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방법 논문

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

10.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56943

⸱

2018년 3월 21일

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

이 논문에서

요약

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

초록

그것은 관리와 암 환자에 대 한 특정 분자 표적된 약의 치료 전에 암에서 mutational 상태를 결정 하는 중요 한입니다. 임상 설정에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 유전자 테스트를 위한 널리 사용 됩니다. 그러나, FFPE DNA는 일반적으로 손상 되 고 포 르 말린으로 고정 과정 조각. 따라서, FFPE DNA는 때로는 낮은 품질 및 수량 DNA의 유전자 검사에 적합 하지. 여기 우리가 터치 인쇄물 세포학 (TIC), 암 세포에서 게놈 DNA를 현미경으로 관찰 될 수 있는 방법 제시. 셀 형태 및 암 세포 숫자는 TIC 견본을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 또한, TIC 샘플에서 게놈 DNA 추출 2 이내에 완료할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 얻은 TIC DNA의 품질과 총 FFPE DNA 보다 높았다. 이 신속 하 고 간단한 방법 연구를 결과 보고에 대 한 처리 시간을 단축 하 고 유전자 검사 (예를 들어, 다음 세대 시퀀싱 분석, 디지털 PCR 및 양적 실시간 PCR)에 대 한 높은-품질 DNA를 수 있습니다.

서론

차세대 시퀀싱 기술 제공 하고있다 연구팀은 유전자 변형, Mendelian 질병, 유전 경향, 및 암 1,2,3 게놈 정보 분석에 중요 한 발전 . 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 및 국제 암 게놈 컨소시엄 (ICGC) 유전 변경 일반적인 암4의 여러 종류의 식별을 추구 했습니다. 수백 개의 필수 암 드라이버 유전자 성공적으로 확인 되었습니다, 그리고 이러한 분자의 일부 약물 개발1,,56타겟이 되고있다.

임상 설정에서 FFPE 표본 병 적인 진단과 분자 암 등 각종 질병에 대 한 테스트를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 포 르 말린으로 고정 과정 DNA-단백질 또는 DNA-DNA cross-linking과 DNA 파편을 유도. 따라서, FFPE DNA 샘플 적합 하지 않습니다 항상 유전자 분석에 대 한 낮은 질 및 양의 DNA7,,89. 또한, 고 기술 섹션을 정확 하 게 준비 해야 하는 FFPE 표본 준비를 몇 일 걸립니다. 따라서, 그것은 높은-품질 그대로 DNA를 얻기 위한 간단 하 고 빠른 방법을 개발 하는 것이 좋습니다.

세포학 병 적인 진단 위한 대체 방법입니다. Cytological 샘플 준비는 간단 하 게, 덜 FFPE 준비10에 비해 비싸고 더 빠른 접근 이다. TIC 기술 센 티 넬 림프절과 몇 년11,12자가 빠른 진단을 위해 유방암 환자에서 한계 조직에 수행 되었습니다. 그러나, TIC 표본에서 높은-품질 게놈 DNA를 추출할 수 있습니다 여부를 조사 하 고 후속 유전자 분석에 사용 되는 몇 가지 보고 있다. Cytological 표본은 일반적으로 물 들일 Papanicolaou (Pap) 또는 Giemsa 얼룩, 그리고 우리 이전 TIC 표본 (특히 Giemsa 얼룩이 샘플)에서 추출한 DNA의 품질과 양을 FFPE에서 얻은 샘플을 우수 하다는 것을 보고 조직13. Pap 얼룩과 비교, Giemsa 얼룩 장점이 덜 착 절차 요구에 있습니다. Pap 얼룩에 샘플 수정 되 고 스테인드, 후 그들은 해야 합니다 탑재할 종양 세포, 정상 세포를 현미경으로 염증 세포 등 샘플 내용을 구별을 위한 매체 (예, Malinol)를 장착. Pap 견본 설치 단계 없이, 준비 하는 경우 거의 불가능 한 표본은 건조 하기 때문에 현미경으로 세포를 관찰 하는 것 아니다. 비교에서는, Giemsa 얼룩 말린된 상태에서 관찰 될 수 있다, 그러므로, 설치 단계 빠른 세포 평가 위해 필요 하지 않습니다. 서, 대 한 Giemsa 얼룩은 더 적당 한 건조 표본 필요 하기 때문 에입니다.

