방법 논문

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

DOI:

10.3791/56973

⸱

2018년 5월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

초록

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배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 (HSC) 창세기를 공부 하는 능력은 초기 배아에 HSC 선구자의 희귀 한 고 기능의 장기 multilineage engraftment 잠재력을 식별 하는 분석 실험의 부족에 의해 제한 되어 개별 putative HSC 선구자입니다. 여기, 우리가 격리와 단일 세포 수준에서 기능적으로 검증된 HSC 선구자의 방법론을 설명 합니다. 첫째, 우리 활용 개별적으로 정렬 된 각 셀의 정확한 phenotypic 매개 변수 카탈로그 인덱스 정렬 phenotypic 감 적의 조합 실험 분석에 대 한 추가 마커 HSC 선구자에 대 한 풍부 하 게 사용 하 여. 둘째, 각 인덱스 정렬 셀이 공동 지 원하는 multilineage, 장기 engraftment에서 가능성과 기능성 HSC에 HSC 선구자 비 engrafting의 성숙 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에서 혈관 틈새 기질과 교양 이식 분석 실험입니다. 이 방법을 수 있도록 그들의 기능적인 engraftment 잠재력 클론 hemogenic 선구자의 phenotypic 속성 또는 HSC 전조의 상세한 분석을 위한 수단을 제공 하는 transcriptional 프로필 등의 다른 속성의 상관 관계 단일 세포 수준에서 개발입니다.

서론

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클론 연구 노화1동안 HSC 하위 및 HSC 행동의 변화에 새로운 통찰력을 제공 하는 성인 HSCs의 장기 engraftment 속성에서이 밝혀졌다. 그러나, 배아 HSCs의 비슷한 연구와 그들의 선구자 되었습니다 더 많은 도전. HSCs 과도 과정에서 내 피 hemogenic 라고 알려진 선구자의 인구에서 발생 하는 초기 배아 개발 중으로 조 혈 전환2내 피. 강력 하 고, 장기 이식 조건된 성인 받는 사람에 따라 multilineage engraftment를 제공 하는 그들의 능력에 의해 정의 된 첫 번째 HSC 배아 이날 10.5 (E10.5) murine 태아에 매우 낮은 주파수3 이후까지 검색 되지 않습니다. . 그들의 발전 동안 3300 HSC (pre-HSC) hemogenic 피에서 발생 하는 이식 분석 실험4,5 에서 효율적인 engraftment 허용 성인 HSC의 속성을 획득 하기 전에 성숙 겪어야 한다 , 6. 희귀 HSC 기원, 다양 한 erythroid와 조 혈 창시자의 연구를 왜곡 골수성, 림프 잠재력 사전-HSC7,8에서 HSC의 출현 전에 이미 감지는. 따라서, 다른 조 혈 창시자에서 사전-HSC 구별 방법 clonally 세포를 분리 하 여 이식 분석 실험에서 engraftment 속성을 검색 하기 위해 HSC에 그들의 성숙에 대 한 충분 한 신호를 제공 필요 합니다.

다양 한 접근 HSC에 비보 전 또는 vivo에서 성숙 하 여 사전-HSC의 검출을 허용 하는 기술 되었다. 방법을 ex vivo는 첫 번째 HSC 개발9에서 감지 되는 AGM 지역과 같은 배아 조직의 문화에 달려 있었다. 이 방법, 분리, 통합 하는 프로토콜에 정렬, AGM 조직의 재 집계는 허용 파라 대동맥에 E11.5 E9.5에서 개발 하는 동안 HSC 선구자를 포함 하는 정렬 된 인구의 특성 splanchnopleura (P-Sp) / 관련해 지역4,,510; 그러나, 이러한 방법 클론 분석에 필요한 단일 세포 수준에서 일어나 높은 처리량 분석에 순종 하지 않습니다. 마찬가지로, 신생아 쥐에 이식 하 여 성숙 vivo에서 어디는 microenvironment HSC 선구자의 초기 단계 지원을 위해 더 적합 한 것으로 추정 되는 또한 활성화 노른자위 sac 및 AGM에서 정렬 된 인구의 연구 / P-Sp (P-Sp는 AGM에 선구자 지역) 사전-HSC, 하지만이 방법의 특성을 가진 또한 단일에 대 한 강력한 플랫폼을 제공 하는 실패 세포 분석11,12.

