대뇌 피 질의 로컬 필드 전위, 심전도, 치십시오, 그리고 자유롭게 움직이는 쥐에서 리듬 호흡의 동시 녹음

Summary

이 연구는 두뇌, 심전도, 근, 로컬 필드 전위의 동시 녹음 하 고 자유롭게 움직이는 쥐의 신호를 호흡 하는 방법을 소개 합니다. 이 기법을 실험 비용 절감 및 데이터 분석을 단순화, 뇌 및 말 초 기관 간의 상호 작용의 이해에 기여할 것입니다.

Abstract

주변 조직과 뇌의 생리 적인 역학을 모니터링 하는 것이 어떻게 뇌 컨트롤 몸 기능 및 내부 장기 리듬 동물 정서적 과제와 변화에 노출 되 면에 대 한 질문의 번호를 주소 지정을 위해 필요한 그들의 생활 환경입니다. 일반적으로 실험, 신호는 뇌와 심장 등 다른 장기에서 데이터 파일을 처리 하기 위한 여러 녹음 장치 및 다른 절차를 필요로 하는 독립적인 녹음 시스템에 의해 기록 됩니다. 이 연구는 동시에 로컬 필드 전위의 수만 포함 하 여 여러 뇌 영역, 심전도 심장 리듬을 나타내는, 나타내는 깨어 근 전기 biosignals를 감시할 수 있는 새로운 방법 설명 / 수 면 관련 근육 수축, 그리고 자유롭게 움직이는 쥐에서 신호를 호흡. 이 방법의 녹음 구성은 대뇌 피 질의 로컬 필드 잠재적인 기록 전극의 수만 수용 된다, 그리고이 전극에서 얻은 신호는 단일 통합에 대 한 기존의 마이크로 드라이브 어레이 기반 전기 보드 동물의 머리에 장착. 여기,이 녹음 시스템은 향상 주변 기관에서 신호는 전기 인터페이스 보드에 전송 됩니다. 단일 수술에서 전극 별도로 적절 한 신체 부위 및 대상 뇌 영역으로 이식 처음입니다. 모든 신호는 단일 전기 보드에 통합 될 수 있도록 모든이 전극의 열린 끝 다음 동물의 머리 위에 전기 보드의 개별 채널을 납땜 된다. 녹음 장치에 연결 하는이 보드 실험 비용 감소와 같은 데이터 파일에 모든 데이터를 처리할 수 있기 때문에 데이터 처리를 간소화 하는 단일 디바이스에 신호의 모든 컬렉션에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 중앙과 주변 기관 사이 협회의 신경 생리학 상호의 이해를 도움이 됩니다.

Introduction

중앙 신경 다양 한 환경 변화에 응답으로 몸 상태를 제어 하 고이 컨트롤은 일반적으로 심장 박동, 호흡 속도 및 근육 수축에 변경으로 표시 됩니다. 그러나, 몇 가지 연구는 어떻게 이러한 주변 생리 적인 요인 대뇌 피 질의 활동와 관련 된 테스트. 이 문제를 해결 하려면 전기 biosignals 중앙 및 주변 조직에서 모니터링 하는 대규모 기록 방법을 필요 하다. 대뇌 피 질에서 로컬 필드 가능성 (LFP) 신호 extracellularly 대뇌 피 질의 조직^1,2,3에 삽입 된 전극에 의해 기록 됩니다. 동시에 작은 포유류, 쥐, 쥐 등의 피 질 영역에서 여러 LFP 신호를 기록 하기 위해 다양 한 연구 마이크로 드라이브 라고 하는 주문 품 전극 어셈블리의 다양 한 종류를 개발 했습니다. 기존의 마이크로 드라이브는 금속 나사 전극 (이것은 일반적으로 tetrodes), 나사 및 전극, 수용 코어 바디와 금속 구멍을 수용 하는 전기 인터페이스 보드 (EIB)의 중간 부분에 연결 된 구성 (그림 1, 그림 2및 그림 3) 전극의 열린 끝을 연결 합니다. 이 전극 어셈블리 많은 전극 주, 일의 과정을 통해 두뇌에 삽입의 깊이 제어 하는 연산자를 사용 하 고 동물 다양 한 도전을 신경 활동의 장기 만성 녹음의 실시 수 있습니다. 행동 작업입니다. 주변 장기에 하트 비트 신호 또는 심장 지역^4,,56주위에 이식 되는 전극의 쌍으로 심전도 (ECGs)으로 기록 하 고 골격 근육 신호 기록 된다 근 (EMGs) 전극으로 서는 근육 조직^7,,89에 삽입 됩니다. 후 각 전구의 전기 신호 및 호흡 (BR) 리듬의 관계는 단일 단위 기록^10,11공부 했다. 기존의 시스템에서 다른 조직에서 이러한 신호에 의해 붙잡힌 독립적인 녹음 장치, 즉 추가 실험 시스템에 대 한 이러한 여러 디바이스를 동기화 하는 정확 하 게 하는 데 필요한는 동시 뇌-몸 신호 기록입니다. 이 시스템은이 문제를 극복 하기 위해 개발 되었다. 이 시스템에서 ECGs, EMGs, 및 호흡 리듬을 반영 하는 후 각 전구에서 전기 신호를 포함 하 여 주변 장기에서 기록 된 모든 전기적 신호는 단일 마이크로 드라이브 배열^{1,2에 통합 ,3}, 여기는 통합 마이크로 드라이브 배열 되 나. 이 시스템 필요로 한 멀티 채널 녹음 장치, 그리고 모든 기존의 마이크로 드라이브 배열에 적용 됩니다. 이 기법의 장점은 어떤 특별 한 장치 또는 여러 장치, 기록 시간과 일치 하도록 트리거 신호 필요 하지 않습니다 및 모든 신호에의 유사한 데이터 형식으로 기록 됩니다 때문에 더 편리한 데이터 처리에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 중앙과 주변 기관 사이 협회의 신경 생리학 상호의 이해를 도움이 됩니다. 이 종이 기술과 관련 된 절차를 설명 하 고 쥐에서 얻은 대표적인 데이터 집합을 선물 한다.

