방법 논문

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

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DOI:

10.3791/56960

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2017년 12월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

이 논문에서

요약

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

초록

장 조직 생 검을 통해 얻은 또는 감독된 차별화를 통해 만능 줄기 세포에서 생성의 3D 문화 발전 장 점 막의 정교한 생체 외에서 모델에서 이어지고 있다. 이러한 신흥 모델 시스템을 활용 하 여 도구와 2D 문화 시스템 및 동물을 위해 개발 된 기술의 적응이 필요 합니다. 여기, 우리가 실시간으로 인간의 장 organoids에 상피 장벽 침투성을 측정 하기 위한 기술을 설명 합니다. 이것은 붙일 표시 된 dextran 및 epifluorescent 필터를 장착 한 거꾸로 한 현미경에 이미징의 microinjection에 의해 수행 됩니다. 장 organoids에 장벽 침투성의 실시간 측정이이 기술은 고정된 timepoint 이미징 접근에도 적용할 수 있지만 인간의 창 자 상피 조직에서 고해상도 임시 데이터의 생성을 촉진 한다. 이 프로토콜은 쉽게 상피 장벽 침투성 pharmacologic 대리인, 세균성 제품 또는 독 소, 또는 라이브 미생물에 노출 다음의 측정에 대 한 적응력입니다. 약간의 수정이이 프로토콜도 장 organoids의 microinjection에 대 한 일반적인 입문서로 사용할 수 있습니다와 사용자 추가 또는 대체 다운스트림 응용 프로그램 microinjection 다음이 프로토콜을 보완 하도록 선택할 수 있습니다.

서론

장 상피 형성 선택적 장벽 영양소, H2O, 이온, 및 폐기물의 방향 전송 루멘 사이 다른 입자의 일반적인 보급 중재 교환 최소화 하면서 중재 하 고 중간 엽 조직 또는 혈액 공급1,2. 장 상피 방 벽의 일반적인 침투성 오래 간주 되었습니다 건강 및 질병3,,45,6의 속도 반영 하는 주요 기능 매개 변수 작은 분자 paracellular 공간 통해 상피에 걸쳐 확산 상피 장벽 침투성의 측정에서 지휘 될 수 있다 동물 모델7 과 lactulose의 섭취를 통해 인간의 환자8 , 위장, 그리고 이후의 컬렉션에 없는 특정 전송이 그리고 주변 혈액에 있는 농도 lactulose의 측정입니다. 장벽 기능 붙일 레이블된 탄수화물 등의 대체 섭취 마커 사용 가능한9,10도 있습니다. 이 방법은 장 상피 세포 배양 Transwell 지원11, 실험 제어에 대 한만 비보 의 가난한 예언자로 강평 되었다 또한 단순화 된 접근에 대 한 적응 되었습니다. 차별화 된 상피 하위 및 조직 구조12의 부재로 인해 침투성. 챔버를 사용 하 여 또 다른 접근 방식을 나타내고 전체 장 점 막 전 비보13상피 장벽 기능 측정에 대 한 허용. 이 기술의 응용 프로그램은 자주 조직의 가용성 및 조건13,14에 의해 제한 됩니다. 따라서 새로운 방법 생리 관련성 재현성 및 처리량의 균형은 필요 합니다.

Organogenesis 생체 외에서 최근 개발 업과 복잡 한 조직15,16,17의 역학에 대 한 정교한 플랫폼으로 3 차원 조직 배양 모델 시스템의 도입을 이끈 ,18,19,20,21,,2223. 특히, 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 파생 된 인간의 창 자 organoids (HIOs)19,24 호스트 미생물 상호 작용의 연구에 대 한 재현 하 고 실험적으로 세공 모델 시스템으로 등장 하 고 상피 장벽은 역학25,26,,2728. 마찬가지로, 인간의 조직 파생 된 organoids (일컬어 enteroids) 간단한 생 검 절차에서 파생 될 수 있다 고 연구 인간 생리학 및 질병15,,2930세공 시스템으로 사용할 수 있습니다. 인간의 장 organoids의 microinjection 실험적인 화합물25 의 배달에 대 한 허용 또는 미생물25,31,,3233 는 꼭대기에 상피 라이브 organoid 루멘의 표면입니다. 레슬리와 황 외. 25 는 최근 HIOs fluorescein isothiocyanate (FITC) 세균 독 소에 노출 다음 dextran을 표시와 함께 microinjected에 장벽 침투성 측정에이 기술을 적응.

이 프로토콜은 hPSC 파생 HIOs 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 조직 파생 HIOs 상피 장벽 침투성의 측정을 위한 가이드 것입니다. 사소한 수정, 그것은 또한 실험적인 화합물과 HIOs의 microinjection에 대 한 일반적인 입문서로 사용할 수 있습니다. 사용자가 microinjection 후 추가 또는 대체 다운스트림 응용 프로그램이 프로토콜을 보충 수 있습니다.

프로토콜

보통, 취소 확인 된 인간 성인 장 조직 생활, 미시간의 선물을 통해 죽은 장기 기증자에서 얻은 했다. 인간의 ES 세포 선 H9 (NIH 레지스트리 #0062) WiCell 연구소에서 얻은 했다. 이 작품에 사용 하는 모든 인간의 조직 아닌 살아있는 기증자 로부터 얻은 하 고 취소 확인 되었다 미시간 대학 IRB (프로토콜 # HUM00093465 및 HUM00105750)에서 승인 된 실시 했다.

