인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법

요약

반자동된 워크플로 인간 우유와 다른 낮은 바이오 매스 샘플 종류에서 16S rRNA의 타겟된 시퀀싱에 대 한 제공 됩니다.

초록

미생물 커뮤니티 연구는 상대적으로 신속, 저렴 하 고 높은 처리량 시퀀싱의 개발을 광범위 하 게 되었다. 그러나, 이러한 모든 기술에서와 마찬가지로 재현 결과 실험실 워크플로 통합 하는 적절 한 예방 조치 및 컨트롤에 따라 다릅니다. 이것은 특히 낮은 바이오 매스 샘플 중요 어디 세균 DNA 오염 잘못 된 결과 생성할 수 있습니다. 이 문서 낮은-에 중순-throughput 규모에 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 지역의 타겟된 시퀀싱을 사용 하 여 인간 유 방 우유 샘플에서 미생물을 식별 하는 반자동된 워크플로 자세히 설명 합니다. 프로토콜 설명 전체 우유 등에서 샘플 준비: 세포, 핵 산 추출, 증폭, 16S rRNA 유전자 및 품질 관리 조치 라이브러리 준비 V4 영역의 샘플. 프로토콜 및 토론 준비와 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, PCR 반응 억제제 제거, 샘플 오염 환경, 시 약, 포함 하는 낮은 바이오 매스 샘플의 분석을 돌출 하는 문제를 고려 하는 중요 한 것은, 또는 실험 소스, 고 재현성을 보장 하도록 설계 된 실험 모범 사례. 프로토콜을 설명 하는 대로 인간 우유 샘플, 면봉, 깔끔한, 또는 보존 버퍼에 안정 냉동에 수집 된 샘플을 포함 한 수많은 낮은 및 높은 바이오 매스 샘플 종류에 적응은.

서론

인간 식민지 미생물 지역 사회는 인간의 건강과 신진 대사, 면역 발달, 질병 민감성과 예방 접종과 약물 치료^1, 에 대 한 응답에 영향을 미치는 질병에 매우 중요 한 것으로 ². 현재 인간의 건강에는 microbiota의 영향을 이해 하는 노력 강조 뿐만 아니라 지역화 된 사이트 정의 해부학 구획 (즉, 피부, 창 자, 구두, 등), 관련 된 미생물의 식별 이러한 구획^3,4. 이러한 조사 활동을 underpinning 급속 한 출현 및 샘플의 미생물 유전 콘텐츠 (미생물)의 분석에 대 한 대규모 병렬 플랫폼을 제공 하는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 증가 접근성입니다. 많은 생리 샘플, 관련 된 미생물은 복잡 하 고 풍부한 (즉,의 자), 하지만, 일부 샘플은 미생물 어디 낮은 미생물 바이오 매스 (즉, 인간의 우유, 낮은 호흡기)로 표현 됩니다 감도, 실험적인 인공 물, 및 가능한 오염 될 주요 문제. 미생물 연구와 적절 한 실험적인 디자인의 공통 과제 여러 검토 기사⁵

프로토콜

모든 프로토콜 단계에 대 한 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다, 그리고 엄격한 오염 예방 방법을 수행 해야 합니다. 샘플의 오염을 최소화 하기 위해 후 증폭 작업 영역에 영역을 작동 하는 사전 증폭에서 작품의 흐름을 관찰 합니다. 사용 하는 모든 공급은 살 균, RNase, DNase, DNA, pyrogen의 무료 이다. 모든 피 펫 팁 필터링 됩니다. 프로토콜 단계의 순서도 (그림 1)를 제공 됩니다.

1. 샘플 세포

참고: 샘플 세포 및 핵 산 추출 클린 룸 환경에서 DNA/RNA 추출 키트를 사용 하 여 엔지니어링 및 절차적 컨트롤 샘플에 환경 박테리아의 도입을 최소화 하에서는 수행 됩니다.

1. 작업 영역 준비
   1. 깨끗 한 biosafety 내각 (BSC) 핵 산 오염을 제거 하기 위해 적절 한 표면 청소기 영역을 작동 합니다.
   2. 온도 제어 vortexer, 설정 하 고 37 ° c.에 설정
2. Guanidinium 안산 세포의 용 해 버퍼를 준비 (재료의 표 참조)....