이 보고서에서 우리 TIC 표본을 Giemsa 얼룩과 준비에 대 한 간단 하 고 빠른 방법을 소개 하 고 TIC가 더 나은 FFPE 표본에 비해 DNA에 대 한 설명.

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프로토콜

1. TIC 대비 빠른 현미경 평가 일반 유리를 사용 하 여 슬라이드

  1. 임상 병리학 조직 재료 사용할 수 있는 후 최대한 빨리 TIC 준비를 수행 합니다. TIC 표본 즉시 준비 수 없습니다, 경우 멸 균 거 즈 염 습으로 덮여 조직 자료를 유지 하 고 조직의 건조를 방지 하기 위해 냉장고에 보관.
  2. 5mm3 조직 소재 고체 종양 (예를 들어, 간, 폐, 그리고 유 방 조직) 등 수술이 나 내 시경으로 얻은 임상을 준비 합니다.
    1. 부드럽게 살 균-거 즈로 생리 식 염 수와 코팅 조직 닦 고 조직 표면에 혈액의 많은 경우, 혈액을 제거.
    2. 생 검 자료 등 현미경 표본에 대 한 멸 균 거 즈 생리 식 염 수에 담가 적신 샘플 계속.
  3. 잘라 정상적인 조직 트리밍 칼으로 손질 하 고 종양 질량 전부 표시 되지 않는 경우 종양 병 변의 표면 노출.
  4. 여러 번 gloved 손 가진 정상적인 유리 슬라이드에 절제 표본의 종양 표면 터치. 시각적으로 확인 하는 감동된 지역 일반 유리 슬라이드의 80% 이상 이다.
  5. 가볍게 폴 리 에틸렌 naphthalate (펜) 막 슬라이드에 대 한 일반 유리 슬라이드를 누르고 gloved 손을 가진 2-3 회를 부드럽게 문 지. 시각적으로 확인 하는 셀 펜 막 슬라이드에 일반 유리 슬라이드에서 전송 됩니다.
  6. 유리 및 실 온에서 5 분에 대 한 펜 막 슬라이드 건조.
  7. 직접 cytological 시험에 대 한 일반 유리 슬라이드를 얼룩. 5 s, 통 솔루션 유리 슬라이드와 Giemsa 얼룩 15에 대 한 솔루션을 다음 얼룩이 찍어 s.
  8. 평가 하 고 전체로 빠른 평가 위한 현미경 종양 내용과 cellularity 일반 유리 슬라이드에 화면. 종양 세포; 여러 기준에 따라 평가 핵 확대, 비정상적인 karyotype, 풍부한 chromatin, 셀의 부동 한 배급, 핵 구성 요소/세포질 구성 요소, 셀 크기 및 세포 극성의 비율.

2. 유전자 검사를 위한 펜 막 슬라이드 필름의 준비

  1. 샘플 종양 cellularity 경우 빠른 현미경 평가 (1.8), 단계에 의해 60% 이상의 DNA 추출에 대 한 펜 막 슬라이드의 종양 감동 영화 칼으로 잘라내어 gloved 손. pincette와 gloved 손 살 균 microcentrifuge 튜브 컷된 영화 전송.
  2. 종양 cellularity 낮은 (종양 내용의 60% 미만) 빠른 현미경 평가 (단계 1.8)에 의해 결정 되었다, 레이저 캡처 서 사용 하 고 종양 샘플을 얻을.
    1. 평가 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 종양 세포를 얼룩이 지기 Giemsa 수행 합니다.
    2. 적절 한 레이저 캡처 기정에 의해 PEM 막 슬라이드 필름을 잘라.
    3. pincette와 gloved 손 살 균 microcentrifuge 튜브 컷된 영화 전송.
    4. (프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기) DNA 추출까지 4 ° C에서 포함 하는 필름 microcentrifuge 튜브를 저장 합니다.

