Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

요약

이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.

초록

이 기술의 목적은 많은 수의 다 당 류 캡슐 측정에 대 한 일관 된, 정확한, 및 관리 프로세스를 제공 하입니다.

첫째, 임계값 이미지 강도 값 고유 각 이미지에 대 한 계산에 따라 생성 됩니다. 그런 다음 원형 개체와 확고 원 Hough 변환 (CHT) 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드에 따라 검색 됩니다. 마지막으로, 검색 된 셀 캡슐과 시체 중심 좌표와 반지름 크기, 일치 하 고 데이터 관리 스프레드시트에서 사용자에 게 보내집니다.

이 기법의 장점은 간단 하지만 중요 한입니다. 첫 번째, 이러한 계산 인간 보다는 알고리즘에 의해 수행 되기 때문에 정확성과 신뢰성 증가 된다. 정확성이 나 신뢰성 얼마나 많은 샘플 분석에 아무 하락이 있다. 둘째,이 이렇게 캡슐 측정 연구소에 의해 다릅니다 현재 상황 대신 Cryptococcus 필드에 대 한 잠재적인 표준 운영 절차를 설정 합니다. 셋째, 주어진 있다는 수동 캡슐 측정 느리고 단조, 자동화에 차례로 점점 강력한 통계 및 높은 처리량 데이터 분석을 용이 하 게 하는 효 모 세포의 큰 숫자에 빠른 측정 수 있습니다.

이 기술의 주요 제한 방법에서 온 알고리즘 기능. 첫째, 알고리즘 서클 생성할 것 이다. 동안 Cryptococcus 세포와 그들의 캡슐에 원형 형태, 비 원형 물체 감지에이 기술을 적용할 것은 어려울 것 이다. 둘째, 서클 감지는 어떻게 인해 CHT 알고리즘 여러 클러스터 된 서클의 바깥쪽 가장자리에 따라 거 대 한 의사 원을 검색할 수 있습니다. 그러나, 의사 원 안에 잡힌 안하고 셀 시체 수 있습니다 쉽게 감지 되며 결과 데이터 집합에서 제거.

이 기술은 인도 잉크 밝은 분야 현미경 검사 법;에 따라 Cryptococcus 종의 원형 다 당 류 캡슐을 측정 하기 위한 의미 그것은에 적용 될 수 있지만 다른 대비 원형 개체 측정을 기반으로 합니다.

서론

Cryptococcus neoformans immunosuppressed 인구에서 주로 인간의 질병와 관련 된 전세계 편 발견 병원 성 효 모 이다. C. neoformans 전염병¹인 사하라 총 연간 사망자의 중요 한 원인이 가장 주목할만 하 게 차지 한다. Cryptococcal 감염의 주요 임상 징후는 감염 된 대 식 세포 (트로이 목마 방법)에 전송 하 여 중앙 신경 시스템의 침공을 다음과 같이 meningoencephalitis 또는 혈액-뇌 장벽에의 직접 교차점. C. neoformans 는 인체 온도, urease 활동, melanization, 및 다 당 류 캡슐²의 형성에서 복제 하는 기능을 포함 한 몇 가지 독성 요소를 표현 한다. 다 당 류 캡슐 glucuronoxylomannan와 glucoronoxylomannangalactan 고분자와 기능 호스트 면역 반응²등 환경 스트레스 요인에 대 한 보호벽으로 반복 구성 됩니다.

Cryptococcal 다 당 류 캡슐 크기의 크기 일관 되 게 연관 되지 않은 독성과, 비록 증거가 병 인

프로토콜

1입니다. 인도 잉크 슬라이드의 준비

1. 슬라이드에 cryptococcal 샘플의 10 µ L 플라스틱 모든 원형 효 모 스트레인 작동 하지만이 실험에 대 한 H99 사용 유일한 스트레인.
   참고: 샘플 문화 미디어에서 직접 경우 PBS 또는 물과 1:2 희석 방지할 수 있습니다 인도 잉크 clumping에서.
2. 샘플에 인도 잉크 얼룩의 2 µ L 플라스틱 하 고 물리적으로 샘플을 피 펫 팁을 밀고 하 인도 잉크 균등 하 게 분산 때까지 원운동에서 이동 하 여 혼합.
3. 배치 하는 coverslip 샘플 다음 부드럽게 그리고 균일 하 게 낮추는 coverslip의 반대편 샘플 슬라이드의 표면에 대해 coverslip의 왼쪽된 가장자리를 눌러.
4. 5 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.
5. 부드럽게 하는 물개를 형성 하 고 인도 잉크 얼룩 보존 coverslip 국경 매니큐어의 가벼운 레이어를 적용.