Rafii 외 에서 연구 보여주었다 그 내 피 세포 Akt 활성화 (EC) 기질 성인 HSC 자체 갱신 생체 외에서13,,1415의 지원에 대 한 틈새 기질을 제공할 수 있습니다. 우리는 최근 Akt 활성화 EC 관련해 지역 (AGM-EC)에서 파생 된 hemogenic 선구자, E9 성인 engrafting HSC 개발에서 뿐만 아니라 후속 빠르면 절연의 성숙에 대 한 적합 한 생체 외에서 틈새를 제공 한다 결정 생성 된 HSC16의 자체 갱신. 감안할 때이 시스템 사용 간단한 2 차원 공동 문화, 그것은 개별적으로 고립 된 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력의 클론 분석을 위해 쉽게 적응.

우리는 최근 클론 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력 AGM-EC 공동 문화 및 이식에서 이후의 기능 분석 murine 배아에서 개별 hemogenic 선구자의 인덱스 정렬 결합 하 여 분석 결과에 대 한 접근을 보고 17분석 실험. 인덱스 정렬 세포 형광 활성화의 모드 phenotypic의 모든 매개 변수 (즉, 앞으로 분산형 (FSC-A), 측면 살포 (SSC-A), 형광 매개 변수) 각 개별적으로 정렬된 셀 같은 정렬 (FACS) (인덱스)를 기록 하는이 기능 소급 정렬 다음 후속 기능적 분석 상관 될 수 있다. FACS 소프트웨어 위치/잘 두었다는 96 잘 접시의 각 셀에 대 한 두 phenotypic 정보를 기록 합니다. 이 기술은 이전 우아하게 사용 되었습니다 성인 HSC에서이 확인, 추가 HSC, 장기 engrafting 하위 집합에 대 한 풍부 하 고 연관 HSC의 phenotypic 매개 변수 transcriptional phenotypic 매개 변수 결정 단일 속성 셀 레벨18,19. 여기, 우리는 배아 개발의 초기 단계 동안 독특한 phenotypic 매개 변수 식별 및 사전-HSC의 혈통 기여를 가능 하 게이 방법의 상세한 방법론을 제공 합니다.

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프로토콜

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여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 프레드 허 친 슨 암 연구 센터에 의해 승인 되었습니다.

1. AGM-EC Monolayers 공동 문화에 대 한 준비

  1. 24 시간 이전에 관련해 해 부 정렬, AGM-EC 문화 미디어와 소독 필터를 확인 합니다.
  2. 물 (100 µ L/잘)에 0.1% 젤라틴 96 잘 접시의 각 음을 추가 하 고 15 분 Aspirate는 젤라틴에 대 한 실 온에서 품 어 두고 접시 조직 문화 후드에서 뚜껑 우물 건조 될 때까지 제거.
  3. AGM-EC monolayers 및 96 잘 접시 접시 해리.
    참고: 앞에서 설명한16, AGM-EC 문화 미디어에서 준비 관련해 EC 유지 합니다. 일관성을 위해 AGM-EC 셀 라인 최대한 빨리 충분 한 숫자 (일반적으로 통로 1-3) 얻을 수 있습니다 냉동 고 공동 배양 실험에 대 한 정의 통로 번호 (일반적으로 통로 5-12)에 사용 될 해야 합니다. AGM-EC 셀 라인 C57BL/6J (CD45.2) 관련해에서에서 파생 됩니다. 모든 미디어 구성에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    1. 75 c m2 플라스 크에 관련해 EC 문화에서 미디어를 발음 하 고 5 mL PBS를 추가 합니다. PBS, 발음 및 추가 3 mL 트립 신 솔루션 ( 재료의 표참조).
    2. 대부분의 세포는 접시 해제 될 때까지 2-4 분 동안 37 ° C에서 품 어. AGM-EC 문화 미디어와 8-10 시간 단일 세포 현 탁 액을 준비 하 여 15 mL 튜브에 전송 10 mL 피 펫을 피펫으로 7 mL를 추가 합니다.
    3. 5 분에 대 한 300 x g에서 회전 시키십시오, 제거는 상쾌한, 다시 10 mL AGM-EC 문화 미디어에서 일시 중지 고는 hemocytometer와 휴대폰 번호를 예상. AGM-EC 문화 미디어에 1 x 105 셀/mL의 농도에 세포를 희석.
  4. 각 잘 gelatinized 96 잘 접시의를 100 µ L AGM-EC 세포 현 탁 액 (1 x 104 의 세포)를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 AGM-EC 연결 하 고 confluent 단층을 형성 있도록 하룻밤.
    참고: 제한 자라 난 그래서 AGM-EC stromal 세포 또는 셀 최적의 공동 문화에 대 한 응집에 균등 하 게 배포 합니다.
  5. AGM-EC 단층 관련해 공동 문화에 대 한 준비.
    1. 다음 아침, AGM 혈 청 자유로운 미디어를 준비 합니다.
    2. 12 잘 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, AGM-EC에서 AGM-EC 문화 미디어를 제거 하 고 모든 잔여 혈 청에 포함 된 미디어를 cytokines 없이 관련해 혈 청 자유로운 미디어의 200 µ L/잘 추가.
    3. 미디어를 제거 하 고 cytokines와 관련해 혈 청 자유로운 매체의 200 µ L/잘 추가. 제거 하 고 내 피 층 손상 되지; 미디어를 추가 하는 경우에 신속 하 게 작업 예를 들어, 제거 하 고 다시 한 번에 미디어 한 행을 추가 합니다. 배아 세포 정렬에 대 한 준비가 될 때까지 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 96 잘 접시를 놓습니다.