3. DNA 추출

  1. 제조업체의 지침에 따라 FFPE DNA 추출 키트를 사용 하 여 사소한 수정 TIC 또는 FFPE 조직 샘플에서 DNA 추출을 수행 합니다. 해당 키트는 FFPE DNA 추출 단계 수 있습니다.
  2. 180 µ L의 조직 세포의 용 해 버퍼를 추가 (pH = 8.3) 수동 200 µ L 피 펫과 영화 포함 된 microcentrifuge 관에. 5에 대 한 최대 속도 (약 2500 rpm)와 동 믹서와 vortexing에 의해 수동 20 µ L 피 펫과 혼합 성분 K의 20 µ L를 추가 s.
  3. 공기 인큐베이터와 56 ° C에서 샘플 밤새 품 어.
  4. 각각 1 h 10 분에 대 한 열 블록에 90 ° C에서 FFPE TIC 샘플을 품 어. 짧게 1500 x g 5에서 microcentrifuge 튜브 아래로 회전 미니 원심 분리기와 실 온에서 s.
  5. 5에 대 한 최대 속도에서 vortexing에 의해 철저 하 게 세포의 용 해 버퍼의 200 µ L 200 µ L 피 펫과 혼합 샘플에 추가 s.
  6. 200 µ L 피 펫과 에탄올 (96-100%)의 200 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합 vortexing 5에 대 한 최대 속도에 의해 짧게 s. 1500 x g 5에서 microcentrifuge 튜브 아래로 회전 미니 원심 분리기와 실 온에서 s.
  7. 조심 스럽게 전체 lysate 1000 µ L 피 펫 및 25 ° c.에 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기 회전 열을 전송
  8. 장갑 낀 손으로 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 스핀 열을 놓고 흐름 통해 플라스틱 처리 상자에 포함 된 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
  9. 워시 버퍼의 500 µ L 1000 µ L 피 펫 및 25 ° c.에 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기 회전 열에 추가
  10. 장갑 낀 손으로 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 스핀 열을 놓고 흐름 통해 플라스틱 처리 상자에 포함 된 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
  11. 워시 버퍼의 500 µ L 1000 µ L 피 펫 및 25 ° c.에 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기 회전 열에 추가
  12. 플라스틱 처리 상자에 통해 흐름 포함 하는 컬렉션 튜브를 삭제 합니다. 장갑 낀 손으로 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 스핀 열을 놓고 막 건조 25 ° C에서 3 분 20000 x g에서 원심.
  13. Gloved 손 가진 DNA-낮은 바인딩 튜브에 스핀 열을 배치 합니다.
    1. 100 µ L 피 펫과 막의 중심을 차입 버퍼의 40-50 µ L를 추가 합니다.
    2. 5 분 및 25 ° c.에 1 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기에 대 한 실 온에서 품 어
    3. (프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기) 다음 단계까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.

