초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

요약

미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.

초록

그것은 알려졌다 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)의 최대 12 효소 소스 포함 될 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분 플 라빈 종속 된 호흡 단지 등 초과 (₂O^●-), 과산화 수소 (H₂O₂)의 혼합물을 생성 하는 dehydrogenases. 고립 된 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트의 선생님 생산 잠재력의 정확한 정량화의 항 산화 방어 시스템 측면 또한 O₂●/H₂O₂를 형성 하는 존재 인 전하실 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 생체를 중단 시킬 수 있는 일반적인 반응 억제제의 사용 또한 생산의 다른 사이트에서 선생님 자료를 변경 하 여 측정을 손상 수 있습니다. 여기, 우리는 정화 플 라빈에 연결 된 dehydrogenases에 의해 H₂O₂ 릴리스 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 생산의 동시 측정을 위한 쉬운 방법 제시. 여기 우리의 목적을 위해 순화 된 pyruvate 효소 복합물 (PDHC)와 α ketoglutarate 효소 복잡 한 (KGDHC) 돼지 심장 근원의 예제로 사용 했습니다. 이 메서드는 네이티브 H₂O₂ 릴리스 요금 생산의 개별 사이트의 정확한 측정을 위해 선생님과 항 산화 시스템의 다른 잠재적인 소스를 제거 하 여 수 있습니다. 또한,이 메서드는 H₂O₂ 출시와 효소 활동, 효과의 심사 및 선생님 생산 억제제의 선택 간의 관계의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 전반적으로,이 접근의 네이티브 선생님 릴리스 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육 섬유 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 효소의 심층 평가 대 한 수 있습니다.

서론

영양소 대사의 궁극적인 목표는 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 만드는 것입니다. 포유류 세포에서이 미토 콘 드리 아, 탄소에 ATP에 저장 된 에너지를 변환 하는 더블 membraned 세포에서에서 발생 합니다. ATP의 생산에는 탄소는 두 명의 전자 사업자, NADH, 플 라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FADH₂)¹을 형성 하는 미토 콘 드리 아에 의해 combusted 때 시작 됩니다. NADH와 FADH₂ 는 다음 산화 다 소 단위 호흡기 복합물에 의해 I 및 II, 각각, 그리고 자유 전자는 터미널 전자 수락자 분자 산소 (O₂) 복잡 한 4¹에 ferried. 열역학으로 호의 베푸는 "내리막" 전송 전자의 O₂ 는 체인의 끝에는 양성자의 수출에는 intermembrane에 결합 I, III, 및 IV 단지에 의해 공간. 이 양성자 (양성자 동기 힘), 임시 형태의 ATP²를 만들기 위해 복잡 한 V에 의해 도청 깁스 자유 에너지의 막 횡단 전기 그라디언트를 만듭니다. 미토 콘 드리 아에서 전자 이동 반응은 ATP 생산을 완벽 하 게 결합 하지. Krebs 사이클 및 호흡기 체인에....

프로토콜

1. 화학 물질 고 정화 효소

1. 다음과 같은 재료를 조달: PDHC 및 KGDHC 돼지 심장 근원 (또는 다른 정화 미토 콘 드 리아 flavoenzyme); H₂O₂ (30% 솔루션), pyruvate, α ketoglutarate 나드⁺, NADH, CoASH, 티 아민 파이 인산 (TPP), 마 니 톨, HEPES, 자당, EGTA, 3-메 틸-2-옥 valeric 산 (KMV), superoxide dismutase (잔디), 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 시 약 (AUR), 그리고 CPI-613.

2. 분석 결과 및 시 약 준비 계획

1. 96 잘 접시에 표 1 에 따라 분석 결과를 설정 합니다.
   참고: 각 반응에 대 한 전체 볼륨은 200 µ L. 주식 농도의 시 약 20 µ L 추가 되도록 조정 하는 각 음에. 그러면 공동 인자와 잘 분석 결과 시작 하기 전에 각 반응에 기판의 급속 한 추가.
2. 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 1mm EGTA, 및 20 mM HEPES (HCl로 pH 7.4)를 포함 하....

결과

그림 3A 순화 KGDHC에 의해 H₂O₂ 와 NADH 생산의 동시 측정 하는 동안 수집 된 RFU에 대 한 대표적인 추적을 제공 합니다. 각 시간 간격에 대 한 원시 RFU 데이터는 그림 3B에서 묘사 된다. 원시 RFU 데이터 분석에 대 한 다음 내보내집니다. 그림 2에 제시 하는 표준 곡선에서 추정 하 여 NADH와 H₂O₂ 5 분 동안 각 측정 간격에서 형성의 절대 금액을 확인할 수 있습니다. 이 계산의 예는 표 3에서 제공 됩니다. 에 의해 형성 된 NADH와 H₂O₂ 의 양을 일단 KGDHC 또는 다른 간격 PDHC 결정, 값이 복사 되 고 추가 분석을 위.......

토론

이 프로토콜은 이후 유리, 1) 그것은 어떤 경쟁 반응을 방해할 수 있는 그렇지 않으면 H₂O₂ 감지 (예, 항 산화 시스템 또는 기타 소스 선생님의), 2를 제거)의 기본 속도의 직접 평가 제공 선생님 분리를 포함 하는 플 라빈 미토 콘 드리 아 효소, 3) 원시의 비교를 허용 한다 선생님 릴리스 2의 속도 또는 더 정화 플 라빈 기반 dehydrogenases, 4) 선생님과 효소 활동, 및 5의 속도의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다) 선생님 자료에 대 한 선택적 경쟁력 억제제의 수 있습니다. 우리의 그룹 및 다른 사람 사용이 메서드 이전 간행물 allosteric 여 선생님의 규칙을 검사와 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육^{14,16, 산화 환 원 신호 메커니즘 실시 전에 실험 17}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피루브산 탈수소효소 복합체	SIGMA	P7032-10UN	정제 플라보엔자임
알파-케토글루타레이트 탈수소효소 복합체	SIGMA	K1502-20UN	정제 플라보효소
30% 과산화수소 용액	SIGMA	HX0640-5	시약, 표준 곡선
NAD+	SIGMA	N0632-1G	시약, 활성/ROS 방출 분석
NADH	SIGMA	N4505-100MG	시약, 표준 곡선
피루브산	SIGMA	P2256-5G	시약, 활성/ROS 방출 분석,
알파-케토글루타레이트	SIGMA	75892-25G	시약, 활성/ROS 방출 분석,
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	시약, 활성/ROS 방출 분석
티아민 피로인산	SIGMA	C8754-1G	시약, 활성/ROS 방출 분석
만니톨	SIGMA	M4125-100G	완충 성분
Hepes	SIGMA	H3375-25G	완충 성분
자당	SIGMA	S7903-250G	완충 성분
EGTA	SIGMA	E3889-10G	완충 성분
KMV	SIGMA	198978-5G	시약, ROS 방출 억제제
CPI-613	산타 크루즈	sc-482709	시약, ROS 방출 억제제
SOD	SIGMA	S9697-15KU	시약, ROS 방출 감지
양고추냉이 과산화효소	SIGMA	P8375-1KU	시약, ROS 방출 감지
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	시약, ROS 방출 검출
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