2. Murine 배아 조직에서 단일 세포 현 탁 액의 준비

  1. 타임된 matings에서 AGM를 해 부.
    1. 원하는 나이의 미 발달 직물을 생성 하기 위한 타임된 matings를 설정 합니다.
    2. 사전-HSC 분석의 단계에 따라 9.5 11.5 일 게시물 coitum (dpc)에서 임신 여성에서 배아를 수확.
      참고: 배아 조직 수확 C57BL/6J (CD45.2) 쥐에서 앞에서 설명한 하 고 정확 하 게 무대에 따라 somite 수16. 우리 인구 배아 관련해 지역에서의 분석에 초점을 맞춘의 선구자, P-Sp, E11.5에 E9.5 사이 및 somite 준비 합니다.
    3. 배아20에서 AGM를 해 부.
      참고: murine 배아에서 AGM의 해 부에 대 한 자세한 프로토콜 되었습니다20다른 사람에 의해 출판. 또는, 노 른 자 삭 또는 pre-HSC 활동을 사칭 하는 다른 조직 수 또한 분석이 방법으로.
  2. 해 부 배아 조직 분리
    1. 해 부 조직 10 mL PBS 10%를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 수집 FBS 얼음에. 중력 조직 정착, PBS/FBS, 발음 하 고 즉시 25 분 동안 37 ° C 물 욕조에 0.25% 콜라 및 장소 1 mL을 추가.
    2. 약 20-30 배를 단일 세포 현 탁 액 1 mL 피 펫 팁 PBS/10% FBS와 피펫으로의 1 mL를 추가 합니다. PBS/10% FBS의 추가 8 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 셀 삭제는 상쾌한.

3. 항 체 Murine 배아 세포의 얼룩

  1. 항 체 얼룩이 지기에 대 한 블로킹 버퍼를 준비 합니다.
    1. 추가 10 µ g/mL 안티 마우스 CD16/CD32 (Fc 수용 체 (FcR) 블록)와 1 µ g/mL DAPI (H2O의 주식 1 mg/mL) 1 mL PBS 10 %FBS.
    2. 3 mL 주사기에 세우 고 소독 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 전달 합니다. 다시 셀 펠 릿 천연된 murine 배아 조직 (단계 2.2.2)에서 500 µ L 차단에서 버퍼링 하 고 5 분 동안 얼음에서 알을 품을 일시 중단 합니다.
  2. 항 체 혼합17준비.
    1. 10 µ g/mL FcR 블록 1 mL PBS 10%을 추가 FBS 및 10 µ L의 각 형광 색소 활용 된 안티-VE-Cadherin 항 체 (CD144, 테이블의 자료를 참조) 및 안티-EPCR 형광 색소 활용 된 항 체 (CD201, 테이블의 자료를 참조). Titrations에 따라 또는 제조업체의 권장 사항에 따라 명시 되지 않는 한 항 체의 최종 1: 100 희석을 사용 합니다.
      참고:이 항 체 조합이 사용 됩니다 정의 정렬, 게이츠 (4.2 단계) 아래 설명 된 대로. VE Cadherin의 공동 식에 따라 정렬 하 고 EPCR 관련해 파생 셀 포함 하는 앞에서 설명한17HSC 전조 활동의 부분에 대 한 중요 한 농축 수 있습니다.
    2. 개별 인덱스 정렬 선구자의 추가 phenotypic 분석에 대 한 추가 형광 색소 활용 된 항 체를 추가 합니다.
      참고:이 항 체 정의 정렬에 대 한 게이츠 반드시 사용 되지 않습니다. 이 샘플 프로토콜에서 우리는 안티-CD41 PE 활용 된 항 체와 hemogenic 내 피4에서에서 사전-HSC의 출현 동안 진화 이러한 조 혈 마커의 상대 식 분석 FITC 활용 된 안티 CD45 항 체를 포함 했다 ,5,,1617. 관심의 다른 표시가 원하는 대로 포함 될 수 있습니다. Isotype 형광 색소 활용 된 항 체 컨트롤과 스테인드 샘플 분석에 대 한 부정적이 고 긍정적인 게이츠를 정의 하는 데 사용 됩니다.
    3. 3 mL 주사기에 항 체 믹스를 인출 하 고 소독 하는 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 전달. 블로킹 버퍼, 혼합, 및 적어도 15-20 분 동안 얼음에서 알을 품을 피펫으로 세포 현 탁 액에 항 체 혼합의 500 µ L를 추가 합니다.
  3. 씻으십시오 스테인드 셀.
    1. 8 mL PBS/10% FBS를 추가 합니다. 5 분, aspirate, 및 셀을 다시 중단 1 mL PBS/10% FBS와 펠 렛에 대 한 300 x g에서 세포를 원심.
    2. 세포 현 탁 액 5 mL 튜브에 35 μ m 셀 스 트레이너 모자를 통해 pipetting 여 세포 덩어리를 제거 합니다. 추가 3 mL PBS/10% FBS와 셀 여과기를 세척. 5 분 x 300g에 세포를 원심, 발음, 다시 500 µ L에서 PBS/10% FBS, 일시 중지 및 FACS까지 얼음에 장소.