4. 양적 실시간 PCR에 의해 DNA 품질의 추정

  1. 피 펫, 멸 균 microcentrifuge 튜브에 마스터 믹스를 다음과 같이 준비: 10 µ L 실시간 PCR 주인 혼합, 20의 1 µ L x 2의 RNase P 뇌관 프로브 믹스 x (amplicon 크기: 87 혈압), 그리고 살 균 nuclease 무료 물 8 µ L.
  2. 다음과 같이 한 살 균 microcentrifuge 튜브에 두 번째 마스터 믹스를 준비: 10 µ L 실시간 PCR 주인 혼합, 20의 1 µ L x 2의 RNase P 뇌관 프로브 믹스 x (amplicon 크기: 268 bp), 그리고 살 균 nuclease 무료 물 8 µ L.
  3. 5 포인트 표준 곡선에 대 한 인간의 제어 genomic DNA (키트에 제공 된)의 직렬 희석 4 번을 수행 하 고 절대 DNA 농도13를 결정 합니다.
  4. 20 µ L 피 펫과 광학 96-잘 반응 판의 별도 우물에 두 준비 마스터 믹스 (4.1 및 4.2 단계에서 준비)의 19 µ L를 추가 합니다.
  5. 2 µ L 피 펫 반응 혼합을 포함 하는 우물을 분리 하는 FFPE DNA 또는 TIC DNA의 1 µ L를 추가 합니다. 없는 템플릿 컨트롤에 대 한 반응 혼합을 포함 하는 별도 잘으로 nuclease 무료 물 1 µ L를 추가 합니다.
  6. 광학 접착제 필름 비 접착제 면을 보유 하 고 다시이 영화의 중심에서 백업 보호 껍질. 부드럽게 주걱 필름 끌어서 96 잘 접시 위에 영화 인감.
  7. 부드럽게 혼합 96 잘 접시 10 96 잘 접시 믹서를 사용 하 여 s 2000 rpm에서 실내 온도에. 잠시 실 온에서 3 분 1000 x g에서 격판덮개 원심
  8. 실시간 PCR 장비 및 삽입 96 잘 접시에 힘. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 20 95 ° C s 1 s 및 20 60 ° C s. 사용 "표준 곡선" 및 "고속 모드"에 대 한 95 ° C의 45 주기 다음
  9. DNA (상대 정량화;의 비율 DNA 파편을 평가 RQ) 긴 amplicon 획득 (268 bp) 짧은 amplicon에 (87 bp). RQ는 짧은 amplicon13의 긴 amplicon/는 평균 값의 평균 값입니다.