1. microinjector 설치

  1. 자료 테이블에 나열 된 자료를 얻을.
  2. Micromanipulator, 해 범위 및 광원은 biosafety는 캐비닛 놓습니다. 70% 에탄올 또는 실험 사용 전에 다른 살 균 제 microinjection 설치를 청소. Microinjection 장비를 부식 수 있습니다 표 백제를 포함 하는 소독 제에 장시간된 노출을 하지 마십시오.
    참고: 완전 한 microinjector 어셈블리의 예는 그림 1에 표시 됩니다.
  3. 눈 조각 biosafety 캐비닛에 대 한 방패에 액세스 포트를 통해 사용할 수 있도록 해 범위를 배치 합니다.
    1. 또는 깨끗 한 벤치를 사용 하 여 현미경 액세스 포인트와 캐비닛 biosafety 대신 긍정적인 공기 흐름 시스템.
  4. 제조업체의 지침에 따라 현미경의 오른쪽에는 micromanipulator를 조립 하 고 컨트롤을 쉽게 도달 하 고 조정할 수 있도록 조정 합니다. micromanipulator 철판에 장착 하거나 그렇지 않으면 안정 해야 합니다.
    참고: 왼손잡이 사용자는 micromanipulator 해 범위의 왼쪽에 배치 할 수 있습니다.
  5. 탑재 micromanipulator 팔 micropipette 홀더 micropipette 홀더에 삽입 하 여 아날로그 튜브를 연결 합니다.
  6. 살 균 미네랄 오일의 약 5-7 mL와 10 mL 유리 주사기를 채우십시오.
  7. 연결 10 mL 유리 주사기 Luer 잠금 메커니즘을 사용 하 여 아날로그 튜브의 오픈 엔드에 미네랄 오일으로 가득 합니다. micromanipulator에서 반대 해 범위의 왼쪽 유리 주사기를 놓습니다.
  8. 부드럽게 튜브를 통해 미네랄 오일 밀어 주사기, 우울. 미네랄 오일의 약 10 방울 micropipette 소유자의 끝에서 플러시 페 트리 접시 또는 이와 유사한 용기에 수집 하 고 삭제.
    참고:이 단계는 배관에서 모든 공기를 제거 하 고 각 microinjection 세션 전에 수행 되어야 합니다.

