초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

요약

미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.

초록

그것은 알려졌다 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)의 최대 12 효소 소스 포함 될 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분 플 라빈 종속 된 호흡 단지 등 초과 (₂O^●-), 과산화 수소 (H₂O₂)의 혼합물을 생성 하는 dehydrogenases. 고립 된 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트의 선생님 생산 잠재력의 정확한 정량화의 항 산화 방어 시스템 측면 또한 O₂●/H₂O₂를 형성 하는 존재 인 전하실 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 생체를 중단 시킬 수 있는 일반적인 반응 억제제의 사용 또한 생산의 다른 사이트에서 선생님 자료를 변경 하 여 측정을 손상 수 있습니다. 여기, 우리는 정화 플 라빈에 연결 된 dehydrogenases에 의해 H₂O₂ 릴리스 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 생산의 동시 측정을 위한 쉬운 방법 제시. 여기 우리의 목적을 위해 순화 된 pyruvate 효소 복합물 (PDHC)와 α ketoglutarate 효소 복잡 한 (KGDHC) 돼지 심장 근원의 예제로 사용 했습니다. 이 메서드는 네이티브 H₂O₂ 릴리스 요금 생산의 개별 사이트의 정확한 측정을 위해 선생님과 항 산화 시스템의 다른 잠재적인 소스를 제거 하 여 수 있습니다. 또한,이 메서드는 H₂O₂ 출시와 효소 활동, 효과의 심사 및 선생님 생산 억제제의 선택 간의 관계의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 전반적으로,이 접근의 네이티브 선생님 릴리스 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육 섬유 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 효소의 심층 평가 대 한 수 있습니다.

서론

영양소 대사의 궁극적인 목표는 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 만드는 것입니다. 포유류 세포에서이 미토 콘 드리 아, 탄소에 ATP에 저장 된 에너지를 변환 하는 더블 membraned 세포에서에서 발생 합니다. ATP의 생산에는 탄소는 두 명의 전자 사업자, NADH, 플 라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FADH₂)¹을 형성 하는 미토 콘 드리 아에 의해 combusted 때 시작 됩니다. NADH와 FADH₂ 는 다음 산화 다 소 단위 호흡기 복합물에 의해 I 및 II, 각각, 그리고 자유 전자는 터미널 전자 수락자 분자 산소 (O₂) 복잡 한 4¹에 ferried. 열역학으로 호의 베푸는 "내리막" 전송 전자의 O₂ 는 체인의 끝에는 양성자의 수출에는 intermembrane에 결합 I, III, 및 IV 단지에 의해 공간. 이 양성자 (양성자 동기 힘), 임시 형태의 ATP²를 만들기 위해 복잡 한 V에 의해 도청 깁스 자유 에너지의 막 횡단 전기 그라디언트를 만듭니다. 미토 콘 드리 아에서 전자 이동 반응은 ATP 생산을 완벽 하 게 결합 하지. Krebs 사이클 및 호흡기 체인에 여러 지점에서 전자 중간 형태로 선생님³O₂ 작용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아에서 생성 된 가장 생물학적으로 관련 선생님은 O₂^●- H₂O₂. O₂^●- 종종 간주 됩니다 미토 콘 드리 아에 의해 형성 된 근 선생님, 비록 그것은 생산의 관련 된 자유 O₂^●- 및 H₂O₂의 혼합물 형성 분명 지금 보 플 라빈의 급진적인 화학 그룹^4,5. 높은 수준에서 선생님 위험할 수 있습니다, 손상 산화 조⁶의 결과로 세포 기능에 필요한 생물 학적 성분. 그러나, 낮은 금액에서 미토 콘 드리 아 선생님 중요 한 신호 전달 기능을 성취 한다. 예를 들어, 미토 콘 드리 아에서 H₂O₂ 릴리스 T-세포 활성화, 스트레스 신호 (예를들면, Nrf2 신호 통로의 유도), 세포 증식 및 분화, 유도 제어에 연루 되어 있다 인슐린 신호 릴리스, 그리고 동작⁷먹이. 상당한 진행 선생님의 신호 전달 기능을 이해 했다. 그러나, 중요 한 질문은 여전히 남아 있다 관계는 미토 콘 드리 아 효소 역할을 가장 중요 한 소스 및 생산 제어 하는 방법은.