5. 다음 세대 시퀀싱 라이브러리 준비

  1. 제조업체의 지침에 따라 다음 세대 시퀀싱 시퀀싱 라이브러리를 준비 합니다.
  2. 샘플 당 살 균 microcentrifuge 관에서 다중 PCR 마스터 믹스를 다음과 같이 준비: 멀티플렉스 PCR 반응 솔루션, 뇌관 수영장, ≤6 µ L TIC 또는 FFPE DNA (1-100 ng), x 5의 4 µ L x 5의 4 µ L 20 µ L까지 물을 nuclease 무료 추가.
    1. PCR 튜브와 믹스를 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스 추가 부드럽게 튜브를 활용 하 여.
    2. 짧게 1500 x g 5에서 microcentrifuge 튜브 아래로 회전 미니 원심 분리기와 실 온에서 s.
  3. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 99 ° C의 20 주기 다음 2 분 동안 99 ° C 15 s 및 4 분 및 지주를 위한 60 ° C에 10 ° c.를 단계 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
    참고: 뇌관 쌍의 수에 따라 사이클의 수를 결정 합니다.
  4. PCR 튜브의 뚜껑 열고 2 µ L 피 펫으로 제한 효소의 2 µ L를 추가 합니다. PCR 튜브 두 드려서 부드럽게 PCR 튜브와 섞어 덮개를 닫습니다. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
  5. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 10 분, 10 분, 20 분 동안 60 ° C에 55 ° C 50 ° C 그리고 지주 단계 10 ° c. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
  6. 추가 어댑터 결 찰 마스터 믹스는 각 잘 포함 하는 피 펫과 소화 PCR amplicons 같습니다으로: 어댑터 결 찰 솔루션의 4 µ L, 바코드의 0.5 µ L, 어댑터의 0.5 µ L, 2 µ L nuclease 무료 물 및 DNA 리가의 2 µ L. 두 드려서 부드럽게 PCR 튜브와 섞어 덮개를 닫습니다. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
  7. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 30 분, 5 분, 5 분, 72 ° C 68 ° C 22 ° C 그리고 지주 단계 10 ° c.
  8. 제조업체의 지침에 따라 자석 구슬 시퀀싱 라이브러리를 정화.
  9. 1.5 mL DNA 낮은 바인딩 튜브에 어댑터 출혈 라이브러리 솔루션을 전송 합니다. 1세인트 정화에 대 한 DNA 낮은 바인딩 튜브에 자석 구슬의 45 µ L를 추가 합니다. 튜브를 두 드려서 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  10. 마그네틱 랙에 DNA-낮은 바인딩 튜브 장소 다음 솔루션은 분명 때까지 실 온에서 2 분 동안 품 어. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고 200 µ L 피 펫과 상쾌한 폐기.
  11. 200 µ L 피 펫과 갓된 70% 에탄올의 150 µ L를 추가한 다음는 튜브 사이드-투-사이드 씻어 구슬 자석의 이동. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고는 상쾌한 폐기.
  12. 두 번째 세척에 대 한 단계 5.11를 반복 합니다.
  13. 짧게 회전 튜브 미니 원심 분리기에서 1500 x g 5와 실 온에서 s. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 에탄올 방울 10 µ L 피 펫을 신중 하 게 삭제 합니다.
  14. 분산 구슬 자석 구슬 펠 릿을 포함 하는 DNA 낮은 바인딩 관으로 낮은 테의 50 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 2 분 동안 품 어.
  15. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 솔루션은 분명 때까지 2 분 동안 실 온에서 품 어.
  16. 새로운 DNA 낮은 바인딩 관으로 상쾌한의 50 µ L를 전송 하 고 2nd 정화에 대 한 100 µ L 피 펫과 자석 구슬의 75 µ L를 추가 합니다. 튜브를 두 드려서 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  17. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브 장소 다음 솔루션은 분명 때까지 실 온에서 2 분 동안 품 어. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고 200 µ L 피 펫과 상쾌한 폐기.
  18. 200 µ L 피 펫과 갓된 70% 에탄올의 150 µ L를 추가한 다음는 튜브 사이드-투-사이드 씻어 구슬 자석의 이동. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고는 상쾌한 폐기.
  19. 두 번째 세척에 대 한 5.18 단계를 반복 합니다.
  20. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 튜브 스핀 실 온에서 s. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 에탄올 방울 10 µ L 피 펫을 신중 하 게 삭제 합니다.
  21. 분산 구슬 자석 구슬 펠 릿을 포함 하는 DNA 낮은 바인딩 관으로 낮은 테의 50 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 2 분 동안 품 어.
  22. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 솔루션은 분명 때까지 2 분 동안 실 온에서 품 어.
  23. 100 µ L 피 펫과 새로운 DNA 낮은 바인딩 관으로 순화 된 라이브러리를 포함 하는 상쾌한의 45 µ L를 전송 합니다.

6. 계량 양적 실시간 PCR에 의해 도서관 농도

  1. 제조업체의 지침13에 따라 각 도서관의 농도 결정 합니다.
    1. 다음과 같이 20-fold 희석 솔루션 준비: 믹스 2 µ L의 순화 된 라이브러리와 DNA 낮은 바인딩 튜브에서 nuclease 무료 물 38 µ L 2 µ L 및 100 µ L 피 펫.
    2. 7.3 단계까지-20 ° C에서 undiluted 라이브러리를 저장 합니다.
  2. 다음과 같이 200-fold 희석 솔루션 준비: 20-fold 희석된 순화 라이브러리 (단계 6.1에서에서 준비)의 5 µ L을 혼합 및 DNA 낮은 바인딩 튜브에서 nuclease 무료 물 45 µ L.
  3. 다음과 같이 2,000-fold 희석 솔루션 준비: 200-fold 희석된 순화 라이브러리 (6.2 단계에서 준비)의 5 µ L을 혼합 및 DNA 낮은 바인딩 튜브에서 nuclease 무료 물 45 µ L.
  4. 다음과 같이 반응 마스터 믹스를 준비: 믹스 마스터 믹스 솔루션 x 2의 10 µ L와 살 균 microcentrifuge 튜브에 뇌관-조사 분석 결과 솔루션 x 20의 1 µ L를 피펫으로 다음 튜브를 활용 하 여 섞는다. 광학 96-잘 반응의 우물에 반응 마스터 믹스의 11 µ L를 추가 합니다.
  5. 각 잘 10 µ L 피 펫을 2,000-fold 희석된 라이브러리의 9 µ L, 각 표준 컨트롤의 9 µ L 또는 nuclease 무료 물 9 µ L를 추가 합니다.
  6. 광학 접착제 필름 비 접착제 면을 보유 하 고 다시이 영화의 중심에서 백업 보호 껍질.
    1. 부드럽게 주걱 필름 끌어서 96 잘 접시 위에 영화 인감.
    2. 부드럽게 혼합 96 잘 접시 10 96 잘 접시 믹서를 사용 하 여 실 온에서 s.
    3. 잠시 실 온에서 3 분 1000 x g에서 격판덮개 원심
  7. 실시간 PCR 장비 및 삽입 96 잘 접시에 힘. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 2 분, 20 95 ° C 50 ° C s, 95 ° C의 40 주기 1 s 및 20 60 ° C s. 사용 "표준 곡선" 및 "고속 모드"에 대 한 다음
  8. 2000 정량으로 정한 농도 곱하여 undiluted 라이브러리 농도 계산 합니다.