2입니다. microinjection에 대 한 준비

  1. 24 시간 이전에 microinjection:
    1. 다시 살 균 PBS 또는 염 분 2 mg/mL의 농도에서 FITC dextran을 일시 중단 하 여 FITC dextran 솔루션을 준비 합니다. 준비의 총 볼륨 > 250 µ L.
      참고: FITC dextran의 더 높은 또는 낮은 농도 사용할 수 있습니다에서 배열 약 0.1-10 mg/mL. FITC-dextran 하류 이미징 응용 프로그램에 맞게 농도 조정 합니다.
    2. 4 또는 8 잘 유리 챔버 슬라이드 또는 적합 다른 문화 선박에 설치 organoid 문화 살 현미경 검사 법, 최대 4-6 HIOs 잘, 50 µ L 셀 매트릭스 솔루션에 포함 하 고 EGF, 머리 및 R-Spondin (ENR) 성장 인자 미디어 19 양식 당 24. 우주는 organoids 균등 하 게 (약 5 m m 떨어져) 실시간 이미징 분석 중 현미경의 단일 필드에 여러 HIOs 캡처 피하기 위해 주의. 하이 오 문화 및 유지 보수 완전 한 가이드 참조 McCraken 외. 24.
      참고:이 프로토콜 사용 하 여 줄기 세포 파생 HIOs 개발 되었다 고 대표 결과 (아래 참조)이 조직 문화 모델의 사용을 보여 줍니다. 그러나, 같은 프로토콜은 쉽게 조직 파생 장 상피 organoids15,29에 적응 된다. 조직 파생 HIOs는 PSC 파생 HIOs 부족 지원 엽 basolateral 셀 구조15,,2930보다 일반적으로 더 작다. Microinjection 조직 파생 HIOs의 기술 능력의 더 큰 학위를 필요로 하 고 경험 수 있습니다. 정도는 상피 장벽 침투성 데이터 HIOs 조직 파생을 사용 하 여 얻은 hPSC 파생 HIOs 연관 수 있습니다 알려져 있습니다.
    3. Microinjection 이전에 42 ° C, 5% CO2 표준 세포 문화 인큐베이터에서 HIOs를 품 어.
  2. 30 분 microinjection, 전에 biosafety 캐비닛 켜고 최적의 작업 높이 유리 방패를 올립니다.
  3. Biosafety 내각에서 모든 불필요 한 항목을 제거 합니다. 잡동사니 공간 감 금에서 일 때 유출 또는 다른 사고 위험을 증가.
  4. 스프레이 하 고 철저 하 게 70% 에탄올 또는 다른 살 균 제와 작업 표면 청소. 깨끗 한 종이 타월을 사용 하 여 닦으십시오.
  5. microinjector에 부착 된 유리 주사기에 미네랄 오일의 수준을 확인 합니다. 나머지는 미네랄 오일의 3 mL 미만 경우 주사기를 나사 고 biosafety 내각, 거품 소개 되지 않도록 주의 하면서 내부 리필. 7 mL 이상 채우지 마십시오.
  6. 설정 해 범위를 조명 하는 램프. 개인적인 편안 함을 위해 접 안 렌즈를 조정 합니다.
  7. 위치 해 범위의 오른쪽 micromanipulator입니다. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 철판에 micromanipulator 보안. 마그네틱 스탠드는 micromanipulator의 위치를 조정 하 고 스탠드 철 격판덮개를 ON 위치로 마그네틱 스탠드를 설정 하 여 보안을 OFF 위치로 전환 합니다.
  8. Microcapillary 설치
    1. 제조업체에서 제공 하는 스토리지 컨테이너에서 단일 1 m m 유리 필 라 멘 트를 검색 합니다.
    2. Micropipette 끌어당기는의 구리 난방 코일의 센터를 통해 유리 필 라 멘 트를 삽입 합니다.
      참고: micropipette 끌어당기는 준비 가이드에 대 한 그림 2 를 참조 하십시오.
    3. 구리 난방 코일 필 라 멘 트 유리 중간 약은 되도록는 필 라 멘 트를 놓습니다. 이렇게 하면 끌어당기는 각 유리 필 라 멘 트 로부터 두 개의 사용 가능한 microinjection 바늘을 생성.
    4. 유리 필 라 멘 트를 사용 하 여 상단을 강화 하 여 클램프 클램프 먼저, 필 라 멘 트 유리 파손을 방지 하기 위해 노치 그로브 내 보안 확인 하 고 보호 합니다.
    5. 하단 클램프를 강화 하기 전에 최대 수직 위치로 끌어당기는 팔을 연장.
      참고:이 단계는 필수적입니다. 완전히 끌어당기는 팔 연장 실패 유리 필 라 멘 트의 두 섹션의 불규칙 한 분리 됩니다.
    6. 열 및 메커니즘을 당기에 설정을 확인 합니다.
토글 (990)와 열 # 1을 선택 하 고 설정 059 (그림 2)에서 당겨.
  • On/Off 토글을 사용 하 여 악기를 켭니다.
  • 보호 플 쉴드 닫고 끌어당기는의 하단 오른쪽 얼굴에 당겨 단추를 누릅니다. 구리 코일 열에 시작 되 고 밝은 오렌지 빛을 낼 것 이다. 온도 상승, 스트레칭 하 고 결국 별도 유리 필 라 멘 트 시작 합니다. 유리 필 라 멘 트의 두 끝을 분리 시 악기의 파워 다운.
    참고: 구리 코일 유지 됩니다 매우 뜨거운 몇 분 동안. 가져온된 유리 필 라 멘 트 프로토콜에이 시점에서 'microcapillary'로 지칭 합니다.
  • 구리 코일을 만지지 마십시오, 유리 microcapillaries 중 하나를 제거 하 게 주의 되 고. microcapillary 아주 좋은 포인트가 있어야 합니다. 라텍스 또는 니트 릴 장갑과 신중 하 게 microcapillary를 처리 하 고 즉시 microinjector 설치를 포함 하는 biosafety 내각을 진행 합니다.
    참고: 유리 microcapillary는 매우 샤 프 하 고 매우 깨지기 쉬운. 관심을가지고 처리 합니다.
  • Micromanipulator 팔의 마 개를 풉니다. 가져온된 microcapillary의 무뚝뚝한 끝 micropipette 소유자의 열린 끝에 삽입 하 고 밀어 안쪽까지 중지.
  • 엔드 캡을 다시 조여 micromanipulator 팔 microcapillary의 무뚝뚝한 끝을 보안 합니다.
    참고: microinjection 시스템에는 microcapillary를 설치할 때 주의 날카롭게 끝을 만지지 마십시오. 이 오염 가능성을 줄일 것입니다. 그리고 microinjection에 대 한 훌륭한 포인트를 유지. 올바르게 확보는 microcapillary를 microinjection 동안 불안정 또는 유리 필 라 멘 트의 파손에 발생할 수 있습니다.
  • 유리 microcapillary의 팁을 엽니다. 가져온된 유리 microcapillary의 준비, 동안 포인트의 팁은 microcapillary의 뾰족한 끝을 밀봉 하기 위하여에 녹아 가능성이 것입니다. 이 막힘을 제거:
    1. 위치는 micromanipulator 하는 microcapillary이 표면을 없이 해 범위의 유리 단계에서 아래로 지적 이다.
    2. 살 균 플라스틱 표면 찾기 (문화 접시 뚜껑의 아래쪽은 완벽 하 게 작동) 해 범위의 단계에 microcapillary 바늘 아래 직접 현미경 스테이지에 놓습니다.
    3. 보기 영역에서 microcapillary의 팁 가운데 고 아래 1.5 배 확대 현미경의 접 안 렌즈를 통해 볼 때 표시 되는 확인 합니다.
    4. Micromanipulator 팔 사전 천천히 micromanipulator 컨트롤을 사용 하 여 및 팁 겨우 연락처는 microcapillary의 팁 및 플라스틱 표면 때까지 무 균 플라스틱 문화 뚜껑 쪽으로 microcapillary 무료 휴식.
      참고: microinjection 중 고 하이 오에 피해를 최소화 하기 위해서는 유리 필 라 멘 트에서 유체 흐름에 대 한 허용 가장 작은 가능한 휴식에 대 한 목표.
    5. 다시 진행 하기 전에 실수로 파손의 기회를 최소화 하기 위해 살 균 표면에서 microcapillary.
    6. 유리 주사기, 튜브를 통해 미네랄 오일 추진 우울 하 여 흐름에 대 한 microcapillary를 확인 하십시오. microcapillary의 끝이 열려 있으면 몇 초 후에 microcapillary의 끝에서 등장 미네랄 오일의 작은 작은 물방울을 표시 됩니다. 이 발생 하지 않으면 이전 단계 고 다시 테스트를 반복 합니다.

    • 3. 살 균 Microinjection

    참고: microcapillary는 준비, 설치, 및 테스트 된, 일단 microinjecting HIOs 시작. 그림 3 에 조직 파생 HIO를 성공적으로 주입 FITC dextran을 보여 줍니다.

