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방법 논문

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

7.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57009

⸱

2018년 4월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Department of Vascular Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine

이 논문에서

요약

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

초록

부상이 나 염증 부상 또는 조직 손상의 사이트에 따라 백혈구의 채용 최근 수십 년 동안 조사 되 고 백혈구 접착 폭포의 개념에 결과 있다. 그러나, 정확한 분자 메커니즘 백혈구 신규 모집에 참여 하지 아직 완전히 확인 되었습니다. 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동) 면역 연구 분야에서 중요 한 주제를 유지, 이후 우리 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 간단한 층 플로우 기반 분석 결과 제시 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생. 생체 외에서 분석 결과 백혈구와 혈관 염증의 다른 모델에서 세포 파트너 간의 상호 작용을 기초 분자 메커니즘 연구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 설명 층 플로우 기반 분석 결과 사용 하 여 병렬 흐름 챔버는 거꾸로 단계 대조 현미경 카메라에 연결 된 백혈구 내 피 세포 및 혈소판, 시각 다음 기록 될 수 있는 상호 작용을 공부 하 오프 라인 분석. 내 피 세포, 혈소판, 또는 백혈구 억제제 또는이 프로세스 동안 특정 분자의 역할을 결정 하는 항 체와 pretreated 될 수 있습니다. 전단 조건, 즉 동맥 또는 정 맥 전단 응력, 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 의해 쉽게 적응 될 수 있다.

서론

부상, 염증, 또는 감염, 백혈구 신속 하 게 응답에 병원 체 또는 손상-관련 된 분자 패턴 (PAMPs, DAMPs)는 활성화 상태로 변경 하 고 혈 류 염증과 조직 손상의 사이트로 이동 합니다. 백혈구의 능력을 그들의 세포질이 고 분자 환경 상호 작용 하는 그들의 올바른 기능에 필수적 면역 세포, 백혈구 접착 결핍증1등 유전 질환에 의해 강조입니다. 백혈구 접착은 지난 수 십년 동안 강렬한 수 사의 대상이 되고있다 그리고 이것은 초기 1990 년대2,3백혈구 접착 폭포의 개념 귀착되. 백혈구 접착 일으키는 혈관 표면 롤오버 셀 피에 백혈구의 selectin-중재 캡처로 시작 됩니다. 이 압 연 백혈구를 endothelium 바인딩된 철새 신호, 예를 들면, 발산, integrins의 활성화를 유도 대 한 검색을 수 있습니다. 그 후, 활성화 integrins 회사 백혈구 체포 결과 내 피 ligands 바인딩 중재. 백혈구 수 있습니다 이후 크롤링 및 확산, 내 피 단층을 관통 하 고 기본 조직으로 transmigrating 하기 전에 extravasate를 준비 합니다. 정식 백혈구 캐스케이드의 기본 개념은 그것의 소개부터 크게 불변에 남아 있었다, 몇몇 중간 단계 추가4. 그럼에도 불구 하 고, 정확한 분자 메커니즘 및 백혈구 신규 모집에서 포함 된 많은 선수의 역할을가지고 하지 명확히 지금까지, 그리고 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동-) 면역 분야에서 중요 한 주제에 남아 있다 연구입니다.

예를 들어 동맥 경화 같은 혈관 염증 성 질병, 중 혈관 벽 드라이브 패 개발에 백혈구 신규 모집 증가. 불안정 한 동맥 경 화성 플 라크 파열 수, 혈소판 및 응고 시스템의 대규모 활성화 하 고 그 후 선박5의 폐색을 선도 합니다. 이 심근 경색 이나 뇌졸중 등 심각한 심장 혈관 결과 발생할 수 있습니다. 또한, 백혈구 및 혈소판 (예를 들어, 매트릭스 구성 요소와 부드러운 노출된 혈관 벽 내부에의 상호 작용의 수많은 연결 예: 관상 동맥의 stenting 후 그것으로 내 피 노출 발생 임상, 근육 세포)와 혈소판 혈관 상해 취재와 백혈구의. 이러한 상호 작용은 monocyte 혈소판 상호 작용 neointima 형성6,7드라이브 수 있습니다 질병의 추가 개발을 위한 중요 합니다. 또한, 혈소판-백혈구 상호 작용 백혈구 integrin 맥-1 (αMβ2)에 의해 중재 및 혈소판 GPIbα 최근 쥐8혈전 증의 새로운 드라이버 확인 되었습니다.