2. 이미지 슬라이드

1. 카메라 부착 및 알려진된 픽셀 미크론 변환 밝은 분야 현미경에 슬라이드를 배치 합니다. 셀 캡슐은 명확 하 고 셀 몸은 초점, 어두운 밴드 필터, 목표, 및 대비를 조정 합니다.
   참고: 다양 한 필터, 목표, 및 대비....

결과

카메라(그림 1)과 함께 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 인도 잉크 슬라이드의 현미경 사용 이미지를 먼저 얻을 수 있습니다. 세포 분리 및 세포와 배경 사이 대조를 만들 충분 한 얼룩을 사용 또한 보기의 필드를 압도 하지 충분히 낮은 밀도를 중요 하다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수 샘플, 현미경, 사용 목적에 따라 달라 집니다. 셀 클러스터 또는 중복 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 측면은, 셀 초점 비행기 크게 다양 하지 않습니다 그리고 그 중요 한 인도 잉크 얼룩 배경 (필드의 적어도 25%)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이러한 방향 평균 픽셀 휘도 값과 표준 편차를 추가 하 여 각 이미지에 고유한 임계값을 결정 하는 알고리즘을 수 있습니다. 강도 값이 말했다 임계값 보다 높은 모든 픽셀은 흰색 간주 됩니다 및 낮은 강도 값을 가진 .......

토론

이 기술의 중요 한 단계는 인도 잉크 슬라이드를 준비 하 고 현미경 이미지를 획득. 알고리즘의 다양 한 슬라이드와 이미지 기술 성공적으로 테스트 되었습니다 동안 권장된 프로토콜이이 원고에 설명 되어 있습니다. 다 당 류 캡슐이이 입자는 너무 커서 다 당 류 fibril 네트워크 침투 캡슐의 도메인에서 인도 잉크 입자의 배제에 기반으로 감지 됩니다. 인도 잉크 제외 어두운 배경 위에 밝은 원 발생합니다. 알고리즘 서클 얼마나 잘 그들은 그들의 배경과 대조에 따라 검색 합니다. 따라서, 다 당 류 캡슐과 배경, 신호 대 잡음 비율을 증가 하 고 결과 품질 향상 간의 높은 대비 무거운 인도 잉크 얼룩 발생 합니다. 반대로, 세포 체는 밝은 배경 위에 어두운 원형으로 감지 됩니다. 세포 체는 현미경으로, 설정 되어 있는 초점면 확산으로 나타나는 원 상단에 회색 또는 셀의 아래쪽으로 센터에서 압축 된 어두운 밴드를 기반으로 모양이 변경 됩니다. 가장 정확한 원 감지에 발생이 같은 이유로 이미 논의 세포 체 압축, 어두운 악대로 나타나는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인도 잉크	Becton, Dickinson and Co.
Fisherbrand Superfrost 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest 프리미엄 커버 유리	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish	Sally Hansen	N/A	109 보이지 않는
SAB 미디어	시그마	S3306
크립토쿠스 neoformans	ATCC	208821	H99 변형
Olympus AX70 현미경	Olympus	AX70TRF	단종되었습니다. 명시야 현미경
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	단종 ; 카메라 현미경 어태치먼트
MATLAB	MathWorks	N/A	가장 최근 권장
Python 프로그래밍 언어	Python	N/A	버전 2 필요 ; 2.7 권장
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	가장 최근 버전 권장
PBS(Phosphate Buffered Saline)	Sigma	P3813

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