7. 다음 세대 시퀀싱

  1. 실행된 상태를 계획 하 고 소프트웨어 실행된 매개 변수를 설정 합니다.
    1. [계획 탭]을 클릭 하 고 [템플릿], 적절 한 실행된 방법 선택.
    2. 응용 프로그램 및 기술 유형을 선택 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    3. 선택 악기, 샘플 준비 키트 (옵션), 라이브러리 키트 형식, 템플릿 키트, 시퀀싱 키트, 보정 모드를 기본, 칩 유형, 컨트롤 시퀀스 (옵션), 그리고 바코드 집합 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    4. 플러그인을 선택 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    5. 프로젝트를 선택 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    6. 기본 참조 및 대상 영역의 침대 파일을 선택 합니다.
    7. 샘플 이름 입력, 바코드를 선택 하 고 [실행 계획]을 클릭 합니다.
  2. 서식 파일 준비를 수행 하 고 제조업체의 지침에 따라 자동된 악기에 로드 칩. 시 약 카트리지 사용 하기 전에 45 분 동안 실 온에서 녹여
  3. Undiluted 라이브러리 라이브러리 농도 단계 6.8에서에서 계산에 따르면 nuclease 무료 물으로 희석 하 고 20 오후 라이브러리.
    1. 시퀀싱 및 저장소 얼음에 풀링된 라이브러리를 준비 합니다.
    2. 샘플 튜브의 아래쪽에는 풀링된 도서관 100 µ L 피 펫 25 µ L를 추가 합니다. 48 h 이내 풀링된 라이브러리를 사용 합니다.
  4. 전원을 켜고 자동된 악기의 덮개를 엽니다.
    1. 시퀀싱 칩, 칩 어댑터, 농축 카트리지, 카트리지 팁, PCR 플레이트, PCR 프레임 물개, 복구 튜브, 솔루션 카트리지, 및 시 약 카트리지 자동된 악기의 적절 한 위치에 놓습니다.
    2. 터치 [설치 실행]과 [단계적] 화면에.
    3. 덮개를 닫고 [확인 시작] 화면에 터치.
    4. 갑판 후 스캔 프로세스, 화면에서 [다음]을 터치 합니다.
    5. 표시 내용 (키트 유형, 칩 유형, 칩 ID, 샘플 ID 계획)를 확인 하 고, 시간 설정 화면에서 [확인]을 터치.
  5. 칩 로드를 마치고:
    1. 화면에서 [다음]을 터치 하 고 덮개를 엽니다.
    2. 장갑 낀 손으로 칩 어댑터에서 시퀀싱 칩을 언로드.
    3. 칩 칩 컨테이너에 배치 parafilm와 저장소 시퀀싱 반응까지 4 ° C에서 랩.
    4. 장갑 낀 손으로 자동된 악기의 적절 한 위치에서 농축 카트리지, PCR 플레이트, PCR 프레임 물개, 복구 튜브, 솔루션 카트리지, 및 시 약 카트리지를 제거.
    5. 장갑 낀 손으로 자동된 악기의 폐기물 팁 위치에 빈 팁 카트리지를 전송 합니다.
    6. [다음]을 터치 하 고 커버를 닫습니다.
    7. [시작]을 터치 하 고 4 분에 대 한 자외선에 의해 자동된 악기를 청소.
  6. 나트륨 chlorite 태블릿 초순과 0.22 μ m 필터 흐름 필터 장치 필터 솔루션의 1000 mL에 용 해.
    1. 전원 시퀀싱 악기에.
    2. [클린] 터치 및 시퀀싱 악기의 화면에서 [다음].
    3. 250 mL 필터 소독 나트륨 아 염소 산 염 해결책의 및 초순 이후 250 mL와 시퀀싱 악기 청소.
  7. [초기화]를 터치 하 고 화면에 적절 한 시퀀싱 키트를 선택 합니다.
    1. 장갑 낀 손으로 적절 한 위치에 회색 화주를 설치 합니다.
    2. 세척 솔루션 (키트에 제공), pH 조정 솔루션 (100 m m 수산화 나트륨의 350 µ L을 포함 하는)와 (키트에 제공) pH 표준 솔루션 시퀀싱 악기를 초기화 합니다.
  8. 100 µ L 피 펫을 50 mL 튜브 (키트에 제공 된)에서 (키트에 제공 되는) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 뉴클레오티드의 20 µ L를 추가 합니다.
    1. 장갑 낀 손으로 적절 한 위치에 회색 화주를 설치 합니다.
    2. 50 mL 튜브 및 나사 시퀀싱 악기에 로드 합니다.
    3. 초기화 단계는 약 25 분 소요를 시작 하는 화면에서 [다음]을 터치 합니다.
  9. 초기화 단계를 완료:
    1. 화면에서 [실행]을 터치 하 고 적절 한 라이브러리 준비 악기를 선택 합니다.
    2. 칩의 2 차원 바코드를 스캔.
    3. 적절 한 위치에 시퀀싱 칩을 삽입 합니다.
    4. 칩 클램프 및 악기 문을 닫습니다.
    5. [칩 확인], [다음], 및 시퀀싱 실행 시작 화면에서 [확인].
  10. 시퀀싱 반응 후 데이터를 전송 하 고 시퀀싱 서버13,17에 파이프라인 데이터 분석을 수행 합니다.

