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방법 논문

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

21.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56997

⸱

2018년 3월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

초록

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 높은 편광된 다기능 상피가 이다. Hexagonally 포장 및 단단한 접속점에 의해 연결 된 색소 세포의 단일 시트입니다. RPE의 주요 기능은 시각적 사이클에 빛, 창 고 포토 리셉터 외부 세그먼트의 식 균 작용, 이온의 공간 버퍼링, 영양분, 이온 물 뿐만 아니라 적극적인 참여의 전송의 흡수를 포함 합니다. 이러한 중요 하 고 다양 한 기능, RPE 세포의 생물학 연구에 매우 중요입니다. RPE 세포 선의 수 설립 되었습니다; 그러나, passaged와 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 일부를 잃고 자연 RPE 세포의 형태학 적 및 생리 적 특성의 알려져 있습니다. 따라서 1 차 셀은 RPE 세포 생물학 및 기능의 다양 한 측면을 공부 하는 데 더 적합. 그러나 마우스 기본 RPE 세포 배양 연구원에 게 유용 이후 마우스 모델 생물학 연구에서 널리 이용 된다, 마우스에서 세포 수집 RPE는 또한 그들의 작은 크기 때문에 매우 도전. 여기, 선물이 enucleation 및 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리를 포함 하는 기본 마우스 RPE 세포 배양을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 메서드는 효율적인 셀 복구를 수 있습니다. 두 쥐에서 얻은 RPE 세포 문화와 디스플레이 일부 선의의 RPE의 원래 속성의 6 각형 모양 및 2 후 착 색 등 세포의 1 주 후 문화 접시에 사전 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 confluency를 도달할 수 있다 문화의 주.

서론

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 편광 된 상피 세포의 층 이다. RPE 세포의 기능과 RPE 단층의 무결성 비전에 대 한 중요 하다는 RPE 외부 혈액 망막 방 벽, 물과 망막 사이의 이온의 수송을 유지 등 여러 프로세스에서 중요 한 역할을 담당 하기 때문에 고 맥락 막, 빛 흡수, 산화 스트레스, retinoid 대사의 제어 및 대뇌1,2의 외부 세그먼트의 식 균 작용 으로부터 보호 유리 체를 혈액에서 통과에서 체계적으로 관리 하는 마약 방지의 장벽 기능 뿐 아니라, 눈 뒤쪽 RPE의 위치는 RPE 기능에서 vivo에서의 복잡성을 연구 하기 어려울. 따라서, 유연 하 고, 제어 환경3,4RPE 세포 연구 RPE 세포 배양의 설립에 대 한 중대 한 필요가 있다.

설립 RPE 세포 선의 수 존재, 및 셀; 저장의 간단 하 고 편리한 방법을 제공 그러나, passaged 세포 1 차 셀2,,34에 비해 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 그들은 종종 세포 형태학에 있는 변화에 의해 특징은. 예를 들어 기존 셀 라인의 셀 극성 표현 형의 손실 및 단단한 접속점4의 부분 실종 RPE 장벽 속성의 신뢰할 수 있는 연구에 대 한 적합을 발견 했다. 극성 및 적절 한 셀에 셀 연결의 손실 뿐만 아니라 RPE 세포 선을 신속 하 게 성인 RPE5키 melanogenesis 효소의 부재로 인해 그들의 착 색을 잃게됩니다. 색소를 복원할 수 있습니다, 하지만 다시 염색 전송 전자 현미경 검사 법의 조합 포함의 메커니즘의 포괄적인 분석, 멜 라 닌의 존재를 확인 하 진 식 분석, 화학 분석 적 되어 수행된6. 한 가지 더 한계는 RPE 세포 라인 확장된 셀 생활 (때로는-불멸) 있고, 특정 조건에서 양식 식민지7, 부동 고 기판에서 분리 하는 자기 갱신 multipotent 줄기 세포로 변형 시킬 수 있다 8.이 제한 이식 실험3셀 라인 사용을 불가능 하 게.

설립된 RPE 세포 라인의 단점을 고려 하면 신선한 조직에서 얻은 기본 RPE 세포 배양 수는 RPE 공부를 좀 더 생물학적으로 관련 모델 역할을 합니다. 뿐만 아니라와 같은 비타민 A 대사9, 먹어서 포토 리셉터 외부 세그먼트10 이온의 수송11, RPE 특정 기능을 공부 뿐만 아니라와 같은 기본적인 세포 생물학 공부 기본 RPE 세포 사용 된 상피 세포 극성2 , lysosomal 항상성 그리고 autophagy12,13.