    1. 사출 재료에는 microcapillary를 채우십시오. 에 FITC dextran 주입, 측면 또는 튜브의 하단에 대 한 microcapillary의 팁을 위반 되지 않도록 주의 하면서 유리 microcapillary의 끝 잠수함 microcapillary의 팁 솔루션에 빠져들은, 일단은 microcapillary에 FITC dextran 현 탁 액의 약 10 µ L를 그릴 미네랄 오일 주사기에 다시 당겨.
      참고: 그것 때문에이 설치 된 microcapillary에 가장 쉽게 액세스할 수 있을 것입니다 주입 솔루션/문화에 대 한 1.5 mL 또는 0.5 mL 튜브를 사용 하 고 좋습니다. 또는, 주입 멸 균 페 트리 접시 또는 살 균 parafilm이에 튜브를 필요를 제한 하 여 sharps 부상의 위험을 줄일 수 있습니다 솔루션을 그릴 수는 microcapillary에 근접을 닫습니다. 현 탁 액은 높은 점성 또는 microcapillary의 개통은 매우 작은 경우, 두 번째는 microcapillary을 채우기 위해 몇 가지 걸릴 수 있습니다. 이 전체 microinjection 시스템을 오염 시킬 수 있습니다으로 플라스틱 microinjection 튜브에 microinjection 정지를 그릴 하지 않습니다.
    2. Microinjection 정지 채우면 유리 microcapillary의 길이의 90%는 microcapillary를 작성 중지 합니다. microcapillary는 microcapillary의 끝의 공기 주머니를 포함 하지 않는 수 있도록 microinjection 솔루션에서 철수 하기 전에 주사기를 약간 우울.
      참고: 경우에 microcapillary의 시험 공기의 포켓을 보여준다, 빈 및 다시 작성.
    3. microinjector와 셀 문화 인큐베이터 및 전송에서 캐비닛 biosafety HIO 문화 plate(s)을 제거 합니다.
    4. 하이 오 문화 접시 biosafety 내각 내에서 뚜껑을 제거을 그것은 명확 하 게 가장 낮은 배율 설정 범위의 접 안 렌즈를 통해 볼 수 있도록 현미경 스테이지에 첫 번째 잘 중앙.
    5. 그런 각도에서 잘 HIO 문화에 아래로 microcapillary 지적 micromanipulator 팔을 돌려 > 현미경 단계를 기준으로 45 °. 이것은 가장 쉽게 수동으로 수평 micromanipulator 팔 지원 만나는 지점 수직 스탠드 잘 컨트롤 (블랙 다이얼)의 한정 된 범위 때문에 수평 축에 micromanipulator 팔 어셈블리를 설정 하 여 수행 동작입니다. 미디어 (그림 3A)의 표면 위에 대략 1 cm에서 첫 번째 문화 위에 microcapillary의 끝을 놓습니다. 조직에서 파생 된 장 상피 organoids의 microinjection를 보여주는 대표적인 이미지는 그림 3B에 표시 됩니다.
    6. 유리 필 라 멘 트 끝에 HIO(s) 모두 접 안 렌즈를 통해 볼 수 있습니다 확인 하십시오. 필요한 경우 다시 위치입니다.
    7. Z 축 컨트롤 노브를 시계 방향으로 선회 하 여 천천히는 microcapillary를 사전.
      참고: microcapillary 팁의 위치 판단, 특히 깊이, 연습을 해야 합니다. 팁 위반 미디어의 표면, microcapillary 끝의 약간의 시각적 왜곡 알.
    주의 HIOs 손상 하거나 문화 접시의 바닥에 대 한 microcapillary을 피하기 위해이 시점에서 진행 한다.
  • 피어스 microcapillary 팁 하이 오. 하는 오의 외부 표면은 microcapillary 압력을 적용 하기 시작 하 고 팁 루멘을 침투 하는 모양으로 다시 나타납니다 약간 우울 합니다. 하이 오 루멘 내의 microcapillary의 끝을 식별 하는 어려울 수 있습니다. 경우에 microcapillary를 보고 하는 어려움 조명 또는 배율 설정 해 범위를 조정 합니다.
  • microcapillary는 하이 오의 중앙 microcapillary의 팁 위치 올바르게 때 손을 micromanipulator 컨트롤에서 제거 합니다.
  • 미네랄 오일 주사기는 microcapillary 그리고 HIO 루멘으로 microinjection 솔루션을 약간 우울 하이 오 주사의 볼륨을 수용 하기 위해 약간 확장 될 수 있습니다.
    참고:이 파열 organoid 발생할 것 이다-는 하이 오를 작성 하지 않도록 주의 하십시오. 엄지손가락의 규칙으로 서 하이 오 볼륨의 모든 표시 확장 중지 시간이 의미 합니다. 성숙한 HIO 루멘의 평균 볼륨 약 1 µ L 이지만 크게 다를 수 있습니다. 자동 주사기 펌프는 주입 된 볼륨의 제어할 수 있도록 수동 주사기 대신 사용할 수 있습니다.
  • Z 축 제어 및 미디어의 표면 위에 위치를 사용 하 여 하이 오에서 있는 microcapillary을 철회.
  • 미디어 공작 동안에 HIOs 우발적인 손상을 방지 하 고 비슷한 방식으로 주사를 위에 위치 하는 microcapillary와 다음 HIO 대상 이동 (참조 단계 3.6-3.11).
    1. 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 microcapillary 리필.
      참고: 주사를 계속을 경우 팁은 microinjection 중 어느 시점에서 휴식, 시도 하지 마십시오. 아래의 지침에 따라 팁을 변경 합니다.
  • Microcapillary 파손 또는 치료 사이 변경 합니다. Micromanipulator 팔의 끝에 클램프를 풀고 고 micropipette 홀더에서 microcapillary를 제거 합니다.
    주의: 팬 들은 날카로운 끝의 가까이 microcapillary의 정보를 처리 하지 않습니다. 좋은 포인트는 microcapillary의 매우 날카로운 이며 쉽게 장갑과 피부를 찔린 것 이다. 주의 사용 하 고 조작만 하 고 결코 배치는 microcapillary의 포인트와 하이 오 문화 사이의 손을 사용 하 여 microcapillary를 처리 하는 모든 움직임에 유의. 전염 성 요원 또는 독 소를 포함 하는 microcapillary에서 바늘 막대기 경우 즉시 치료를 추구 합니다.
    참고: 경우에 따라 그것은 어려울 수 있습니다 시각적으로 성공적인 HIO microinjection 확인 하. 분명 microinjection 정지의 가시성 또한 FITC dextran의 높은 농도의 사용 향상 될 수 있습니다.