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결과

그림 1 에서 DNA 추출 TIC 표본을 준비 전체 프로세스를 보여 줍니다. 특히, 절차 TIC 샘플에서 게놈 DNA를만 2 일 걸립니다. 우리는 슬라이드 처리 하기 전에 종양 스토리지의 어떤 효과 평가합니다. 우리는 조직 표본을 즉시 슬라이드에 감동 했다 그리고 염 분 moistened 살 균-거 즈에 1 h (그림 2)에 대 한 조직을 유지 했다 종양 세포를 유리 슬라이드에 연결 된 발견. 그러나, 조직 실 온에서 보관 했다 때 종양 세포 했다 잘 연결 되지 슬라이드에. 준비 슬라이드 3 개월간 4 ° C에서 저장 될 수 있었다. 따라서, 그것은 건조 표본 수 있도록 중요 하지 않습니다.

우리는 우리의 방법의 유틸리티를 검사 하 고 표본 FFPE를 사용 ...

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토론

이 연구에서 우리는 콩을 사용 하 여 임상 병리학 표본에서 종양 DNA를 얻기 위해 다른 방법을 제시. TIC 준비는 매우 간단 하 고 특별 한 악기10에 대 한 요구 사항 없이 FFPE 방법에 비해 더 적은 시간이 필요. (그림 1) 2 이내 TIC 준비에서 DNA 추출에 모든 절차를 완료할 수 있습니다. 이 메서드는 따라서 유전자 검사를 수행 하기 위한 처리 시간이 줄어듭니다. 특히, 분자 분석에 필요한 일 수 단축에 상당한 이점을 제공 합니다. 이 짧은 처리 시간 즉시 분자로 대상된 약물을 필요로 하는 진보적인 암 환자에 대 한 적절 한 치료를 제공할 수 있습니다. 따라서이 방법은 종양에서 유전 변경의 분석 및 암 치료에 대 한 분자로 대상된 약물의 관리에 대 한 혜택을 제공합니다.