지난 몇 년간 수의 기본 RPE 문화에 게시 되었습니다, 연구3,,1415의이 지역에 있는 성장 관심사를 나타내는. 인간의 RPE 세포와 비 인간 RPE 세포 소 및 돼지 RPE 세포 등 수많은 프로토콜 했다 게시 된16,17,,1819. 그러나, 그들의 매우 더 작은 크기 때문에 마우스 RPE 세포를 처리 하기 위해 더 어렵습니다. 비록 꽤 간행물의 수는 마우스14,,2021에서 RPE 세포 격리 프로토콜, 지금도 많은 연구 없이 RPE 세포를 분리 하 고 투 맥락 막 셀 또는 셀 신경 망막에서의 오염. 여기 선물이 기본 마우스 RPE 세포 배양, 마우스, 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리에서 눈을 얻는 등을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 비디오 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 작업 필요 해 부 기법에 대 한 지침을 시작 하는 연구자에 대 한 특히 유용할 것 이다.

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프로토콜

동물 주제와 관련 된 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 피츠버그 대학에 의해 승인

1. 준비 솔루션

  1. 성장 매체에 의해 보충 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린/스, 2.5 m L-글루타민, m 및 1 x 메모리 불필요 한 아미노산이 포도 당을 준비 합니다. 미리 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 미디어 따뜻한.
  2. 2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션을 준비:
    1. 300 µ L HEPES 버퍼링 염 분 (50 mM HEPES/코 pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dispase II의 30 mg를 용 해 하 여 100mg/mL dispase II의 재고 솔루션을 준비 합니다. 이 볼륨은 3-4 마우스에 대 한, 그것은 최대 크기를 조정 하거나 아래 실험을 위해 쥐의 수에 따라 수). 이 주식은 4 ° c.에 적어도 1 주 동안 저장 될 수 있다
    2. 살 균 DMEM, 높은 포도 당 및 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링의 1.2 mL dispase II 재고 100 mg/mL의 300 µ L을 추가 하 여 2 %dispase 작업 솔루션을 준비 합니다. 이 단계는 층 류 살 균 조건 하에서 캐비닛에서 수행 되어야 합니다. 미리 준비 된 dispase II 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 따뜻한.

2. 취득 마우스 눈

  1. 모든 승인 된 방법을 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 흡수 성 패드에 두십시오.
  2. 장갑, 입고 엄지와 검지로 눈 주위 넣고 부드럽게 피부 proptose 안구에 밀어.
  3. 피부와 안구 사이 각도 위 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 눈을 잘라. 오염을 방지 하려면 70% 에탄올에 눈을 찍어 잠시.
  4. 즉시 눈에는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 페 트리 접시에 놓습니다.
  5. 2.2-2.4 두 번째 눈을 제거 하려면 단계를 반복 합니다.

3. 눈 해 부

  1. 조심 스럽게 해 현미경 눈에서 결합 조직 제거. 이것은 건조 배양 접시 또는 PBS에 행 해질 수 있다.
    1. 봉합 집게를 사용 하 여 안구에서 결합 조직 고 욕실이 위를 사용 하 여 밖으로 그들을 잘라. 그것은 거의 경우에 공 막 잘라 그대로 후부 eyecups를 얻을 수 있기 때문에 여 sclera를 자르지 않는다.
    2. 결합 조직, 청소 후 다음 세척 단계에 대 한 PBS에 결과 눈알을 유지.
      참고: 모든 다음 단계는 캐비닛 무 균 조건 하에서 층 류에서 수행 되어야 합니다.
  2. 미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 두 번 눈을 씻으십시오. 신중 하 게 미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 눈알 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 새로운 요리에 신선한 매체 매체 및 전송 눈알 발음
  3. DMEM (높은 혈당) 매체를 발음 하 고 37 ° C 배양 기에서 45 분을 위한 미리 데워 진된 2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션에 눈을 품 어.
    참고: 다음 단계에 놓고 눈 조직을 보호 하 고 해 부에 대 한 좋은 매체를 제공 하는 성장 매체에서 eyecups를 조작 합니다.
  4. Dispase II 솔루션을 제거 하 고 오래 된 매체를 발음 하 고 새로운 37 ° C에 미리 데워 진된 성장 매체 (그림 1a)를 추가 하 여 성장 매체에 두 번 눈을 씻고.
    참고: dispase II에 의해 분리, 후 시선 될 부드러운.
  5. 집게와 눈을 누른 층 류 캐비닛 배치 해 현미경 욕실이 위를 사용 하 여 각 눈의 오 라 참나무 주위 절 개 합니다.
    1. 솔루션에 안구 유지, 조심 스럽게 ora 참나무 둘레 컷을 확장 하 고 컷 완료 후 멀리 앞쪽 막 당기 앞쪽 각 막 제거.
    2. 부드럽게 teethed 집게 (그림 1b, 1c)으로 아이피에서 그들을 당겨 렌즈 캡슐과 관련 된 홍 채 색소 상피를 제거 합니다.
  6. RPE 신경 망막의 분리를 촉진 하기 위하여 37 ° C에서 20 분에 대 한 성장 매체에 결과 후부 eyecups를 품 어.
  7. 층 류 캐비닛 배치 해 현미경 4 꽃잎에 후부 eyecups 잘라. 인하 충분히 짧은 만큼 꽃잎을 연결 (그림 1의 d)를 유지 하지만 아이피를 평평 하 게 해야 합니다.
    1. 아이피를 평평 하 게 하 고 나머지를 잡고 집게와 매우 부드럽게 당겨 신경 망막 분리 RPE 맥락 막 sclera 복합 다른 집게 (그림 1e). 가장자리에서 보다 중심에서 철수 시작.
  8. 새로운 메 마른 문화 접시에 4 등분된 모든 조직으로 가득 전송 사전 37 ° C 성장 매체를 따뜻하게 합니다.

