여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.
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방법 논문
단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석
이 논문에서
요약
초록
배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 (HSC) 창세기를 공부 하는 능력은 초기 배아에 HSC 선구자의 희귀 한 고 기능의 장기 multilineage engraftment 잠재력을 식별 하는 분석 실험의 부족에 의해 제한 되어 개별 putative HSC 선구자입니다. 여기, 우리가 격리와 단일 세포 수준에서 기능적으로 검증된 HSC 선구자의 방법론을 설명 합니다. 첫째, 우리 활용 개별적으로 정렬 된 각 셀의 정확한 phenotypic 매개 변수 카탈로그 인덱스 정렬 phenotypic 감 적의 조합 실험 분석에 대 한 추가 마커 HSC 선구자에 대 한 풍부 하 게 사용 하 여. 둘째, 각 인덱스 정렬 셀이 공동 지 원하는 multilineage, 장기 engraftment에서 가능성과 기능성 HSC에 HSC 선구자 비 engrafting의 성숙 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에서 혈관 틈새 기질과 교양 이식 분석 실험입니다. 이 방법을 수 있도록 그들의 기능적인 engraftment 잠재력 클론 hemogenic 선구자의 phenotypic 속성 또는 HSC 전조의 상세한 분석을 위한 수단을 제공 하는 transcriptional 프로필 등의 다른 속성의 상관 관계 단일 세포 수준에서 개발입니다.
서론
클론 연구 노화1동안 HSC 하위 및 HSC 행동의 변화에 새로운 통찰력을 제공 하는 성인 HSCs의 장기 engraftment 속성에서이 밝혀졌다. 그러나, 배아 HSCs의 비슷한 연구와 그들의 선구자 되었습니다 더 많은 도전. HSCs 과도 과정에서 내 피 hemogenic 라고 알려진 선구자의 인구에서 발생 하는 초기 배아 개발 중으로 조 혈 전환2내 피. 강력 하 고, 장기 이식 조건된 성인 받는 사람에 따라 multilineage engraftment를 제공 하는 그들의 능력에 의해 정의 된 첫 번째 HSC 배아 이날 10.5 (E10.5) murine 태아에 매우 낮은 주파수3 이후까지 검색 되지 않습니다. . 그들의 발전 동안 3300 HSC (pre-HSC) hemogenic 피에서 발생 하는 이식 분석 실험4,5 에서 효율적인 engraftment 허용 성인 HSC의 속성을 획득 하기 전에 성숙 겪어야 한다 , 6. 희귀 HSC 기원, 다양 한 erythroid와 조 혈 창시자의 연구....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 프레드 허 친 슨 암 연구 센터에 의해 승인 되었습니다.
1. AGM-EC Monolayers 공동 문화에 대 한 준비
- 24 시간 이전에 관련해 해 부 정렬, AGM-EC 문화 미디어와 소독 필터를 확인 합니다.
- 물 (100 µ L/잘)에 0.1% 젤라틴 96 잘 접시의 각 음을 추가 하 고 15 분 Aspirate는 젤라틴에 대 한 실 온에서 품 어 두고 접시 조직 문화 후드에서 뚜껑 우물 건조 될 때까지 제거.
-
AGM-EC monolayers 및 96 잘 접시 접시 해리.
참고: 앞에서 설명한16, AGM-EC 문화 미디어에서 준비 관련해 EC 유지 합니다. 일관성을 위해 AGM-EC 셀 라인 최대한 빨리 충분 한 숫자 (일반적으로 통로 1-3) 얻을 수 있습니다 냉동 고 공동 배양 실험에 대 한 정의 통로 번호 (일반적으로 통로 5-12)에 사용 될 해야 합니다. AGM-EC 셀 라인 C57BL/6J (CD45.2) 관련해에서에서 파생 됩니다. 모든 미디어 구성에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십....
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결과
그림 1A 는 실험적인 디자인의 회로도 보여준다. P-Sp/관련해 조직 해 부, 풀링, 그리고 콜라에 해리, 일단 그들은 인덱스 정렬에 대 한 VE Cadherin와 EPCR 항 체와 얼룩이 있습니다. 사전-HSC VE Cadherin+EPCR높은 (그림 1B)에 정렬 셀 농축 됩니다. 다른 형광 색소 활용 된 항 체는 소급 인덱스 정렬 하는 동안 각 셀에 대 한 기록 되는 추가 phenotypic 매개 변수를 분석에 포함 될 수 있습니다. E11 AGM에서 대표적인 실험에서 세포는 또한 FITC 활용 된 안티-CD45와 안티-CD41 PE 활용 된 항 체 얼룩이 진다. 이러한 조 혈 특정 표식에 대 한 VE Cadherin+EPCR높은 인구 내의 (.......