TIC DNA 유전자 분석에 대 한 사용의 성공에 대 한 몇 가지 핵심 포인트 들이 있다. 종양 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 병원과 환자 들의 의료 및 보조 직원 참여 동의 감사. 우리는 가브리엘 화이트 울프,이 보고서의 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac)에서 박사 학위를 감사 합니다. 이 연구는 야마나시 현 (Y.H. 고 지)에서 게놈 연구 프로젝트와 부여에서는 야스다 의료 재단 (Y.H.)는 특정에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
FINE FROST white20 마이크로 슬라이드 유리Matsunami Glass ind, LtdSFF-011
Arcturus PEN 멤브레인 유리 슬라이드Thermo Fisher ScientificLCM0522
Cyto Quick A 솔루션Muto Pure Chemicals20571
Cyto Quick B 솔루션Muto Pure Chemicals20581
May-Grunwald 솔루션Muto Pure Chemicals15053
Giemsa 용액Muto Pure Chemicals15002
QIAamp DNA FFPE 조직 키트Qiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
TaqMan RNase P 검출 시약 키트Thermo Fisher Scientific4316831
FFPE DNA QC 어세이 v2의 TaqMan 어세이Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well 반응 플레이트 Thermo Fisher Scientific4346907
MicroAmp 광학 접착 필름Thermo Fisher Scientific4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificVIIA7-03
Himac CF16RXIIHitachi-kokiCF16RII
이온 라이브러리 TaqMan 정량 분석 키트Thermo Fisher Scientific4468802
Ion AmpliSeq 암 핫스팟 패널 v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq 라이브러리 키트 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress 바코드 어댑터 1-16 키트Thermo Fisher Scientific4471250
Ion PGM Hi-Q View 염기서열분석 키트(200 base)Thermo Fisher ScientificA30044
Ion Chef SystemThermo Fisher Scientific4484177
Veriti 96-well Thermal CyclerThermo Fisher ScientificVeriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
Ion PGM SystemThermo Fisher ScientificPGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kitThermo 피셔 사이언티픽A25591
Agencourt™ AMPure™ XP KitBeckman CoulterA63881
16-위치 자기 스탠드Thermo Fisher Scientific4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube)Thermo Fisher ScientificAM12450
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp™ 광학 96웰 반응 플레이트Thermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp™ 투명 접착 필름Thermo Fisher Scientific4306311
Agencourt™ AMPure™ XP 키트Beckman CoulterA63881
에탄올(99.5)Nacalai Tesque08948-25
수산화나트륨(10M)시그마72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipet-Lite LTS 피펫 L-2XLS+메틀러 토레도17014393
Pipet-Lite LTS 피펫 L-10XLS+메틀러 토레도17014388
Pipet-Lite LTS 피펫 L-20XLS+메틀러 토레도17014392
Pipet-Lite LTS 피펫 L-100XLS+메틀러 토레도17014384
Pipet-Lite LTS 피펫 L-200XLS+메틀러 토레도17014391
Pipet-Lite LTS 피펫 L-1000XLS+메틀러 토레도17014382
쁘띠 체인지WAKENMODEL8864미니 원심분리기
쁘띠 인큐베이터WAKENWKN-2290에어 인큐베이터
SensiCare 무분유 니트릴 검사 장갑MEDLINESEM486802
멸균 거즈Osaki11138
냉장고 MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLADFEATHERNo.130
FEATHER TRIMMING BLADFEATHERNo.260
FEATHER SFEATHERFA-10
Vortex Genius 3IKA41-0458Vortex mixer
PincetteNATSUMEA-5
1.5 mL 마이크로 튜브바이오빅RC-0150

참고문헌

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