4. 지 공동 문화에 대 한 96-웰 스와 관련해 EC 기질에 단일 Hemogenic 선구자의 정렬

  1. 플레이트 모드 FACS 기계를 준비 하 고 제조업체의 지침에 따라 96 잘 접시에 정렬 정렬. 단일 셀 모드와 모드 최대 순도 마스크 설정 및 정렬 된 각 셀에 대 한 인덱스 매개 변수의 인수를 사용 하는 소프트웨어를 정렬 하는 인덱스를 선택 합니다.
  2. 정렬에 대 한 게이트를 설정 하는 샘플을 스테인드 항 체에서 세포의 샘플을 획득 합니다.
    1. FACS 기계에 얼룩진된 셀 샘플을 로드 하 고 최저 유량에 세포를 확보. FSC-A 구절 SSC-A와 선택 플롯 (pre-HSC 활동 관련해17프로 파일 다른 크기의 셀에 식별 되는 관측에 근거) 하는 다양 한 크기 (그림 1B)의 셀을 포함 하는 문. FSC-A 구절 FSC-W와 SSC A 구절 SSC-W, plot 고 게이트 남자 제외를 선택 합니다. FSC-A 구절 DAPI 라이브 셀 (DAPI 네거티브) 게이트를 다음 그림 (그림 1B).
    2. 대 PerCP (또는 EPCR 얼룩에 대 한 관련 형광 색소) PECy7 (또는 VE Cadherin 얼룩에 대 한 관련 형광 색소)를 플롯 합니다. 문 셀 VE Cadherin (포함 된 내 피 세포와 조 혈 창시자 및 pre-HSC AGM에서의 혼합된 인구)에 대 한 긍정적인 고 높은 EPCR 식 (P-Sp/AGM17에서 사전-HSC를 풍요롭게)입니다. 이것은 마지막 게이트 정렬 단계 4.3 (그림 1B)에서 단일 셀을 색인 하는 데 사용 됩니다.
    3. 플롯 추가 형광 얼룩에 사용 합니다.
      참고: 분석 부분 모집단에 따라 추가 게이츠 설정할 수 있습니다 기반으로 세포를 얼룩이 지기에 대 한 포함 하는 다른 마커 검출에. 그러나, 인덱스 정렬 수 있습니다 각 정렬 된 셀에 대 한 형광 매개 변수의 녹화를 이러한 매개 변수는 소급 분석 될 수 있다. 따라서,이 시점에서 필요 하다 아무 추가 게이팅. 모든 FACS 설정에 대 한 보상, 배경 염색에 대 한 계정 및 결정에 isotype 제어 항 체와 겹치는 형광의 방출에 다른 일에 대 한 계정 조정 샘플 단일 항 체와 스테인드를 사용 네거티브/포지티브 게이트입니다.
  3. 인덱스 정렬 관련해 셀.
    1. FACs 정렬 기계의 플레이트 블록에서 (1.5.3 단계)에서 cytokines와 관련해 혈 청 자유로운 미디어에 관련해 EC 기질 준비 96 잘 접시를 놓습니다. 샘플을 로드 하 고 샘플 수집을 시작 합니다. 인덱스 정렬/단일 셀 모드를 선택 하 고 개별 96-웰 스에 sortingsingle 셀을 시작. 낮은 흐름 속도 사용 하 여 배아 세포에 전단 응력을 최소화 하기 위해.
    2. 인덱스 정렬 하는 동안 모든 이벤트가 기록 됩니다 확인 합니다. 이 셀으로 웰 스에 기록 된 모든 이벤트를 정렬 됩니다 정렬 게이트는 실제 번호를 개별 정렬된 96-웰 스에, 상대 분석의 총 수의 열거를 수 있게 된다.
    3. 일단 셀 전체 96 잘 접시에 정렬 되었습니다, 5% CO2에서 설정 하는 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 실험 당 필요한 추가 번호판에 대 한 반복 합니다.
    4. 96-웰 스의 공동 문화 개별적으로 정렬 셀 AGM-EC (4.3 단계)에서 최대 7 일 (5 한 일 E10 10.5 배아에서 E9-9.5 배아에서 7 일 E11-11.5 배아에서 정렬 셀) 포함. 공동 문화 기간 후 100 배 확대 (그림 2B)에 거꾸로 현미경으로 다양 한 크기와 형태학의 조 혈 모 식민지를 시각화 합니다.
      참고: 미디어 공동 문화 기간 동안 변경 될 필요가 없습니다. 정렬 hemogenic 선구자 수 있습니다 처음 EC와 같은 형태와 관련해 EC 레이어로 통합과 관련해 EC 기질 (그림 2A)에서 처음 구분할 수 없습니다. 그러나, 공동 문화, 작은, 다음 24-48 h 반올림 조 혈 모 세포 또는 세포의 클러스터 검색 될 수 있습니다. 공동 문화 (5-7 일)의 끝에, 조 혈 모 세포의 개별 식민지 96-웰 스 받은 클론 조 혈 잠재력 정렬 된 셀의 하위 집합에 구상 될 수 있다. 시각적으로 검사 우물 하나 이상의 다른 식민지, 포함 경우이 샘플 잘 당 정렬 하는 하나 이상의 셀 받은 샘플을 제외 하려면 다운스트림 분석에서 제외 됩니다.

