연구의 목적에 따라 하나 수 있습니다 다음 더 세분화 단계 특정 organogenesis 또는 다른 발달 이벤트에 따라.

여러 단계의 inte...

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공개 사항

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

감사의 글

우리 감사 Sean B. Carroll와 토마스 베르너 비행 주식, 장비에 대 한 나 오 유키 퓨즈, 촬영, 멘토링에 대 한 Kiyokazu 아가타와 엘리자베스 나카지마 영어 편집을 위한 그의 지원에 대 한 병 석 진 제공. 이 작품은 KAKENHI에 의해 지원 되었다 17 K 19427와 다케다 과학 재단.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Drosophila guttiferaThe Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego15130-1971.10Drosophila guttifera, 이 기사에 사용된 초파리 종
플라스틱 바이알HightechMKC-30플라스틱 바이알, 플라이 스톡 유지 관리용
Buzz plugs 바이알 및 병 마개 유리 바이알용Fisher ScientificAS-271셀룰로오스 플러그, 플라이 스톡 유지 관리 용
백색 연질 설탕Mitsui SugarJ-500g백색 연질 설탕, 표준 옥수수 가루 / 설탕 / 효모 / 한천 식품
옥수수 가루Nippon Flour MillsF옥수수 가루, 표준 옥수수 가루 / 설탕 / 효모 / 한천 식품
옥수수 가루 - CNippon Flour MillsGC옥수수 가루 - C, 표준 옥수수 가루 / 설탕 / 효모 / 한천 식품
한천 분말마츠키 칸텐 산업No.602한천 분말, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품
드라이 맥주 효모아사히 식품 & 헬스케어Y2A건조 맥주 효모, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품용
부틸 p-하이드록시벤조에이Nacalai Tesque06327-02부틸 p-하이드록시벤조에이트, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품용
에탄올Wako057-00456에탄올, 표준 옥수수 가루/설탕/효모/한천 식품용
플랫 바텀 마이크로튜브Ina OpticaCF-01501.5mL 마이크로튜브, 용 번데기
수집 CAPSULEFUGETomyPMC-060미니 마이크로 원심 분리기, 번데기 수집용
멸균 샬레 NBSansei Medical01-013플라스틱 페트리 접시(직경 90mm x 높이 15mm)
세럼 튜브 랙이와키9796-050번데기 관찰용 습한 챔버로 사용
Corning Falcon Easy-Grip 조직 배양 접시코닝353001플라스틱 페트리 접시 (지름 35mm × 높이 10mm)
팔콘 표준 조직 배양 접시코닝353002플라스틱 페트리 접시 (지름 60mm × 높이 15mm)
푸시 핀Kokuyo51233709푸시 핀, 마이크로 튜브 뚜껑에 핀 홀 만들기용
실체 현미경OlympusSZX16실체 현미경, 형태 관찰
용 디지털 카메라OlympusDSE-330-A디지털 카메라, 이미징용
NICETACK 양면 테이프니치반NW-15SF양면 테이프, 번데기 제거용
Dumont #5 집게Fine Science Tools11252-20집게, 번데기 제거용
Van Gogh VISUAL 페인트 브러시Talens JapanGWVR-#5/0페인트 브러시, 번데기 제거용
Greiner CELLSTAR 12 웰 세포 배양 플레이트Merck665-18012웰 세포 배양 플레이트, 번데기 주기 지속 시간 측정용
NaClWako191-01665NaCl, PBS
KClNacalai Tesque285-14KCl, PBS
Na2HPO4· 12H2OWako196-02835Na2HPO4· 12H2O, PBS
KH2PO4Nacalai Tesque28721-55KH2PO4용, PBS
Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0Edmund Optics64-384Stepped density filter용, 색소 침착 측정 보정 용
ImageJ 소프트웨어NIH1.8.0-101ImageJ 소프트웨어, 날개 (https://imagej.nih.gov)의 검은 반점 강도 측정용
FINE FROST 유리 슬라이드Matsunami Glass IndFF-001유리 슬라이드, 날개의 검은 반점 강도 측정
용 사각형 현미경 커버 유리 18 x 18Matsunami GlassInd C018181커버 슬립, 날개의 검은 반점의 강도를 측정하기 위한 것입니다.
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참고문헌

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