4입니다. 기본 RPE 세포의 고립

  1. 함께 4 등분 RPE 맥락 막 sclera 단지 보유 한 꽃잎 집게 슈퍼 파인, 부드럽게 해 현미경 microsurgical 초승달 모양의 칼을 사용 하 여 기본 지하실 막 (Bruch의 막)에서 RPE의 그대로 시트를 벗기다 층 류 캐비닛 (그림 1 층)에 배치.
    1. RPE 시트 P200 micropipette를 사용 하 여 성장 매체를 포함 하는 새로운 메 마른 문화 접시에 전송 합니다. RPE 시트를 전송할 때 여러 번 pipetting으로 성장 매체와 피 펫 팁을 젖은 조직 팁 내부 고정 하지 않도록. RPE 맥락 막에서 명확 하 게 구별할 수 있을 것입니다: RPE 보이는 더 갈색, 맥락 막 어두운 보이는 끈 적 하 고 무성 한 하는 동안.
    2. 맥락 막14RPE 분리 효소 소화와 집게 없이 부드러운 분리 또는 사용.
  2. 2-3 번 사용 하 여 미리 데워 진된 37 ° C RPE 시트 세척 살 균 배양 접시에 성장 매체. 각 세척 단계 후 신중 하 게 다른 조직 파편 망막 또는 맥락 막 등을 피하는 동안 RPE 시트를 수집 합니다. 마지막 세척의 끝에 P200 micropipette RPE 시트를 수집 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어.
    참고: 저기 RPE 시트 원심을 필요 없다: 그들은 1 분 이내 중력에 의해 침전 물 것 이다.
  3. P200 micropipette를 사용 하 여 추가 성장 매체를 제거 합니다. 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 P200 micropipette를 사용 하 여 그들을 triturate. 거품의 형성을 하지 마십시오. 단일 세포 현 탁 액 이상적 이지만 또한 너무 많은 분쇄를 하지 마십시오, 그렇지 않으면 RPE 세포는 살아남을 수 없습니다. 좋습니다 매우 부드럽게 분쇄를 40-50 시간.

5. RPE 세포 배양

  1. 문화 접시에 셀 접시
    1. RPE 세포의 다운스트림 응용 프로그램 그들의 극성의 유지 필요, 접시는 RPE 12 잘 배양 배지에서 미리 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입 2 쥐에서 세포. 높은 밀도에서 셀 도금 경우 RPE 세포 6 각형 모양 및 착 색 등 원래 속성을 유지할 수 있기 때문에 원하는입니다.
  2. 접시를 이동 하거나 경작의 첫 번째 72 h에 대 한 성장 매체를 변경 마십시오. 3 일 후, 오래 된 매체를 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체 바꿉니다. 그 후 문화 매체를 매일 변경 합니다. 일단 RPE 세포 confluency, 2% 성장 매체에서 FBS를 줄일 수 있습니다.
    참고: 셀 수 있는 분할 0.25 %trypsin 사용 하 여. 그러나, 분한 후 셀 그들의 6 각형 모양 및 다음 구절에 염색 잃을 수 있습니다. 우리는 셀 분할 하지 않는 것이 좋습니다 있지만 문화권의 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 경우 기본 셀 무기한 passaged 수 없습니다: 그들은 해제 후 5-7 구절 차별화 하는 데 알려져 있다.