연구, 그리고 고립 된 매트릭스 분자의 광범위 한 스펙트럼, 불멸 하 게 세포 백혈구와 혈관 근원의 라인에 대 한 백혈구 및 혈소판의 원천으로 인간과 동물성 혈액의 넓은 가용성을 감안할 때, 그것은 백혈구를 시뮬레이션 가능 설정, 특별히 설계 된 흐름 관류 챔버를 사용 하 여 실험실에서 흐름에서의 상호 작용 많은 변종 접착 관류 챔버 진공 기반에서 지난 수 십년 동안 설계 되었습니다. 모든 이체는 공통점이 움직이지 부분 (예를 들어, 교양된 혈관 세포 또는 매트릭스 단백질)으로 더 큰 누출 방지 챔버를 움직이지 부분에 체액의 관류를 사용 하는 미리 정의 된 채널을 갖춘 조립. 또한, 성형 기술 진보 실리 카 폴리머9기반 맞춤 솔루션의 개발을 사용할 수 있습니다. 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 주로 흐름 관류 장치10의 전단 응력 특성을 결정합니다. 이 문서에서는, 우리는 생체 외에서 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 방법 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생 제시. 여기에 제시 된 방법의 장점은 그들은 일반적인 카메라 연결 된 형광 현미경을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하 고 높은 기술 능력을 보유 하는 경험을 필요 하지 않습니다. 생체 외에서 시험 (예를 들어, 추가 억제제 또는 항 체를 차단 하 여), 여러 가지 방법으로 조작할 수 있습니다 따라서 혈관 염증의 다른 모델에 적용 그리고 접착의 조사 단백질 기능을 허용 또는 특정 화합물의 평가입니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 의료 윤리 및 동물 윤리 보드의 마스트리히트 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 플로우 기반 분석 결과 인간 세포와

  1. 인간의 혈액에서 혈소판의 분리
    1. 응고 제 시트르산 (3.2%)에서 정 맥 혈액을 그립니다.
    2. 1/15 양의 산 시트르산 포도 당 추가 (ACD: 80mm trisodium 시트르산, 52 m m 구 연산 및 183 mM 포도 당) 피를.
    3. 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 15 분 동안 브레이크 없이 350 x g에서 원심.
    4. 15 mL 원뿔 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 ACD의 1/20 볼륨을 추가 합니다.
    5. 혈소판 가난한 플라스마 (PPP)를 15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 원심.
    6. 폐기는 상쾌한. 피펫으로 팁 (P 1000)의 끝을 잘라, 그것 넓은 구멍, 혈소판 활성화의 예방에는 에이즈 그리고 신중 하 게 혈소판 버퍼 ph 6.6 PRP와 동일한 볼륨에 혈소판 펠 릿을 일시 중단 (PB: 136 m m NaCl, 10 mM Hepes 2.7 m m KCl, 2 mM MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.1% 포도 당). ACD의 20 분의 1 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
    7. 15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 혈소판 작은
    8. 삭제는 상쾌한 고 신중 하 게 위에 혈소판 1 mL 혈소판 버퍼 (pH 7.5) 일시 중단.
    9. 자동된 혈액학 분석기 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 합니다.
    10. 2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 혈소판 버퍼 (pH 7.5)로 볼륨을 조정 합니다.
  2. (Brinkmann 외. 에서 적응 하는 인간의 혈액에서 polymorphonuclear 세포의 고립 11 )
    1. 헤 파 린 (10 U/mL)로 응고 제 24 mL의 혈액을 그립니다.
    2. 1.077 g/mL 밀도 polysucrose 나트륨 diatrizoate 매체의 6 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 15 mL 원뿔 튜브, 그리고 신중 하 게 위에 레이어 5-6 mL 전 혈을.
    3. 브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.
    4. 발음 하 고 명확한 노란 가기 레이어를 삭제 낮은 붉은 단계 granulocytes 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 포함 된 전송. 2 mM EDTA 14 mL, 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기의 최종 볼륨을 포함 하는 PBS를 추가 하 여 셀을 씻어.
    5. 한편, 밀도 그라데이션 중간 준비 (예를 들어, percoll, 재료의 표참조) 2 mL PBS 재고 솔루션 x 10와 18 mL 밀도 그라데이션 매체를 혼합 하 여 작업 솔루션. PBS이 작업 솔루션을 희석 (1x) 85%, 80%, 75%, 70%, 그리고 65% 그라데이션 중간 솔루션 4.25 mL를.
    6. 서로 모든 중간 비율의 2 개 mL를 레이어 링 하 여 밀도 그라데이션으로 2 원뿔 튜브를 준비 합니다. 가장 높은 농도 함께 시작 하 고 감소 하는 순서에서 계속. 튜브에 레이어 방수 표시와 함께 표시 합니다.
    7. 신중 하 게 각 두 준비 그라디언트에 세포 현 탁 액의 2 mL 레이어.
    8. 신중 하 게 균형된 원심 분리기에서 브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.
    9. 원심, 후 상위 계층 및 65%의 대부분을 제거 레이어 (첫 번째 링) PBMCs, 그리고 interphases 85% 계층까지 남은 화이트 새로운 튜브에 수집 (두번째 반지, PMN).
    10. PBS 2 m m EDTA, 튜브 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기를 작성 하 여 세포를 씻어.
    11. 상쾌한을 제거 하 고 행 크의 버퍼 (pH 7.45), 포함 10 mM Hepes 및 0.2% 인간의 알 부 민 (분석 결과 버퍼)의 1 mL에 sedimented 셀 (일반적으로 ≥95 %는 PMN) 일시 중단.
    12. hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 1 x 106/mL에서 일시 중단.
    13. 형광 라벨 및 관류 백혈구 (단계 3.3)의 계속.
  3. 준비의 부착 혈소판-혈관 세포-monolayers
    1. 세포 배양 접시 준비 (경작된 한 세포)
      1. 미리 희석된 쥐 꼬리 콜라겐 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)의 1 mL와 함께 35 mm 셀 문화 요리 코트.
      2. 37 ° C에서 30 분 동안 incubate 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고, 한 번 PBS 가진 접시를 세척.
    2. 문화 요리에서 혈관 세포의 문화
      1. 주 (예를 들어, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) 또는 (예를 들어, EA 불멸 하 게 혈관 세포 분리. Hy926, SVEC) 1.5 mL 셀 분리 솔루션 (예를 들어, accutase) T75 플라스 크에 합류를 성장. 세포 분리 솔루션 무력화 챔버 계산 셀 셀 농도 결정 하는 적절 한 성장 매체의 4.5 mL를 추가 합니다. 적절 한 성장 매체 (예를 들면, 완전 한 내 피 세포 성장 매체)에 105 셀/mL x 0.5에서 세포를 일시 중단 합니다.
      2. 각 35 mm 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가 합니다. 5% CO2 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 셀 (셀 유형에 따라 24-48 h 복용) 합류까지 문화.
    3. 유리 coverslip 준비 (혈소판 부착)
      1. HCl EtOH에 한 번 유리 coverslip 담가 (1.2 M / 50 %v / v).
      2. 초순에 2 번 coverslip 린스.
      3. N2coverslip 건조.
      4. 사전 코트 유리 coverslip 희석된 쥐 꼬리 콜라겐의 관류 챔버의 채널의 위치에 따라 100 µ L와 난 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)을 입력 합니다.
      5. RT에서 30 분 동안 품 어 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고 씻어 coverslip 3 x PBS.
      6. 실시간에서 0.5 h HEPES에 1 %BSA 콜라겐 코팅 coverslip 차단
      7. 세척 하 고 건조는 coverslip 관류 챔버에 탑재. 격리에서 인간 혈소판 또는 각각 1.1 또는 2.1, 단계에 설명 된 대로 마우스 피.
    4. 혈소판의 동원 정지
      1. 채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 70 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.
      2. 신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판 대체.
    5. 혈관 세포 단층의 자극
      1. 37 ° C, 5% CO2에서 4 h에 대 한 신선한 미디어 10 ng/mL 종양 괴 사 인자 α (TNFα)를 포함 하는 미디어를 대체 하 여 혈관 세포를 자극.