선생님 자료 생산의 사이트에 의해 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다: 1)는 전자 기증의 농도 사이트, 2) 전자 기부 사이트, 3)에 대 한 액세스 산소, 4) 고 농도의 산화 상태 그리고 산화 기판^3, 의 종류 ^{8 , 9}. 미토 콘 드리 아에서 다른 같은 NADH 및 막 잠재적인 힘의 농도 또한 선생님 생산^8,10영향 요인. 예를 들어 O₂^●-/ H₂O₂ 생산 순화 PDHC 또는 KGDHC의 속도 증가 증가 NADH 가용성^5,11. 이 시나리오에서 전자는 흐르는 거꾸로 NADH에서 PDHC 또는 KGDHC, O₂^●-/ H₂O₂ 생산¹²에 대 한 사이트의 E₃ 소 단위에 유행 센터. 마찬가지로, 나드⁺ 의 KGDHC¹²에서 선생님 방출 감소 반대의 효과 있다. 따라서, 제어 항목 또는 선생님의 사이트에서 전자의 출구는 얼마나 많은 O₂^●-/ H₂O₂ 를 형성 변경할 수 있습니다. 예를 들어, PDHC 또는 KGDHC CPI-613, 리 포 산, 결과 거의 90%에 감소 O₂^●-/ H₂O₂ 생산¹³아날로그와 E₂ 소 단위를 차단 합니다. 와 화학 S glutathionylation 촉매, diamide disulfiram, O₂^●-/H₂O₂ 에 의해 생산 PDHC 또는 KGDHC E에 glutathione의 활용을 통해 거의 폐지는 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. ₂ 소 단위¹⁴. PDHC 및 KGDHC의 E₂ 소 단위를 통해 전자의 흐름 차단에 대 한 트레이드 오프는 (예를 들어, 복잡 한 III) 전자 수송 사슬에 의해 선생님 형성 감소는 NADH 생산 감소 이다. 이 또한 전자 수송 사슬에 의해 ATP 출력을 줄일 수 있습니다. 전반적으로, 선생님 생산의 사이트에 전자 항목을 차단 하는 것은 O₂^●-/ H₂O₂ 생산을 제어 하는 매우 효과적인 수단 수 있습니다.

미토 콘 드리 아에는 최대 12 잠재적인 O₂^●-/ H₂O₂ 소스⁶포함할 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분은 포함 하는 플 라빈 효소 O₂^●- 및 H₂O₂의 혼합물을 생성 하는. 다른 기판 및 억제제 조합을의 사용의 호흡기 단지 및 미토 콘 드리 아 dehydrogenases 역할 고용량 O₂^●-/ H₂O₂ 에 사이트를 형성 하는 식별에 대 한 허용 다른 조직³. PDHC 및 KGDHC 높은 용량 O₂^●-/ H₂O₂ 근육과 간 미토 콘 드리 아^13,15발광 사이트 역할을 보여왔다. 그러나, 몇 가지 문제가 남아 O₂^●-/ H₂O₂ 다른 기판 및 억제제 조합에 있는 미토 콘 드리 아에 영향 개별 사이트의 잠재적인 형성의 시험에 관한 효소의 활동입니다. 이것은 원치 않는 쪽 반응 (예를 들어, O₂^●-/ H₂O₂ 의 효소 이외의 사이트의 형성)의 존재로 인해 오염 생 영양분 (예를 들어,지방산 산) 또는 세포 (예:, peroxisomes 또한 O₂●/H₂O₂를 형성), 그리고 선택도, 부족 억제제의 사용 및/또는 완전히 선생님 생산을 억제 하지 않는 화합물의 사용. 특정 억제제 또한 미토 콘 드리 아 생체 및 전자 흐름의 방향을 변경할 수 있습니다 그리고이 선생님 자료 생산의 다른 사이트에서 변경 하 고 결과 혼동 한다. 절대 릴리스에 대 한 O₂●/H₂O₂ 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 요금은 또한 O₂^●- 및 H₂O₂ 의 높은 농도 때문에 계량 하기 어려운 행렬 및 intermembrane 공간에서 효소를 제거합니다. 따라서, O₂^●-/ H₂O₂ 릴리스 측정을 방해할 수 있는 모든 경쟁 반응의 제거 때 유용할 수 있습니다 식별 하는 고용량 O₂^●-/H₂O₂ 사이트를 형성.