    • 4. HIOs의 약물 치료

    1. 꼭대기 상피 하 전달 화합물 테스트, 2 mg/mL FITC dextran을 포함 하는 메 마른 PBS에 resuspend 하 고 HIO 루멘 (제 3) 위에 표시 된 대로로 microinject. 대표적인 실험 FITC dextran을 포함 하는 PBS에 Clostridium 남과 어울리지 않는 독 소 TcdA 12.8 ng / µ L을 resuspend.
    2. Basolateral 구획에 전달 하는 화합물을 테스트 하려면 바꿉니다 외부 문화 미디어 뉴 미디어 2mm 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, 포함 N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA)(positive control), PBS 차량 혼자 (부정적인 제어 ), 또는 microinjection FITC dextran의 후 다른 실험적인 화합물.
      참고: 투약 하 고 약리학 적인 화합물, 독 소, 또는 다른 에이전트의 응용 프로그램의 타이밍 실험 질문에 따라 달라질 수 있습니다.

    5. 라이브 Microinjected Organoids의 Imaging

    1. 라이브 이미징 즉시 다음 microinjection를 시작 합니다. 형광 현미경 자동된 라이브 셀 이미징 시스템 21% O2 및 5% CO2 , 37 ° C에서 유지 하는 습도 챔버를 갖춘 문화 접시를 전송 합니다. 환경 챔버를 닫고 이미징 프로세스를 시작 합니다.
    2. 바탕 화면에서 이미지 분석 소프트웨어 (예: softWoRx)를 시작 합니다. "파일"을 클릭 하 고 "(해결 3D) 취득" 영상 및 현미경 제어 소프트웨어를 선택 합니다.
    3. FITC 여기/방출 설정 (475 nm 여기/523 nm 방출), 5%, 및 4 X 렌즈 전송 전력 설정. 0.025 ms (그림 4A)에 노출 시간을 설정 합니다.
      참고: 노출 시간 형광 신호에 맞게 변화 해야 한다. 일반적으로, FITC 형광 신호가 줄어듭니다만. 따라서, 최대 감도 보장 하기 위해, 초기 노출 시간 조정 되어야 한다는 기록 된 형광 신호 카메라와 이미징 소프트웨어의 포화 지점 바로 아래.
    4. HIOs 4 배 확대 현미경에 부착 된 디지털 컨트롤러를 사용 하 여 찾을. 센터 보기 필드 (그림 4A) 내 하이 오.
    5. 도구 모음에서 "보기"를 클릭 하 고 "포인트 목록" 선택 새 창 공개. "지점을 표시" 클릭 지점 목록 (그림 4A)에서 무대의 현재 위치를 저장 하는 데.
    6. 5.4와 5.5 단계를 반복 하 여 모든 HIOs의 위치 기록 되었습니다. Using 메모장 이나 디지털 기록, 적어 각 프로그램된 현미경 위치와 해당 위치에 촬영 된 이미지에 할당 된 고유 ID 번호. 이미지 파일이 ID 번호 태그로 그리고 데이터 수집 완료 된 후 특정 HIOs와 치료 이미지 ID 번호를 연결 하는 것이 중요할 것 이다.
    7. 자동된 이미지 컬렉션을 설치 하려면 도구 모음에서 "파일" 그리고 "실험"을 클릭 합니다. 이름 날짜 또는 다른 고유 이름을 가진 실험.
    8. 그림 4B에서 같이 각 옵션 탭을 통해 이동 하 여 이미지 컬렉션에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 유엔-확인 "Z 단면" 탭의 "단면".
      2. "채널" 탭에서 맨 왼쪽 "해결 3D" 창에서 매개 변수를 입력 합니다. 시간을 절약 하려면 첫 번째 행 자동으로 채웁니다 때에 왼쪽에 있는 상자에 확인.
      3. 탭에서 ' 시간 경과 ","시간 경과"라는 상자를 확인 하 고"계시"와" 총 시간 "을 표시 하는 행에 실험의 전체 기간을 표시 하는 행에 이미지 사이의 시간 간격을 입력. 소프트웨어 시간 점의 수를 자동으로 계산 됩니다.
      4. "포인트" 탭에서 "방문 포인트 목록" 확인란을 선택 합니다.
    또한 수동으로 텍스트 상자에 입력 하 여 실험에 포함 될 특정 소수점을 입력할 수 있습니다.
  • "패널" 또는 "작업" 탭에서 기본 옵션을 변경 하지 마십시오.
  • "실행" 탭 입력 상자에 실험의 날짜를 클릭 "이미지 파일 이름"을 표시 하 고 저장 위치 "설정"에서 데이터를 설정 합니다.
  • 실험 매크로 실행 하려면 녹색 화살표를 클릭 하십시오. 시간 경과 카운터 실험 진행 상황을 추적 합니다.
  • 계획된 시간 과정의 끝에, 수출 하 고 24 비트 RGB TIFF 이미지 (그림 4C)으로 모든 이미지 파일을 저장 합니다.
    1. 도구 모음에서 작업 작성기 다음 프로세스를 선택 합니다.
    2. 작업 작성기 메뉴에서 5.9에 지정 된 데이터 폴더를 이동 하 여 파일을 추가 합니다. 프롬프트에서 "*.dv"를 입력 하 여 ".dv"로 끝나는 모든 파일을 강조 표시 합니다. 모든 (Ctl + A)을 선택 하 고 "추가"를 클릭 합니다.
    3. + "작업." 라고 표시 된 섹션에서 클릭 하십시오 "내보내기..."를 선택 하 고 "옵션" 탭을 클릭 하십시오.
    4. "내보내기 형식" "TIFF 이미지"를 설정 하 고 "사용자 지정 출력 폴더"를 추가 하려면 아래 확인란. TIFF 이미지를 내보낼 위치입니다. "TIFF 출력 형식"에서 24 비트 RGB를 선택 하 고 "완료"를 클릭 합니다.
    5. 내보내는 매크로 실행 하려면 "큐를 제출"을 클릭 합니다.
  • 다른 컴퓨터에 포스트 이미징 분석 (제 6 항)을 수행 하려는 경우 외부 드라이버 또는 서버 5.11에 내보낸 TIFF 이미지를 복사 합니다.
    참고: HIO 조직과 미디어 저장 될 수 있습니다 조직학34, PCR35), 서쪽 오 점36또는 다른 다운스트림 분석.