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결과

마우스 기본 RPE 문화권 문화에 1 주 후 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 도달 90-95 %confluency 2 쥐에서 설립. 2 주 후 문화, 셀 100 %confluency 도달 하 고 6 각형, 안료, 및 이중 nucleated 세포의 모자이크를 형성 하기 시작 했다. 문화, 모양 및 착 색, 형성 하기 위하여 계속 하는 세포의 3 주, 4 주 후 셀의 일부 있어 hyperpigmented (그림 2).

기본 RPE 세포 배양의 순도 immunostaining RPE65 항 체 (retinoid isomerohydrolase, 11-시스-retinol 동안 모든-트랜스-아이리스 에스테 르의 변환할 수 있도록 척추 시각적 주기에서 중요 한 효소를 사용 하 여 평가할 수 있습니다. phototr...

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토론

제시 상세한 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 1 주 후 confluency를 도달 6 각형 모양 및 2 주 후 착 색 등 주요 RPE 특성을 제시 하는 신뢰할 수 있는 설립을 수 있습니다. 얻은 RPE 세포 다양 한 비타민 A 대사9,10 의 포토 리셉터 외부 세그먼트 식 균 작용 및 이온 전송11, 상피 세포 극성2, lysosomal 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 항상성 그리고 autophagy12,13. 파생 문화 형태학 전송에 의해 유효성을 검사할 수 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 설명 된 대로 자세히 다른14다운스트림 응용 프로그램에 따라. RPE 세포의 극성을 보여주는 문화의...

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공개 사항

DS는 연구 바이엘 헬스케어, 독일 및 F. 호프만-라 로슈, 스위스에서 자금을 받았다. 나머지 작가 아니 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 이 작품은 방지 실명 (무제한 보조금 Wilmer 눈 연구소와 피츠버그 대학교) 연구에 의해 지원 됩니다.  이 작품도 안과, 피츠버그 대학에서에서 DS 시작 자금에 의해 지원 됩니다.

감사의 글

이 연구는 BrightFocus 재단 (DS)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
animals
2~3주 된 야생형 마우스
NameCompany카탈로그 번호Comments
reagents
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High glucoseGIBCO11965092
Dispase IISigmaD4693
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF4135
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)GIBCO15140122
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)GIBCO11140050
인산염 완충 식염수(PBS), 1X, pH 7.4GIBCO10010023
HEPESCellgro61-034
KOHSigma-Aldrich1310-58-3
NaClAmbionAM9759
L-글루타민(200mM)GIBCO25030-081
에틸 알코올Fisher Scientific111000200
RPE65 항체Dr. Michael Redmond
Fluorescein Phalloidin                                                                                                                     InvitrogenF432
염소 항-토끼 IgG (H+L), Alexa Flour 568                                       인비트로젠A11011                       
염소 혈청Sigma-AldrichG9023
DAPIInvitrogenD1306
Paraformaldehyde (PFA)Polysciences, Inc00380
ZO-1 Polyclonal 항체ThermoFisher Scientific40-2200
NameCompanyCatalog 번호Comments
<>instrumentsand equipments
Laminar flow cabinetBakerSterilGARD SG403A
해부 현미경 (Zoom 실체 현미경)NikonSMZ1500
CO2 incubator with hot air sterilizationBinderC150
CentrifugeEppendorf5702
Petri DishesFisher Scientific0875712
12 mm 폴리에스터 멤브레인 인서트 12-웰 배양 플레이트에 사전 로드, 기공 크기: 0.4 &마이크로; m, 멸균Corning IncorporatedCOR-3460
Westcott 건절개 가위, 표준 블레이드, 날카로운STEPHENS 기구S7-1320
Castroviejo 봉합 겸자 0.12mmStroz 안과 기구E1796
초승달 모양 직선 칼Beaver-Visitec International373808
Dumont 핀셋 #5, 11cm, 직선, 0.1x0.06mm 팁, DumostarWorld Precision Instruments500233
Vannas 가위, 8 cm, 45°; 각도, 표준세계 정밀 기기500260
Millex-GS 주사기 필터 장치, 0.22 &마이크로; mMilliporeSLGL0250S
주사기, 5 mLBD309632
도립 실험실 현미경  라이카 DM IL LED  라이카 
피펫Gilson
Barrier 및 비여과 피펫 팁Thermo Scientific
의 선물인

참고문헌

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