여기, 우리는 정화 플 라빈 종속 dehydrogenases에 의해 O₂^●-/ H₂O₂ 생산과 NADH 형성의 동시 시험을 허용 하는 간단한 방법 제시. 정제 효소를 사용 하 여 원치 않는 선생님 측 반응 형성 및 효소 저하 선생님 제거할 수 있습니다 네이티브 O₂^●-/ H₂O₂ 생산 속도의 개별 flavoenzymes에 대 한 보다 정확한 측정을 위한 수 있도록. 이 메서드는 O₂^●-/ H₂O₂ O₂^●-/H₂O 화면 잠재적인 사이트별 억제제 또는 다른 정화 dehydrogenases의 능력을 형성을 직접 비교를 사용할 수 있습니다. ₂ 출시입니다. 마지막으로, O₂●/H₂O₂ 와 NADH 생산을 동시에 측정의 효소 활동, 선생님 자료 용량 관계의 실시간 평가 대 한 수 있습니다.

프로토콜

1. 화학 물질 고 정화 효소

1. 다음과 같은 재료를 조달: PDHC 및 KGDHC 돼지 심장 근원 (또는 다른 정화 미토 콘 드 리아 flavoenzyme); H₂O₂ (30% 솔루션), pyruvate, α ketoglutarate 나드⁺, NADH, CoASH, 티 아민 파이 인산 (TPP), 마 니 톨, HEPES, 자당, EGTA, 3-메 틸-2-옥 valeric 산 (KMV), superoxide dismutase (잔디), 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 시 약 (AUR), 그리고 CPI-613.

2. 분석 결과 및 시 약 준비 계획

1. 96 잘 접시에 표 1 에 따라 분석 결과를 설정 합니다.
   참고: 각 반응에 대 한 전체 볼륨은 200 µ L. 주식 농도의 시 약 20 µ L 추가 되도록 조정 하는 각 음에. 그러면 공동 인자와 잘 분석 결과 시작 하기 전에 각 반응에 기판의 급속 한 추가.
2. 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 1mm EGTA, 및 20 mM HEPES (HCl로 pH 7.4)를 포함 하는 반응 버퍼를 준비 합니다.
   참고:이 다른 정제 효소의 물리적 특성에 따라 변경할 수 있습니다.
3. 효소 활동 분석 실험^14,,1617 를 사용 하 여 오염 또는 immunoblot에 의해 순화 KGDHC 또는 PDHC를 검사 또는 Coomassie 얼룩⁵.
4. 표 1에서 작업 솔루션 농도 의하여 반응 버퍼에 모든 시 약을 준비 합니다.
5. 모든 시 약 1 mL-20 ° c.에 aliquots로 저장 자동 산화 및 반복된 동결-해 동 자발적인 저하를 방지 하기 위해 100 µ L aliquots에서 pyruvate 및 α ketoglutarate-80 ° C에서 저장 합니다.
6. DMSO의 1 mL에 마스터 재고 AUR 시 약을 준비 하 고 반응 버퍼에서 100 µ M을 희석. 스토어 빛 으로부터 보호입니다.
   참고: 여기, 100 µ M 작업 솔루션은 2 ~ 3 주마다 신선한 고 빛 으로부터 보호.