    • 6. 후 영상 분석

    1. ImageJ37 설치 되어 있는지 확인 하 고 분석에 사용 될 컴퓨터에서 제대로 작동.
      참고: 피지37 은 ImageJ 코어 프로그램 작동의 다른 배급이이 분석을 위해 동등 하 게 잘.
    2. ImageJ 메뉴에서 "프로세스" "일괄 처리"와 "매크로"를 선택 하 여 일괄 처리 분석을 시작 합니다.
    3. 실험 시간 동안 수집 된 TIFF 이미지가 포함 된 디렉터리에 대 한 입력을 설정 합니다. "Thesholdmeasure.ijm" ImageJ 매크로 파일 또는 직접 복사/붙여넣기 매크로 코드 창에. "프로세스" 파일을 처리 하려면 클릭 합니다.
      참고: 최소 임계값 값 x (setThreshold(x,255);) 0-모든 숫자를 설정할 수 있습니다 255 배경 형광을 제거 하기 위하여 조정 한다. 값 < 100는 것이 좋습니다. 경험적으로 적절 한 임계값을 확인 하려면 단일 이미지를 대표 하는 형광 신호를 organoid 이미징 매크로 실행 합니다. 이 이미지의 평균 강도 임계값을 적절 하 게 설정 하기 위한 가이드로 사용할 수 있습니다. 아래 제시 하는 대표적인 분석에 대 한 임계값 "42"로 설정 되었습니다.
    4. ImageJ 임계값 강도 범위 내의 모든 픽셀의 영역을 포함 하는 큰 테이블을 생산할 예정 이다 그리고 임계값 강도 한계 내에서 영역에 대 한 평균, 중간값, 최소값, 및 최대 (제한) 강도 값. 이 CSV 또는 XLS로 저장 합니다.
    5. 시간이 지남에 강도 변화는 아래 계산을 수행 하는 데이터 테이블을 조작 하 여 스프레드시트39 에서 계산 될 수 있다 또는 언어 프로그래밍 자동화를 사용 하 여 적당 한 될 수 있습니다. R 40 에 작성 한 예제 분석 스크립트는이 원고와 함께 제공 됩니다.
      참고: 각 하이 오에 대 한 상대적인 형광 강도 수 있습니다 측정할 수로 figure-protocol-1 . 제거 시간 41 (t1/2)의 FITC dextran HIO 루멘에는 다음과 같이 계산 되었다.
      1. 첫째, 계산 하는 "곡선 아래의 영역" (AUC)로 시간 (t) 동안 상대 형광 강도 설명 하는 곡선에서:
        figure-protocol-2
      2. 그런 다음 "정리"를 계산 (figure-protocol-3) t 에서 정규화 된 형광에 대 한 1로 정의 된 배포 (Vd)의 볼륨 속도 = 0:
        figure-protocol-4
      3. 다음, "제거 속도 상수" 정의 (figure-protocol-5)로:
        figure-protocol-6
      4. 마지막으로, "" 제거 시간을 계산 하 고 (t1/2)로:
        figure-protocol-7
        감소 된 방정식은 이렇게:
        figure-protocol-8

    결과

    HIOs 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 분화 되었다 고 설명한19,24셀 매트릭스 솔루션으로 이전에 양식. 4 주 후에 문화, 여 HIOs microinjection 수 있도록 충분히 확장 했다. HIOs 4 kDa FITC 활용 된 dextran PBS 또는 Clostridium 남과 어울리지 않는 독 소 TcdA를 포함 하는 PBS에와 microinjected 했다. C. 남과 어울리지 않 는 HIOs25독 소 중재 상피 독성을 전시 하는 기회 위장 병원 체 이다. 긍정적인 컨트롤로 EGTA HIOs PBS와 FITC dextran 주입의 하위 집합에서 하이 오 문화 미디어에 추가 되었습니다. EGTA 말라 골격42의 급속 한 탈 중 합을 일으키는 칼슘 chelator입니다. FITC 형광은 제어 환경 챔버 내에서 라이브 영상 현미경에 실시간으로에서 모니터링 하 고 이미지에서 10 분 간격으로 체포 되었다.

    영상 데이터의 post hoc 분석 FITC 형광 (그림 5)의 보존에 상당한 차이 밝혔다. 그러나 HIOs PBS와 주입 거의 모든 t 에 형광 신호 유지 = 0, 또한 주입 했다의 TcdA와 EGTA 치료 HIOs 8 시간 후 microinjection (그림에 의해 형광 강도에 상당한 감소를 전시 5A). 영상 데이터는 각 실험 조건 (그림 5B) 시간이 지남에 형광 강도 상대적인 변화를 나타내는 고해상도 데이터 집합을 생성 하는 모든 시간 지점에서 모든 HIOs에 대 한 계량 했다. 상피 침투성에 차이 각 치료 그룹 (표 1) FITC의 평균 제거 시간 (t1/2 )를 계산 하 고 t t1/2 그룹 간의 차이 비교 하 여 평가 했다 학생의 t를 사용 하 여-테스트. 제어 처리 HIOs 유지 16 시간 이상 FITC 형광 신호의 대부분 (t1/2 = 17 ± 0.3 h). EGTA 치료 크게 제어 HIOs 상대적인 FITC dextran 제거 시간 감소 (1/2 t = 2.6 ± 0.2 h; P = 10-8x 1.3). 일치 결과 이전에 게시25, TcdA의 microinjection 크게 증가 제어 치료 기준으로 상피 장벽 침투성 (t1/2 = 7.6 ± 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). 따라서, 외부 (EGTA) 및 microinjected (TcdA) 화합물 HIOs에서 상피 장벽 침투성에 유도 하는 중요 한 변경 할 수 있다. 이러한 결과 상피 장벽 기능에 다양 한 약리학 적인 대리인, 대사 산물, 세균성 제품, cytokines, 성장 요인, 및 다른 화합물의 효과 평가 될 수이 접근을 사용 하 여 것이 좋습니다.