Protocol

동물 주제와 관련 된 절차의 모든 관심과 동물의 사용에 대 한 NIH 지침에 따라 수행 했다.

1. 통합 마이크로 드라이브 배열 준비

1. ^1,,23다른 설명으로 대뇌 피 질의 LFP 녹음에 대 한 마이크로 드라이브 어레이 만듭니다. 두고 적어도 6 금속 구멍 1.2에 설명 된 대로 bioflex 와이어에 연결 된 ECG/EMG/BR 채널로 사용 전극 인터페이스 보드 (EIB)에 엽니다.
2. Bioflex 와이어 길이 5.0 cm. 껍질 소계 (PTFE)에서 6 조각으로 잘라 길이 ~5.0 m m.와 함께 모든 철사 조각의 양쪽의 코팅에 오픈 금속 구멍 (ECG/EMG/BR 채널) 중 하나를 와이어 조각의 각각의 한쪽 끝을 연결 합니다 EIB 골드 핀입니다.
3. 두 5.0 cm 조각으로에 나 멜 와이어 컷. EIB (그림 3참조 또한 이전 논문^12,13)에 접지/참조 (g/r) 채널에이 철사의 각각의 한쪽 끝을 땜 납.
4. ECG 전극의 준비에 대 한 bioflex 와이어 두 16 cm 조각으로 잘라. ~5.0 mm 한쪽 끝 (짧은 말)와 다른 끝 (긴 끝)에 ~ 15 mm의 길이이 철사 조각의 끝의 PTFE 코팅을 벗기다.
5. 철사의 긴 끝을 굽 힘 반지의 모양 납땜 하 여 고정을 2.0 m m의 직경을 가진 와이어 고리를 형성 합니다.
6. EMG 전극의 준비에 대 한 bioflex 와이어 길이 8 cm. 껍질 길이 ~5.0 m m의이 철사 조각의 양쪽에서 PTFE 코팅에서 2 조각으로 잘라.
7. . 솔더 한쪽 끝이 조각의 와이어 머리에 스테인리스 나사 (줄기 직경의 각각의 BR 전극의 준비 컷 길이 6.0 cm. 껍질 길이 ~5.0의이 철사 조각의 양쪽 끝의에 나 멜 코팅에서 2 조각으로 bioflex 와이어에 대 한 미터: 1.0 m m, 길이 줄기: 4.0 m m).
8. 접지/참조 (gr) 전극의 준비에 대 한 컷 길이 6.0 cm. 껍질 길이 ~5.0 m m.이 와이어의 양쪽 끝의에 나 멜 코팅에서 2 조각으로에 나 멜 와이어 솔더 조각의이 와이어 머리 스테인리스 st의 각의 한쪽 장 어 스크류 (줄기 직경: 1.4 m m, 줄기 길이: 3.0 m m).
9. 가스는 모든 전극 및 스테인리스 나사 소독 하 고 깨끗 한 공간에서 계속.