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토론
배아 개발 HSC 창세기 연구 HSC hemogenic 선구자 아직 이식 성인 받는 사람의 장기 multilineage 조 혈 재구성을 제공 하기 위해 능력 부족에서 가능성을 감지 하는 수단을 필요로 합니다. 이 프로토콜에서 선물이 배아 hemogenic 선구자의 클론 분석 결과 혈관 틈새 ECs stromal 공동 문화 지원 HSC에 선구자의 성숙, AGM에서 이식 분석 실험에서 후속 기능 분석. 허가 정렬 하는 인덱스의 phenotypic 매개 변수 사전-HSC 표면 표식으로 정의 된 속성 특성의 회고전 분석 분석 결과에 포함 됩니다. 이 방법은 효율적인 잠재적인 표식에 대 한 검사 수 있도록 다시 aggregation 기반 HSC 분석 실험4,5,10, 전조 인구의 대량 정렬에 의존 하는 다른 방법에 비해 이점을 제공합니다 사전-HSC 각 개별 셀에 대 한 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 프레드 허 친 슨 흐름 Cytometry 코어에 FACS에 앤드류 버거, 스테이 시 Dozono, 그리고 브라이언 라덴을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 보조 공동 그랜트 #HL099997, 그리고 NIDDK 부여 #RC2DK114777 #HL100395, 건강 NHLBI UO1의 국가 학회 교부 금에 의해 지원 되었다. 브랜든 Hadland 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단 희망과 현대 바퀴 기초에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AGM-EC 배양 배지 | |||
| 내피 세포 배양을 위한 재료 | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | AGM-EC 단층 |
| 젤라틴 0.1%를 물에서 | StemCell Technologies | 7903 | AGM-EC 단층을 플라스틱 |
| 에 접착하는 데 사용96웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3599 | AGM-EC 단층 및 인덱스 정렬된 클론 |
| Dulbecco의 PBS(Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190-144 | 해부 및 FACS 염색에 사용 |
| 500ml 필터 병 | Fisher Scientific | 9741202 | 내피 배지 |
| <강력한>AGM-EC 배양 배지(500mls) | |||
| Iscove의 변형 된 Dulbecco의 매체 (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| 페니실린 스트렙토 마이신 | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| 헤파린 | 시그마 | H3149 | 50 mg을 10 mls 배지 |
| L- 글루타민 (200 mM) | 에 용해StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| 내피 미토겐 (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | 10 mls 매체를 추가하여 용해 및 추가 |
| AGM 인덱스 정렬용 재료 | |||
| Collagenase(0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | 배아 조직 해리에 사용 |
| 3ml 주사기 | BD Biosciences | 309657 | 에 대한 필터 항체 용액을 멸균하는 데 사용합니다 |
| . M 주사기 구동 필터 | Millipore | SLGP033RS | 용 항체 용액을 멸균하는 데 사용 |
| Corning | 352235 | FACS DAPI 이전에 세포 덩어리를 제거하는 데 사용 | |
| (H2O에서 1mg/ml 재고로 준비) | Millipore | 268298 | 정렬에서 죽은 세포를 제외하는 데 사용 |
| BD | Biosciences | 553141 | Fc 수용체에 대한 비특이적 염색을 차단하는 데 사용 |
| 항체 | |||
| 안티-마우스 CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | 염색 |
| 쥐 IgG1 카파 이소타입 대조군, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | CD144용 이소타입 대조군 PE-Cyanine7 |
| 안티-마우스 CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | 염색 |
| 쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | CD201 PerCP-eFluor710 |
| 안티 마우스 CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | 염색 |
| 쥐 IgG1 카파 이소타입 제어, PE | BD Biosciences | 553925 | CD41 |
| PE 안티 마우스 CD45 FITC | 용 이소타입 제어eBioscience | 11-0451-85 | 염색 |
| 쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | CD45 FITC |
| AGM-serum free media(10mls)용 이소타입 제어 | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10mls |
| 재조합 쥐 줄기 세포 인자(SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 100 ng/ml |
| 재조합 human FLT3 리간드 (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 100 ng/ml |
| 재조합 human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 20 ng/ml |
| 재조합 쥐 인터루킨-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) 최종 농도 20 ng/ml |
| 공동 배양 세포 염색용 재료 | |||
| 96 웰 플레이트, V-bottom | Corning | 3894 | FACS 분석에 사용 |
| 항체 내피 세포와 공동 배양된 인덱스 정렬 클론 분석을 위한 항체 | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | 염색 |
| 쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| 안티 마우스 CD201 (EPCR) | eBioscience | 12-2012-82 | 염색 |
| 쥐 IgG2b 카파 이소타입 제어, PE | eBioscience | 12-4031-81 | CD201 PE |
| 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1)에 대한 이소타입 제어 APC | eBioscience | 17-5981-83 | 염색 |
| 쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Ly-6A/E |
| APC 안티 마우스 F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | 염색 |
| 쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | F4/80 FITC |
| 안티 마우스 Ly-6G/C(Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | 염색 |
| 쥐 IgG2b 카파 이소 타입 제어, FITC | BD Biosciences | 556923 | Ly-6G / C 및 CD3 용 이소 타입 제어 FITC |
| 이식 용 꼬리 정맥 주사 용 재료< / strong> | |||
| 1 / 2 ml 인슐린 주사기, 29G 1 / 2 "바늘 | BD Biosciences | 309306 | 이식을위한 꼬리 정맥 주사에 사용 |
| <>translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype Control |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| 쥐 IgG2a 카파 이소 타입 제어, PE | eBioscience | 12-4321-80 | F4 / 80 PE |
| 안티 마우스 CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | 염색 |
| 안티 마우스 CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | 염색 |
| 쥐 IgG2a 카파 이소 타입 제어, APC | BD Biosciences | 553932 | CD19 APC |
| 안티 마우스 CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 용 이소 타입 제어 | eBioscience | 25-0453-82 | 염색 |
| 쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | CD45.1 PE-Cyanine7 |
| 안티 마우스 CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | 염색 |
| 쥐 IgG2a 카파 이소타입 제어, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | CD45.2 APC-eFluor780에 대한 이소타입 제어 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | 세포 계수용 |
| 다중 채널 피펫 | Fisher Scientific | 14-559-417 | 용 디스펜싱 셀 |
| FACS 분석 소프트웨어 | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
참고문헌
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development.
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재인쇄 및 허가