    치료반감기 (h)SEM (h)낮은 95 %CI (h)위 95 %CI (h)n
    제어17.110.316.4517.7811
    EGTA2.580.191.783.383
    TcdA7.560.635.939.186

    표 1: 제거 시간을 의미 (t1/2) FITC-dextran HIOs에서 EGTA 또는 TcdA 치료에 대 한. 단위는 시간 후 microinjection.

    figure-results-1
    그림 1: microinjector와 micromanipulator HIO microinjection에 대 한 기본 레이아웃. 이 이미지는 장비 HIOs의 microinjection를 수행 하는 데 사용의 완전 한 보완을 보여줍니다. 주요 구성 요소는 표시 하 고 주문 정보 자료 테이블에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    figure-results-2
    그림 2: Micropipette 끌어당기는. 구리 난방 코일 hc, 탑 클램프 c1, 하단 클램프 (c2), 끌어당기는 팔 (pa), 열 선택 토글 (ht) 화살표로 식별 됩니다. 열 1과 풀에 대 한 올바른 설정은 빨간색 텍스트로 표시 됩니다. 삽입 된 난방에 대 한 준비가 제대로 탑재 유리 필 라 멘 트를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    figure-results-3
    그림 3: 조직의 파생 HIO FITC dextran 주사의 대표 이미지. (A) 이미지 하이 오와 microinjection에 삽입 직전 유리 microcapillary의 위치를 보여주는. (B)는 조직에서 파생 된 인간 창 자 organoids FITC dextran의 microinjection 후의 명시 이미지. 형광 신호는 특정 필터 집합의 사용 없이 명백한 참고. 이 채색 microinjection 정밀 에이즈. 3 배 확대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    figure-results-4
    그림 4: 라이브 이미징 워크플로. (A) 스크린샷 현미경 매개 변수를 설정, 슬라이드에는 HIOs 찾을 이미지 수를 각 하이 오에 대 한 무대의 위치를 저장 하는 데 필요한 단계를 설명. 각 위치에서 일정 한 간격 FITC 채널 캡처에 대 한 (B) 사전 영상 설정을 DV 포맷 데이터의 대답 (C) 후 이미징 수출에 시간 포인트 당 HIO 당 한 TIFF 이미지를 TIFF 이미지 파일 지정.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    figure-results-5
    그림 5: 대표적인 결과. (A) 줄기 세포 파생 인간의 창 자 organoids (HIO) 2 mg/mL FITC dextran와 microinjected (4 kDa) 20 시간에 대 한 군데. HIOs 했다 또한 PBS (제어) 또는 Clostridium 남과 어울리지 않는 독 소 TcdA microinjected (12.8 ng / µ L) 2mm EGTA 외부 문화 미디어에 추가 된 취급. 4 X 확대입니다. (B) 줄거리 HIOs에서 시간이 지남에 의미 정규화 FITC 강도의 PBS (제어), TcdA, 또는 EGTA 취급. 오차 막대를 나타내는 S.E.M.과 n = 11 HIOs (제어), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    토론

    이 프로토콜 실시간으로 hPSC 파생 HIOs 및 조직 파생 장 organoids의 microinjection 및 상피 장벽 침투성의 측정을 위한 범용 메서드를 설정합니다. 우리는 또한 우리의 접근 방식을 분석 하 고 이러한 메서드를 사용 하 여 생성 하는 데이터의 해석 설명 했다. 준 장 organoids의 성장 채택 모델 시스템16,20,,2128 및 장의 장벽 침투성으로 순수 관련 기능에 오랜 관심 결과3,,45,6, 우리는이 분야에서 일하고 다른 사람 적용 하 고 이러한 방법에 따라 만들 수 있을 것입니다 예상.

    이 기술의 응용 프로그램에 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 고품질 hPSC-또는 파생된 HIO 조직 microinjection와 광범위 한 실험 전에 설치 되어야 하는 조직에 접근. HIO macrostructure 조직 정체성과 세포 형태학은 높은 재현성 HIOs24를 생성 하기 위해 설립 된 방법론을 활용 하면 이기종, 크기와 모양, 변형 될 수 있습니다. 구형 HIOs 단일 반투명 루멘 이루어져 고 직경에서 약 1 m m microinjection 및 실시간 luminal 형광의 측정에 이상적입니다. 경우에 따라 microinjection는 하이 오의 붕괴 또는 주입 된 물자의 분명 한 누설의 결과로 실패 합니다. 실패 한 HIOs 표준 micropipette를 사용 하 여 사용자의 판단에 따라 잘 문화에서 제거할 수 있습니다. Microinjection 및 이미징 HIOs 선택할 때 이미징 플랫폼에서 사용할 수 있는 대물 렌즈를 고려 하십시오. 일반적으로 2-4 X 렌즈는 완전 한 HIO 형광 신호 캡처에 이상적 저전력 렌즈는 사용할 수 없거나 사용 가능한 HIOs 10 X 목표 사용할 수 있지만 < 직경에서 1 m m. 이미징 소프트웨어 시간이 지남에 정의 된 지점에서 형광 이미지의 자동된 캡처 허용 해야 합니다.