5. 공동 문화를 따르는 클론 조 혈 자손의 분석

  1. 각 96-잘 FACS 분석에서에서 클론을 수확.
    1. 적극적으로 피펫으로 200 µ L 피 펫 팁 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 내 피 층에서 조 혈 모 세포를 분리. 내 피 레이어를 분리 하지 마세요. FACS에 의해 조 혈 자손의 phenotypic 분석에 대 한 100 µ L의 샘플 (~ 50%)를 제거 합니다.
    2. 96-잘 V-하단 플레이트에 전송 및 작은 세포를 2 분 동안 300 x g에서 원심. 접시를 반전 하는 동안 단일 빠른 모션 접시에서 미디어를 터치 하 여 미디어를 제거 (영화 판).
    3. 나머지 100 µ L 셀 후속 engraftment 분석 결과 (6 단계)에서 사용 하는 37 ° C incubatorfor 원래 96 잘 접시에 놓습니다.
  2. 조 혈 모 분석에 대 한 적절 한 항 체와 세포를 품 어.
    1. 다시 10 µ g/mL FcR 블록 및 1 µ g/mL DAPI PBS/2% FBS의 50 µ L 96 잘 V-바닥의 각 잘에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 접시를 품 어.
    2. 10 µ g/mL FcR 블록 및 HSC 분석 PE Cyanine7 활용 된 안티-VE-Cadherin, PerCP 활용 된 안티-CD45, PE 활용 된 안티-EPCR, APC 활용 된 안티-Sca1, 및 안티-Gr1 FITC 활용에 대 한 항 체 믹스 PBS/2% FBS의 50 µ L을 추가 하 고 안티-f 4/80 (1: 100 최종 희석에서 각 항 체 또는 titrations에 따르면 제조업체의 권고에 따라 명시 되지 않는 한). 적어도 20 분 동안 4 ° C에서 접시를 품 어.
  3. 순차적 희석을 언바운드 항 체를 제거 하 고 세포를 분석.
    1. 300 x g 2 분 작은 셀에서 200 µ L/잘 PBS/2% FBS와 원심 분리기를 추가 합니다. 그런 다음 접시는 상쾌한 삭제 및 각 셀 펠 릿을 200 µ L PBS/2% FBS 추가 하 고 작은 세포를 2 분 동안 300 x g에서 원심을 터치 합니다.
    2. 접시는 상쾌한 취소 및 추가 분석을 위해 50 µ L/잘 PBS/2% FBS를 터치 합니다. FACS 교류 cytometer 장착 플레이트 리더를 사용 하 여 셀을 분석을 진행 합니다.
      참고: 셀 (예를 들어, 다시 서 스 펜 션에 사용 되는 총 50 µ L의 35 µ L)의 고정된 볼륨 확보 조 혈 자손의 하위 집합 열거.
  4. 조 혈 자손 HSC 잠재적인 (그림 3)를 포함 하는 식민지에 대 한 화면에 포함 된 각 잘 FACS 데이터를 분석 합니다.
    1. 먼저 게이트 CD45 긍정적인 인구는 Gr1와 F480 골수성 표식에 대 한 부정적 이다. 여전히 VE Cadherin의 저급을 표현 하는 세포 게이트 하지 마십시오. 조 혈 식민지의 수확 동안 중단 되는 AGM-EC 계층에서 세포는 VE Cadherin 긍정 및 부정적인 CD45.
    2. CD45 게이트+VE Cad-/Gr1-- F4/80 셀 EPCR과 Sca1의 높은 수준을 나타내는 하위 집합에 추가 (그림 3A -C).
      참고: 이전 연구, 식민지 CD45 셀 부족에+VE Cad-/Gr1--F4/80 Sca1안녕하세요EPCR안녕하세요 표현 형 (그림 3D) reproducibly 감지를 제공 하는 데 실패 multilineage 주변 혈액 engraftment 조사 받는 사람 마우스17 (데이터 표시 되지 않음); 따라서, 이러한 식민지 6 단계에서 다음 식 분석에 포함 되지 필요.