3. 분석 결과 서식 파일 설정

1. 듀얼 측정 기능으로 단색 microplate 리더에 분석 결과 절차를 설정 합니다.
2. "프로토콜"을 선택 하 여 읽기 프로시저를 정의 합니다. 그런 다음 "프로시저"를 클릭 합니다.
3. 25 ° c (그림 1A) "온도"를 설정 합니다.
4. (그림 1A) 읽기 조건을 설정할 "운동 시작"을 클릭 합니다. 시간 및 읽기 간격/실험의 수를 설정 합니다.
5. 클릭 "읽기" (그림 1B).
   참고: 샘플 최고의 위치에서 읽는 50의 이득. 시간: 5 분, 간격 30-s 읽기. 채널 1: Resorufin 형광-여기/방출 = 565 nm:600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 채널 2: NADH autofluorescence-여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.
6. "읽기", 웰 스 모니터 (예를 들어, a 1-a 4와 B1 B4)을 선택 합니다.
7. "키네틱 끝"을 선택 합니다.

4. 표준 곡선

1. 시 약을 해 동 하 고 필요할 때까지 얼음에 저장 합니다.
2. NADH 표준 곡선 (그림 2A)
   1. 반응 버퍼에 0.5-10 m m의 농도 범위에서 NADH에 대 한 작업 솔루션을 준비 합니다.
   2. 180 µ L 반응 버퍼를 포함 하는 웰 스 솔루션 집중 작업 각 NADH에서 20 µ L aliquots를 추가 합니다. 각 NADH의 최종 농도 잘는 0.05-1 m m.
   3. "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.
      참고:이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.
3. AUR 표준 곡선 (그림 2B)
   1. 반응 버퍼; 과산화 수소의 작업 주식 준비 사진 농도 범위 200-4000 nM에서.
   2. 각 잘에 반응 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.
   3. HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 U/mL, 우물에 최종 농도 = 3 U/mL =) 20, 잔디의 µ L (재고 농도 일 250 U/mL, 우물에 최종 농도 = 25 U/mL =), 그리고 AUR의 20 µ L (재고 농도 작업 = 100 µ M 잘에서 최종 농도 = 10 µ M) 각 잘 포함 반응 버퍼를.
   4. 잘 포함 하는 버퍼 및 분석 실험 시 약 각을 재고 솔루션 작업 각 H₂O₂ 의 20 µ L를 추가 합니다. 최종 반응 볼륨 200 µ L 이며 각 우물에서 H₂O₂ 의 최종 농도 20-400 nM 이다.
   5. 25 ° c.에서 플레이트 리더에서 1 분에 대 한 번호판을 품 어
   6. "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 = 565 nm/600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.

5. O₂ ●/H₂ O₂ 릴리스 및 KGDHC 및 PDHC에 의해 NADH 생산 측정

1. 다른 시 약의 추가의 순서에 대 한 표 1 를 참조 하 여 각 볼륨과 각 작업 솔루션의 농도 추가 잘.
2. 각 잘에 반응 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 분석 실험 KMV 또는 CPI-613를 사용 하 여, 각 음을 버퍼의 20 µ L를 추가 합니다.
3. PDHC 또는 KGDHC의 20 µ L를 추가 (1 U/mL, 잘 당 최종 농도의 작업 사진 = 0.1 U/mL)을 각 영역.
4. 2 분 동안 25 ° C에서 PDHC 및 KGDHC를 품 어.
5. KMV의 20 µ L을 추가 (작업 사진 = 100 mM, 최종 농도 = 10 m m) 또는 CPI-613의 20 µ L (재고 농도 작업 = 1.5 m m, 최종 농도 = 150 µ M) (표 2).
   참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.
6. 25 ° c.에 1 분 동안 품 어
   참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.
7. HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 단위/mL, 우물에 최종 농도 = = 3 단위/mL) 및 잔디의 20 µ L (재고 농도 일 250 단위/mL, 우물에 최종 농도 = 25 단위/mL =) 각 잘 하.
8. 코엔자임 A의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 = 1mm, 최종 농도 = 0.1 m m), 20 TPP의 µ L (재고 농도 작업 = 3 mM, 최종 농도 = 0.3 m m), 고 나드⁺ 의 20 µ L (재고 농도 작업 = 10 m m, 최종 농도 = 1 m m) 각 w 내 말이 맞지.
9. 보호 은박지 덮 음에서 AUR 시 약을 제거 하 고 추가 20 µ L 각 잘.
10. Pyruvate의 20 µ L 추가 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m) PDHC 및 α ketoglutarate 웰 스 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m)를 KGDHC를 포함 하는 우물.
11. 클릭 "읽기" 운동 측정을 시작 합니다.