결과

여기에 제시 된 프로토콜 데이터 생성 충족 프로토콜 감도, 특이성, 및 오염 제어에 대 한 벤치 마크 되도록 중요 한 품질 관리 (QC) 조치를 포함 합니다. 프로토콜의 QC 첫걸음 16 v 4 지역 (그림 2)의 PCR 증폭을 다음과 같습니다. 각 샘플에서 PCR 제품의 1 개의 µ L 315-450 bp (그림 2, 빨간 화살표)의 예상된 크기 범위 내에서 그것은 확인을 위해 전기 이동 법으로 분석 했다. 인간의 우유 샘플 특정 제품의 낮은 금액을 생성 (그림 2A, 3, 9-11 레인 비교 레인 4-8), 추출 하는 동안 그 샘플, 또는 PCR 억제제의 이성 미생물 DNA를 추출 하는 중 저급의 제안. 2.0 보다는 더 적은 생성 하는 샘플에 대 한 PCR 억제제 정리 315-450 혈압 범위 (

토론

16S rRNA의 타겟된 다음-세대 시퀀싱 미생물 특성화¹⁸에 대 한 널리 사용 되 고, 급속 한 기술입니다. 그러나, 일괄 처리 효과, 환경 오염, 샘플 교차 오염을, 감도, 재현성 등 많은 요인 수 부정적인 실험 결과 영향을 하 고 그들의 해석^7,19 혼동 ^{, 20}. 가장 강력한 16S 분석을 용이 하 게에 미생물 워크플로 좋은 실험 디자인, 적절 한 컨트롤의 사용, 워크플로 단계의 공간 분리 및 최상의 방법의 응용 프로그램을 통합 해야 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 이러한 매개 변수 각각의 통합 하 고 위의 문제를 해결 하 고 다양 한 샘플에 대 한 16 워크플로 구현 하는 중요 한 실험 도구를 제공 합니다.

좋은 실험 디자인은 16S 미생물 분석을 위한 중요 합.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AllPrep RNA/DNA 미니 키트	Qiagen	80204	DNA/RNA 추출 키트
Eliminase	Fisher Scientific	435532	RNase, DNase, DNA 오염 제거
Thermo Mixer	Fisher Scientific		온도 제어 와류
버퍼 RLT plus	Qiagen		1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Allprep 키트
의 일부ß-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689-25ML-F	ß-ME는 이황화 결합,
LME 비드,	MP Biomedicals	116914050	비드 튜브
QIAgen, Tissue
를 감소시켜 RNase를 비가역적으로 변성시키는 환원제입니다.키트에 들어 있는 QIAgen RB 튜브			제조업체의 마이크로 원심분리기 튜브
QIAcube 및 관련 플라스틱 용기	Qiagen	9001292	자동 DNA/RNA 정제 기기
DNA exitus plus	Applichem	A7089	비효소 오염 제거 용액
EB 완충액	Qiagen	19086	용출 완충액
QIAgility 및 관련 플라스틱 용기	Qiagen	9001532	로봇 액체 처리기
PCR 물	MO BIO	17000-5PRIME
HotMasterMix	Quantabio	2200400
바코드 리버스 프라이머	Eurofin	No Catalog #	설계 및 주문
96 웰 PCR 플레이트	USA scientific	1402-9708
Tapestation 2200 및 관련 플라스틱 제품	Tapestation	G2964AA	자동 DNA/RNA 단편 분석기
D1000 시약			시료 완충액 및 래더는 이 키트의 일부입니다
OneStep PCR 억제제 제거 키트	Zymo Research	50444470	PCR 억제제 제거는 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다.
QIAquick PCR 정제 키트,	Qiagen	28104	DNA 클린업 키트: PCR 산물의 실리카막 기반 정제
Qubit dsDNA HS 분석 키트	Thermo Fisher	Q32854	디메틸설폭사이드 기반 희석 완충액 및 염료가 이 키트의 일부입니다.
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MiSeq 300 V2 kit	Illumina	15033624/15033626
MiSeq	Illumina	카탈로그 없음 #의	차세대 시퀀서

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