6. 개별 클론 및 Phenotypic 속성 인덱스 정렬 하 여 해명 Engraftment 속성의 분석

  1. 하루 (가능한 경우) 또는 다음 5 단계에서 phenotypic 분석 아침 다시 활기찬 pipetting 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 (단계 5.1)에서 공동 문화를 다음 각 96-잘 포함 된 조 혈 식민지에서 나머지 100 µ L 셀 중단.
  2. 준비 하 고 congenic 긴장 b 6의 전체 골 수에서 구조 셀을 추가 합니다. Ptprc SJL는는Pepcb/BoyJ (b 6 CD45.1) 성인 쥐16,17.
    1. 터키는 hemocytometer 솔루션 nucleated 골 셀을 계산 합니다. 5 x 10의 농도를 희석5 nucleated 세포/mL PBS에와 함께 2 %FBS.
    2. 각 잘 이식 분석에 대 한 조 혈 자손을 포함 하 게 구조 골 수 세포 (5 x 104) 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 혼합.
  3. 단일 치명적 방사능된 받는 사람 congenic 긴장 b 6에 개별 클론의 자손을 이식. Ptprc SJL는는Pepcb/BoyJ (b 6 CD45.1) 성인 마우스.
    1. 치명적 개별적으로 단일 클론 (세 슘 소스에서 사용 하는 1000 cGy)의 자손을 주입 하는 클론의 수로 b 6 CD45.1 쥐의 동일한 수를 비추는.
    2. ½ mL 인슐린 주사기에 29 G ½ 인치 바늘 200 µ L 총 세포 현 탁 액을 (5 x 104 b 6 CD45.1 구조 골 세포 뿐만 아니라 세포 복제를 포함)를 그립니다.
    3. 치명적 B6 CD45.1 성인 받는 사람 2-24 h 이전 주입에 비추는.
    4. 플라스틱 마우스 restrainer 꼬리 접근 허용을 사용 하 여, 각 클론의 세포와 받는 사람 생존에 도움이 5 x 104 b 6 CD45.1 성인 골 수 구조 셀 모두 포함 하는 꼬리 정 맥 200 µ L 볼륨을 통해 주사.
    5. 귀 태그 받는 사람 마우스 무게 하 고 정기적으로 그들의 무게/건강 체크 (예를 들어, 3-4 회 / 주 포스트 조사/이식, 또는 개별 기관 표준 운영 절차 당) 건강을 보장 하기 위해.
  4. 일정 한 간격 (예를 들어, 2, 16, 24 주) 주변 혈액 engraftment의 분석을 수행 다음 이식.
    1. 복고풍 궤도 도련 또는 다른 윤리적으로 승인 된 혈액 시키는 방법을 통해 혈액의 50-100 µ L을 제거 합니다.
    2. 혈액 3 mL 세포의 용 해 버퍼 (16.6 g NH4Cl, 2 세대 2 L H2O NaHCO3 및 74.4 mg EDTA)를 추가 하 고 PBS/2% FBS 5 분 원심 분리기 300 x 5 분 Aspirate에 대 한 g와 다시 2 mL와 펠 릿을 일시 중단에 대 한 실 온에서 품 어. 5 분에 대 한 300 x g에서 원심.
    3. 다시 150 µ L PBS/2% FBS 포함 10 µ g/mL FcR 블록와 1 µ g/mL DAPI, 펠 릿을 일시 중단 하 고 기증자 및 혈통, 혈통에 대 한 기증자와 isotype 컨트롤 잘 포함 50 µ L 항 체를 1/3에 대 한 잘 포함 50 µ L isotype 컨트롤 볼륨의 1/3을 분배 그리고 기증자 계보를 모두 감지 하 50 µ L 항 체를 포함 하는 우물을 1/3.
      참고: multilineage engraftment의 검출을 위한 항 체: APCeFluor780 활용 된 안티-CD45.2, Pe Cyanine7 활용 된 안티-CD45.1, FITC 활용 된 안티-CD3, PE 활용 된 안티-F4/80, PerCP 활용 된 안티-Gr1, 그리고 APC 활용 된 안티-CD19, 또는 관련 isotype 제어 합니다.
    4. CD45.2 (기증자)의 시간이 지남에 FACS에 의해 말 초 혈액 기여를 평가 하 여 장기 engraftment 클론 식별-골수성 (Gr1 또는 F4/80 양수), 조 혈 모 세포 파생 B 셀 (CD19 양수), 및 T-셀 (CD3 양성) (그림 4A -B).
      참고: 조 혈 engraftment CD45.2 (기증자)에 의해 분석 될 수 있다 또한-파생 조직 골 수, 비장, 흉 선, 및 복 막, 또는 골 수 세포의 2 차 이식 다음 수확에서 조 혈 인구에 기여 B6 CD45.1 직렬 engraftment 속성17분석 하 쥐로.
  5. 초기 단일 셀 인덱스 engraftment 속성으로 정렬 하 여 결정으로 각 클론의 phenotypic 속성을 연결 하십시오. 흐름 분석 소프트웨어를 사용 하 여 업로드 (96-잘 정렬 된 상관) 각 인덱스 정렬 셀 정렬 매개 변수. 그들의 기능 출력 (예를 들어 장기, multilineage engraftment)과 관련 된 단일 셀의 phenotypic 속성을 평가 하는 흐름 플롯에 기능 데이터 (그림 4C).