2. 심전도/근 전도 전극의 주입

참고: 멸 균된 장갑과 압력가 악기를 사용 하 여 무 균 기법으로 모든 수술 단계를 수행 합니다. 절 개의 창조를 포함 하는 모든 단계를 하기 전에, 70% 에탄올으로 피부를 소독 하 고 외과 커튼으로 절 개를 커버.

1. 마 취 수정 평면 열 패드에 그것의 뒤에 (1.0-3.0 %isoflurane 가스) 쥐. 진통제로 buprenorphine를 제공 합니다. 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 수의 연 고를 배치 합니다. Betadine를 사용 하 여 피부 표면을 청소.
2. 중간 가슴 영역에서 ~2.0 cm의 절 개를 확인 합니다. 가슴 근육을 분리 하 여 있는 근육을 노출 합니다. 있는 근육에 ECG 전극의 고리 봉합
3. 열 패드에 동물의 위를 수정 합니다. 등 쪽 목 부분에 ~1.0 cm의 절 개를 확인 합니다.
4. 가슴 절 개를 통해 피하 ECG 전극 삽입 합니다. 등 쪽 목 지역에 끝을 밀어 하 고 목 절 개에서 그들을 밖으로 당겨. 가슴 절 개 봉합
5. 각 목 절 개를 통해 ~2.0 cm의 길이를 피하 EMG 전극의 한쪽 끝을 삽입 합니다. 봉합 하 여 목 근육 EMG 전극을 해결.

3. 통합 마이크로 드라이브 배열 및 BR 전극의 주입

1. Stereotaxic 장치에 쥐를 수정 합니다. 목 부분에 눈 사이 중간에 따라 머리에 ~3.0 cm의 절 개를 확인 합니다. 두개골을 노출 합니다.
2. 에 게 0.7-1.0 嗅 앞쪽 11.0 m m와 1 m m 위에 m m의 직경을 가진 두 개의 원형 craniotomies 양자 bregma 고속 드릴. 나사 줄기의 끝은 뇌 표면에 연결 될 때까지 두 BR 전극을 두개골에서 이식.
3. 양자 bregma에 0.7-1.0 담당 앞쪽 2.7 m m, 2.7 m m 위에 m m의 직경을 가진 두 개의 원형 craniotomies을 확인 합니다. 나사 줄기의 끝은 뇌 표면에 연결 될 때까지 두 g/r 전극을 두개골에서 이식.
4. 큰 craniotomy 주변 지역에서 6 ~ 8 직경 1.0 m m의 구멍을 확인 합니다. 앵커 나사를 이식 (줄기 직경: 1.4 m m, 줄기 길이: 3.0 m m) 두개골에.
5. ~2.0 m m m, 3.8 m 후부와 해 마의 위 2.5 m m의 직경을 가진 큰 원형 craniotomy 양자 bregma에 확인 합니다. 같은 드라이브 배열의 정 팁 큰 craniotomy 위에 있는 통합 마이크로 드라이브 배열 배치
6. ~ 100 µ L의 두 가지 솔루션, 즉정 팁과 뇌 표면 사이 간격 공간 채우십시오., (질량) 0.5% 나트륨 alginate와 염화 칼슘 (질량) 10%.
   참고:이 프로세스 형성 투명 젤 ~ 5 분, 두 가지 솔루션은 두개골에 혼합 후.
7. 커버 정, BR 전극, g/r 전극, 그리고 두께 0.5 cm. 치과 시멘트 앵커 나사 조심 하지 이 단계에서 시멘트와 BR과 g/r 전극의 열린 끝을 커버.
8. 이전에 EIB에 연결 된 개별 와이어 팁 g/r, BR, EMG, ECG 전극의 열린 끝 솔더 (1.2와 1.3 단계 참조).
9. 통합 마이크로 드라이브 배열 및 모든 전극 와이어, 치과 시멘트의 하단 부분을 커버. 모든 전극 와이어는 완전히 덮여 쥐 주입 후에 그들을 밖으로 긁어 수 있도록 확인 하십시오.
10. Sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 후 동물의 투명 한 유리 야 홈 cag를 반환 하 고 물과 음식에 무료 자체 유지 합니다. 수술 후, 항생제 (gentamicin)로 동물을 취급 합니다.
11. 수술 후, 매일 관찰 동물을 모니터링 합니다. 그들은 제대로, 산책 하 고는 그들은 할 하지 찍 찍 거리는 실험 마이크로 드라이브 배열에 닿을 때 확인 하십시오.

