우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.
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방법 논문
Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하
이 논문에서
요약
초록
급성 골수성 백혈병 (AML)은 다른 유형의 그리고 치료 하지 않으면, 치명적인 질병. 그것은 성인 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 질병 차별화, 폭발 세포 백혈병의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 이 백혈병 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장,이 동적 셀 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 하는 구획 부과 시 백혈병 진행 및 치료 하는 동안. LSC 인구를 추가로 정의 하려면 CD90 추가 CD45RA CD34 + CD38-셀 구획 내에서 정상적인 HSCs multipotent 창시자의 차별 수 있습니다. 여기, 우리 multiparametric cytometry에 의해 인간의 AML의 기본 폭발 셀에 여러 개의 상 상속 LSC 마커 (CD34, CD38, CD45RA, CD90)의 동시 표현 검색 프로토콜 개요. 또한, 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다. 검색의이 방법 및 상 상속 LSC의 정량화 임상 후속의 화학 요법 응답 사용할 수 있습니다 (즉., 최소 잔여 질병), 잔여 LSC AML 재발을 일으킬 수 있습니다.
서론
급성 골수성 백혈병 (AML) 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 클론 질병 차별화, 폭발 셀의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 최근, 폭발 세포 인구의 클론이 차세대 시퀀싱 (NGS) 전략을 사용 하 여 종양 세포1의 내부 클론 진화의 존재를 보여주는 본질적으로 설립 되었습니다.
이 leukemic 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장합니다. 그것은이 동적 셀 구획 백혈병 진행 및 치료 하는 동안에 부과 하는 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 가설입니다. 따라서 LSC 현재 화학요법 식이요법을 저항 하 고 깊은 임상 의미2질병 재발을 중재 하는데 있다. 다양 한 마커 CD1233, CLL-14, CD975 또는6팀-3 같은 LSC 하 설명 했습니다. CD34 + CD38-폭발 세포의 구획 LSC7 농축 간주 됩니다 하지만 또한 정상적인 HSC를 포함 합니다. CD90 ....
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프로토콜
우리는 과학적 목적을 위한 동물의 사용에 대 한 유럽 표준을 따른다. 이 연구는 지역 윤리 위원회 (#3097-2015120414583482v3)에 의해 승인 되었다.
1. 샘플 준비
- 골 수의 mL 당 1.8 mg의 농도에서 항 응 혈 약 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)을 포함 하는 튜브에 드 노 보 AML에서에서 골 (2 mL)를 수집 합니다.
- Ficoll 분리, 뒤 붉은 세포를 granulocytes, 단 세포를 분리 하는 밀도 그라데이션 분리를 수행 합니다. 골 3 양의 인산 염 버퍼 식 염 수에 희석 (PBS: NaCl 137 m m, KCl 2.7 m m, Na2HPO4 10 m m, KH2포4 1.8 m m). 조심 스럽게 희석된 골의 1 볼륨 1 양의 Ficoll 오버레이. 회전 브레이크 없이 300 x g에서 30 분. 새로운 무 균 튜브에 흰 버 피 코트 층의 mononucleated 세포를 전송 합니다.
- 10 mL PBS의 셀을 두 번 씻어) 오염 혈 청 성분을 제거 하기 위해 5 분 동안 300 x g에서 원심과.
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결과
여기 우리 조상 인구 정상 및 악성 인간의 골 수 샘플을 결정 하는 방법을 제시. 우리는 성공적인 PDX에서 골 수 및 비장 수집 하 고 위에서 설명한 대로 multiparametric cytometry 수행. 우리는 폭발 세포 진단 환자 샘플 및 해당 PDX 및 특히, CD34 + CD38-조상 구획 사이 특히 putative LSC에 농축의 여러 모집단 비교. 우리는 발견 CD34 + CD38-폭발 분수에서 PDX 진단 환자 샘플 0.53%, 그림 2C, D(3.48%)에 비해 높았다. 흥미롭게도, 우리는 putative LSC의 더 높은 백분율을 발견 (CD34 + CD38 표시-CD90-CD45RA + 형) 기본 환자 샘플 (0.48%, 그림 2E, F대 2.76%)에 비해 PDX에서 악성의 가능한 농축 제안 이 마우스 모델에서 혈액 조직에 조상 세포. 일.......
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토론
막 또는 세포질 마커 cytometry에 의해 정확 하 고 재현성 평가 악기 설정을 매일 광학 정렬, 적절 한 유체 시스템, 광학 감도 및 표준화의 기능에 대 한 확인 필요 교정 구슬을 사용 하 여.
AML CD90 및 CD45RA를 사용 하 여 다중 변수 흐름 cytometry 분석에서 폭발 세포 인구의 탐지는 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 분석에서 중요 한 단계는 CD34 + CD38-인구의 정확한 게이팅을 수행 하려면 CD38 식 폭발 세포에의 한 정확한 평가입니다. CD38 강도 특히 hematogones 플라즈마 세포 (CD38 +)에 정상 골 수 세포를 사용 하 여 정의 됩니다. 다른 마커의 강도 isotype 컨트롤을 사용 하 여 결정 됩니다.
CD45RA 및 CD90의 추가 putative LSC에서 HSC를 구별 하는 데 사용 됩니다. 후자와 하지 HSC 아마 질병 재발의 원인, 따라서이 프로.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 일부 프랑스 협회 Laurette Fugain, LigueContre 르 암 (북한 센터), Fondation 드 프랑스 (백혈병 위원회), SIRIC Oncolille, 및 프랑스 국립 암 연구소에서 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC 용해 완충액(10x) | 오자임 | BLE420301 | RBC 용해 용액 A: 멸균 H<2< 및 RBC 용해 용액 B 100mL에 NHsub>4Cl 8.29g + Na2>EDTA 0.037g: 멸균 H<>>sub2O NOD/SCID/IL2R&gamma 100mL에 KHCO 1g |
| ; cnull (NSG) 생쥐 | JACKSON LABORATORY | 재고 번호: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS 분리 완충액 | MACS 완충액 Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (클론 FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (클론 D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (클론 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (클론 J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (클론 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (클론 HI100) | 벡크 톤 디킨슨 | 560674 | |
| 안티 CD38-퍼시픽 블루 (클론 LSI98-4-3, Iotest) | 벡크 만 쿨터 | B92396 | |
| 안티 CD45-KO (클론 J.33, Iotest) | 벡크 만 쿨터 | B36294 | |
| 안티 CD3-PE | 벡크 만 쿨터 | IM1451 | |
| 안티 CD20-PE | 벡크 만 쿨터 | A07747 | |
| 안티 CD123-PC7 | 벡크 만 Coulter | B13647 | |
| 플로우 세트 | Beckman Coulter | A63492 | |
| 플로우 체크 | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep 인간 PE 선택 키트 | 줄기세포 기술 | 18000 | |
| EasySep 자석 | 줄기 세포 기술 | 18551 |
참고문헌
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One.
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재인쇄 및 허가