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결과

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그림 1A 는 실험적인 디자인의 회로도 보여준다. P-Sp/관련해 조직 해 부, 풀링, 그리고 콜라에 해리, 일단 그들은 인덱스 정렬에 대 한 VE Cadherin와 EPCR 항 체와 얼룩이 있습니다. 사전-HSC VE Cadherin+EPCR높은 (그림 1B)에 정렬 셀 농축 됩니다. 다른 형광 색소 활용 된 항 체는 소급 인덱스 정렬 하는 동안 각 셀에 대 한 기록 되는 추가 phenotypic 매개 변수를 분석에 포함 될 수 있습니다. E11 AGM에서 대표적인 실험에서 세포는 또한 FITC 활용 된 안티-CD45와 안티-CD41 PE 활용 된 항 체 얼룩이 진다. 이러한 조 혈 특정 표식에 대 한 VE Cadherin+EPCR높은 인구 내의 (...

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토론

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배아 개발 HSC 창세기 연구 HSC hemogenic 선구자 아직 이식 성인 받는 사람의 장기 multilineage 조 혈 재구성을 제공 하기 위해 능력 부족에서 가능성을 감지 하는 수단을 필요로 합니다. 이 프로토콜에서 선물이 배아 hemogenic 선구자의 클론 분석 결과 혈관 틈새 ECs stromal 공동 문화 지원 HSC에 선구자의 성숙, AGM에서 이식 분석 실험에서 후속 기능 분석. 허가 정렬 하는 인덱스의 phenotypic 매개 변수 사전-HSC 표면 표식으로 정의 된 속성 특성의 회고전 분석 분석 결과에 포함 됩니다. 이 방법은 효율적인 잠재적인 표식에 대 한 검사 수 있도록 다시 aggregation 기반 HSC 분석 실험4,5,10, 전조 인구의 대량 정렬에 의존 하는 다른 방법에 비해 이점을 제공합니다 사전-HSC 각 개별 셀에 대 한 ...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는 프레드 허 친 슨 흐름 Cytometry 코어에 FACS에 앤드류 버거, 스테이 시 Dozono, 그리고 브라이언 라덴을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 보조 공동 그랜트 #HL099997, 그리고 NIDDK 부여 #RC2DK114777 #HL100395, 건강 NHLBI UO1의 국가 학회 교부 금에 의해 지원 되었다. 브랜든 Hadland 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단 희망과 현대 바퀴 기초에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AGM-EC 배양 배지
내피 세포 배양을 위한 재료
TrypLE ExpressGibco12605-028AGM-EC 단층
젤라틴 0.1%를 물에서StemCell Technologies7903AGM-EC 단층을 플라스틱
에 접착하는 데 사용96웰 조직 배양 플레이트Corning3599AGM-EC 단층 및 인덱스 정렬된 클론
Dulbecco의 PBS(Phosphate Buffered Saline)Gibco14190-144해부 및 FACS 염색에 사용
500ml 필터 병Fisher Scientific9741202내피 배지
<강력한>AGM-EC 배양 배지(500mls)
Iscove의 변형 된 Dulbecco의 매체 (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal Bovine SerumFisher ScientificSH30088.03100 mls
페니실린 스트렙토 마이신Gibco15140-1225 mls
헤파린시그마H314950 mg을 10 mls 배지
L- 글루타민 (200 mM)에 용해StemCell Technologies71005 mls
내피 미토겐 (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)10 mls 매체를 추가하여 용해 및 추가
AGM 인덱스 정렬용 재료
Collagenase(0.25%)StemCell Technologies7902배아 조직 해리에 사용
3ml 주사기BD Biosciences309657에 대한 필터 항체 용액을 멸균하는 데 사용합니다
. M 주사기 구동 필터MilliporeSLGP033RS용 항체 용액을 멸균하는 데 사용
Corning352235FACS DAPI 이전에 세포 덩어리를 제거하는 데 사용
(H2O에서 1mg/ml 재고로 준비)Millipore268298정렬에서 죽은 세포를 제외하는 데 사용
BDBiosciences553141Fc 수용체에 대한 비특이적 염색을 차단하는 데 사용
항체
안티-마우스 CD144 PE-Cyanine7eBioscience25-1441-82염색
쥐 IgG1 카파 이소타입 대조군, PE-Cyanine7eBioscience25-4301-81CD144용 이소타입 대조군 PE-Cyanine7
안티-마우스 CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80염색
쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80CD201 PerCP-eFluor710