6. 데이터 분석

1. 키보드에서 'CTRL' 버튼 누른 1 (그림 3A) 채널에 해당 하는 모든 운동 측정을 포함 한 그래프를 생성 하는 우물을 클릭 합니다.
2. 상대 형광 단위 (RFU) (그림 3B) 다른 시간 지점에서 측정에 대 한 원시 값에 대해 오른쪽 상단에 있는 보기 아이콘에 "데이터"를 클릭 합니다.
3. 분석 (표 3)에 대 한 값을 내보냅니다.
4. "그래프" 드롭 다운 메뉴 오른쪽 상단에 (그림 3B) 형광 채널 2와 관련 된 RFU 값에 액세스 하려면 클릭 합니다.
5. 채널 2 단계 6.1 6.3 반복 합니다.

결과

그림 3A 순화 KGDHC에 의해 H₂O₂ 와 NADH 생산의 동시 측정 하는 동안 수집 된 RFU에 대 한 대표적인 추적을 제공 합니다. 각 시간 간격에 대 한 원시 RFU 데이터는 그림 3B에서 묘사 된다. 원시 RFU 데이터 분석에 대 한 다음 내보내집니다. 그림 2에 제시 하는 표준 곡선에서 추정 하 여 NADH와 H₂O₂ 5 분 동안 각 측정 간격에서 형성의 절대 금액을 확인할 수 있습니다. 이 계산의 예는 표 3에서 제공 됩니다. 에 의해 형성 된 NADH와 H₂O₂ 의 양을 일단 KGDHC 또는 다른 간격 PDHC 결정, 값이 복사 되 고 추가 분석을 위...

토론

이 프로토콜은 이후 유리, 1) 그것은 어떤 경쟁 반응을 방해할 수 있는 그렇지 않으면 H₂O₂ 감지 (예, 항 산화 시스템 또는 기타 소스 선생님의), 2를 제거)의 기본 속도의 직접 평가 제공 선생님 분리를 포함 하는 플 라빈 미토 콘 드리 아 효소, 3) 원시의 비교를 허용 한다 선생님 릴리스 2의 속도 또는 더 정화 플 라빈 기반 dehydrogenases, 4) 선생님과 효소 활동, 및 5의 속도의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다) 선생님 자료에 대 한 선택적 경쟁력 억제제의 수 있습니다. 우리의 그룹 및 다른 사람 사용이 메서드 이전 간행물 allosteric 여 선생님의 규칙을 검사와 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육^{14,16, 산화 환 원 신호 메커니즘 실시 전에 실험 17}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피루브산 탈수소효소 복합체	SIGMA	P7032-10UN	정제 플라보엔자임
알파-케토글루타레이트 탈수소효소 복합체	SIGMA	K1502-20UN	정제 플라보효소
30% 과산화수소 용액	SIGMA	HX0640-5	시약, 표준 곡선
NAD+	SIGMA	N0632-1G	시약, 활성/ROS 방출 분석
NADH	SIGMA	N4505-100MG	시약, 표준 곡선
피루브산	SIGMA	P2256-5G	시약, 활성/ROS 방출 분석,
알파-케토글루타레이트	SIGMA	75892-25G	시약, 활성/ROS 방출 분석,
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	시약, 활성/ROS 방출 분석
티아민 피로인산	SIGMA	C8754-1G	시약, 활성/ROS 방출 분석
만니톨	SIGMA	M4125-100G	완충 성분
Hepes	SIGMA	H3375-25G	완충 성분
자당	SIGMA	S7903-250G	완충 성분
EGTA	SIGMA	E3889-10G	완충 성분
KMV	SIGMA	198978-5G	시약, ROS 방출 억제제
CPI-613	산타 크루즈	sc-482709	시약, ROS 방출 억제제
SOD	SIGMA	S9697-15KU	시약, ROS 방출 감지
양고추냉이 과산화효소	SIGMA	P8375-1KU	시약, ROS 방출 감지
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	시약, ROS 방출 검출
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