4. Vivo에서 녹음

참고: 모든 신호는 증폭, 2 kHz로 샘플링 및 대역 통과 필터링된 (0.1-500 Hz) 단위 활동 (30 kHz로 샘플링 및 대역 통과 필터링된 (500-6 kHz))을 제외 하 고.

1. 녹음 장치 headstage에 통합 마이크로 드라이브 배열의 EIB를 연결 합니다.
2. 수술 후 몇 주 동안 나사 여는 tetrodes 사전. 일단은 tetrodes 대상 뇌 영역에 인접 한, 안정적인 레코딩 위한 몇 일의 기간 동안 지역으로는 tetrodes를 정착.
3. 동물 녹음 실에서 자유롭게 이동 하는 동안 전기 신호를 모니터링 합니다.

Results

이 방법은 동시에 뇌, 심장 박동, 호흡 리듬, 그리고 골격 근육 수축 (그림 1)의 신경 활동을 대표 하는 여러 기관에서 생체 전기 신호를 캡처할 수 있습니다. 그림 4 는 직사각형 상자 (25 × 40 cm²)에서 자유롭게 구하고 자유롭게 움직이는 쥐에서 대표적인 기록 데이터를 제공 합니다. 예제 데이터 집합 전형적인 행동 전환 이동 하 고 상태를 휴식을 포함 합니다. 파워 스펙트럼 hippocampal LFP 추적에서 웨이 블 릿 분석에 의해 계산 되었다. 嗅의 표면 영역에서 기록 된 BR 신호는 대략 주파수, 탐구 스니핑 동작 중에 발생 하는 호흡에 상대적인 변화를 추정 하 사용 되었다.

Discussion

어떻게 두뇌 변조 주변 활동 수준, 그리고 이해에 대 한 반대, 대규모 동시에 여러 신체 영역에서 전기 biosignals 캡처 방법 녹음은 필요 합니다. 수술, 및 대뇌 로컬 필드 전위, 심 박수, 근육 건축 및 사용 되는 레코딩 시스템에 향상 된 호흡 속도의 진도 모니터링을 위한 녹화 시스템을 설명 하는이 연구 뇌 조직에서 세포 외 기록입니다. 이 시스템 통합 마이크로 드라이브 배열에 단일 EIB에 두뇌와 주변 기관에서 전기 신호를 수집합니다. 통합 마이크로 드라이브 배열 준비로 시간이 좀 걸립니다, 수술 전에 적어도 몇 시간 시작 한다. 여기에, 하지만 드라이브 배열 포함 뇌 로컬 필드 전위를 기록 하기 위한 tetrodes 금속 전극, 백 금, 텅스텐 전극, 등의 다른 종류는 EIB에 연결할 수 있습니다이 전극의 끝은 제대로 납땜 하는 경우. 수술 절차는 프로토콜에 따라 때 경험된 경험 2-3 h 내 모든 절차를 완료 하려면 수 있다 수 있습니다.

이 프로토콜 내에서 중요...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FEP 훅업 와이어 꼰 스테인리스 스틸	Cooner Wire Company, Chatsworth, CA	AS 633	Bioflex 와이어
EIB-36-PTB	Neuralynx, Inc., Bozeman, MT	EIB-36-PTB	EIB
Cereplex  M	블랙록  Microsystems, Salt Lake City, UT		디지털 헤드스테이지
Cereplex Direct	블랙록  Microsystems, Salt Lake City, UT		데이터 수집 시스템
UEW 폴리우레탄 자석 와이어	Oyaide.com, 도쿄, 일본	UEW 0.14mm 20m	에나멜 와이어
SD-102	Narishige, 도쿄, 일본	SD-102	고속 드릴
Minimo ONE SERIES ver.2	Minitor Co.,Ltd, 도쿄, 일본	C2012	고속 드릴 전원 공급 장치
Provinice 250 mL	Shofu Inc., 교토, 일본	213620136	치과 시멘트
소형 동물 마취제	바이오기계류, 일본 지바	TK-7	마취제
부프레노르핀 염산염	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B7536-1ML	진통제
이소플루란	DS Pharma Animal Health, 오사카, 일본	이소플루 250mL
바셀린, 화이트	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 일본 오사카	224-00165	수의사 연고
나트륨 알긴산	Nacalai tesque, Kyoto, Japan	31131-85
Calcium Chloride Dihydrate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	031-00435
스테인레스 스틸 나사 M1.0× 4.0	MonotaRO, 효고, 일본	42617504	BR 전극용 스테인리스 스틸
스크류 스테인리스 스틸 스크류 M1.4× 3.0	MonotaRO, 효고, 일본	42617687	g/r 전극 및 앵커용 스테인리스 스틸 나사