안티 마우스 CD41 PEBD Biosciences558040염색
쥐 IgG1 카파 이소타입 제어, PEBD Biosciences553925CD41
PE 안티 마우스 CD45 FITC용 이소타입 제어eBioscience11-0451-85염색
쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, FITCeBioscience11-4031-81CD45 FITC
AGM-serum free media(10mls)용 이소타입 제어
X-Vivo 20Lonza04-448Q10mls
재조합 쥐 줄기 세포 인자(SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 100 ng/ml
재조합 human FLT3 리간드 (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 100 ng/ml
재조합 human thrombopoietin (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 20 ng/ml
재조합 쥐 인터루킨-3 (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 20 ng/ml
공동 배양 세포 염색용 재료
96 웰 플레이트, V-bottomCorning3894FACS 분석에 사용
항체 내피 세포와 공동 배양된 인덱스 정렬 클론 분석을 위한 항체
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-0451-82염색
쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PE-Cyanine5.5eBioscience35-4031-80CD45 PerCP-Cyanine5.5
안티 마우스 CD201 (EPCR)eBioscience12-2012-82염색
쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PEeBioscience12-4031-81CD201 PE
안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1)에 대한 이소타입 제어 APCeBioscience17-5981-83염색
쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, APCeBioscience17-4321-81Ly-6A/E
APC 안티 마우스 F4/80 FITCeBioscience11-4801-81염색
쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, FITCeBioscience11-4321-41F4/80 FITC
안티 마우스 Ly-6G/C(Gr1) FITCBD Biosciences553127염색
쥐 IgG2b 카파 이소 타입 제어, FITCBD Biosciences556923Ly-6G / C 및 CD3 용 이소 타입 제어 FITC
이식 용 꼬리 정맥 주사 용 재료< / strong>
1 / 2 ml 인슐린 주사기, 29G 1 / 2 "바늘BD Biosciences309306이식을위한 꼬리 정맥 주사에 사용
<>translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCPBiolegend400629Isotype Control
Anti-mouse F4/80 PEeBioscience12-4801-82Staining
쥐 IgG2a 카파 이소 타입 제어, PEeBioscience12-4321-80F4 / 80 PE
안티 마우스 CD3 FITCBD Biosciences555274염색
안티 마우스 CD19 APCBD Biosciences550992염색
쥐 IgG2a 카파 이소 타입 제어, APCBD Biosciences553932CD19 APC
안티 마우스 CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 용 이소 타입 제어eBioscience25-0453-82염색
쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-81CD45.1 PE-Cyanine7
안티 마우스 CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82염색
쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80CD45.2 APC-eFluor780에 대한 이소타입 제어
Equipment
BD FACSAria II with DIVA softwareBD Biosciences
BD FACSCanto II with plate readerBD Biosciences
HaemocytometerFisher ScientificS17040세포 계수용
다중 채널 피펫Fisher Scientific14-559-417용 디스펜싱 셀
FACS 분석 소프트웨어FlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
해리하는 데 사용 를 공동 배양하는 데 사용 FACS 0.22 µ 세포 여과기 캡이 있는 FACS 5ml 폴리스티렌 튜브 마우스 CD16/CD32(FcR 블록) 에 대한 이소타입 제어 PE 용 이소타입 제어 후 말초 혈액 분석을 위한 항체 PerCP

참고문헌

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