    이 프로토콜의 여러 수정 실험 요구 사항에 맞게 하기 위해 수 있습니다. 예를 들어 장벽 기능 테스트 결과 사용43 화합물의 분자 크기에 따라 있을 수 있습니다 그리고 그것은 다양 한 분자량의 dextran 준비를 테스트 하려면 적절 한 수 있습니다. 또한, 명시 이미징 조직25의 전반적인 구조적 무결성의 지표로 서 형광 이미징 뿐만 아니라 수행할 수 있습니다. 그것은 페니실린을 추가 해야 할 수 있습니다 라이브 박테리아25,28,31,32,,3344의 microinjection를 수행할 때와 스 또는 gentamicin HIO 문화 미디어 이전에 또는 microinjection 후에. microcapillary의 외부 세균성 문화 중단 작성 하는 동안 오염 될 것 이다 하 고이 하이 오 미디어에 전송 될 수 있습니다. 또는, microinjection HIOs 미디어 하지 않고, 세포 외 기질 (예를 들어, Matrigel)에 정지에 microinjection 완료 되는 미디어를 추가에 수행할 수 있습니다. 이 기질을 하는 오의 외부 얼굴 오염을 제한할 수 있습니다. 미생물 성장 분석 실험을 계획할 때 그것을 감속 하거나 방지 microinjected 생물의 성장을 피하기 위해 1-2 h 후 미디어에서 항생제를 제거 필요할 수 있습니다.

    마지막으로, 모든 연구원 생체 외에서 영상에 적합 한 현미경 장비에 접근이 있을 것을 인식, 그것은 촬영 한 이미지에 형광 데이터를 수집 하기 위해이 프로토콜에서 설명 하는 절차를 적용할 수 있습니다 지적 하는 것이 중요 자동된 이미지 캡처 또는 환경 컨트롤 없이 표준 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 고정된 timepoints에서. 이 방법의 예는 레슬리와 황 외 에 의해 보고서에서 찾을 수 있습니다. 25, 누가 hPSC 파생 장 organoids, 그리고 Karve 및 Pradan 외. C. 남과 어울리지 않는 독 소 활동 검사 44, 유사한 hPSC 파생 장 organoids 라이브 대장균을 microinjected에 상피 장벽 침투성을 검사 들. 이미징 장비의 수동 조작 큰 변화와 어려움 형광 신호를 정상화 될 수 있습니다. HIOs 주입 FITC dextran의 수동 이미징 수행 때 고정된 배율, 형광 흥분 강도, 형광 강도 측정을 왜곡 하지 않도록 하는 실험 내내 노출 시간을 유지 하기 위해 필수적 이다.

    공개 사항

    저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 공개할 수 있다.

    감사의 글

    저자 박사 스테파니 Spohn과 바젤 Abuaita organoid microinjection에 많은 유용한 토론에 감사 하 고 싶습니다. 주니어 장 줄기 세포 컨소시엄 (U01DK103141), 공동 연구 프로젝트는 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신장 질병 (NIDDK) 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID)에 의해 자금 지원 됩니다. 주니어 및 VBY NIAID 소설, 장의 질병 (NAMSED) 컨소시엄 (U19AI116482)에 대 한 대안 모델 시스템에 의해 지원 됩니다. DRH 지원 메커니즘의 미생물 병 인 교육 부여 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID, T32AI007528)와 임상, 번역 상 과학 상 미시간 연구소 임상 및 건강에 대 한 연구 (UL1TR000433)입니다.

    완전 한 데이터 파일 및 데이터 분석 코드가이 원고에 사용 된 https://github.com/hilldr/HIO_microinjection에서 사용할 수 있습니다.

    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)Bioworld405200081
    Cell matrix solution (Matrigel)Corning354230
    Deltavision RT live cell imaging systemGE Life Sciences29065728http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    CameraGE Life Sciences29065728Deltavision 시스템
    softWoRx 이미징 소프트웨어에GE Life Sciences29065728Deltavision 시스템에 포함
    Biosafety cabinetLabconcoCell Logic+http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBSLife Technologies10010-023
    Advanced DMEM-F12Life Technologies12634-010ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X)Life Technologies17504044ENR 매체의 구성 요소 참조; McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X)Life Technologies25030-081ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 24 참조
    HEPES 버퍼Life Technologies15630080ENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 참조 24
    ManipulatorNarshgeUM-3C
    MicromanipulatorNarshgeUM-1PF
    피펫 홀더NarshgeUP-1Xenoworks 피펫 홀더
    대체 마그네틱 스탠드NarshgeGJ-1
    해부 스코프올림푸스SX61권장 스코프, 다른 모델도 호환 가능하지만
    올림푸스 IX71 형광 현미경올림푸스IX71Deltavision 시스템에 포함
    CoolSNAP HQ2광29065728Deltavision 시스템에 포함
    재조합 C. difficile< / em> 독소 A/TcdA 단백질R& D 시스템8619-GT-020
    EGFR& D Systems236-EGENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 24
    R-spondin 1R& D Systems4645-RSENR 미디어의 구성 요소; McCraken et al. 24
    NogginR& 참조 D Systems6057-NGENR 매체의 구성 요소; McCraken et al. 참조 24
    Mineral oilSigma-AldrichM8410
    FITC-dextran (4 kDa)Sigma-Aldrich46944
    Micropipette pullerSutter InstrumentsP-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber SlidesThermoFisher Scientific154526PK
    유리 필라멘트WPITW100F-4
    마이크로 피펫 홀더XenoworksBR-MH2선호 장치
    아날로그 튜빙 키트XenoworksBR-AT
    1/16 in clearferrule XenoworksV001104
    1-1.2 mm O-ringXenoworksV300450
    포함됨 됨 됨

    참고문헌

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    FITC

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