2. 플로우 기반 분석 Murine 셀

  1. 마우스의 혈액에서 혈소판의 분리
    1. 심장 빵 꾸에서 21 G 바늘 (~ 1 mL)을 사용 하 여 그리기 피 취 (마 취 제 80 mg/kg 및 medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 주-오래 된 마우스 (C57Bl/6)로 응고 제 시트르산 (3.2%)에서.
    2. ACD의 1/6 볼륨을 추가 합니다.
    3. 220 x g에서 원심 분리기, 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 얻기 위해 5 분 동안 중간 브레이크.
    4. 새로운 튜브에 적혈구의 1/3 플러스 상쾌한 (~ 600 µ L)를 전송
    5. 6 분 브레이크 없이 95 x g에서 원심.
    6. 상쾌한 (PRP)을 전송 하 고 Tyrode의 버퍼에 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 (TH 버퍼: 136 m NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 m m KCl, 0.42 m NaH2포4m m * H2O 2 m m MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민, 0.1% 포도 당) 자동된 혈액학 분석기.
    7. ACD + 0.1 U/mL apyrase의 1/25 볼륨을 추가 하 여는 혈소판을 세척 하 고 2,870 g, 2 분 동안 중간 브레이크에서 원심.
    8. 삭제는 상쾌한 고 600 µ L TH 버퍼, ACD의 1/10 볼륨 및 0.1 U/mL apyrase를 추가 합니다. 피펫으로 팁 (P 1000)를 잘라 넓은 만드는 보어, 혈소판 활성화의 예방에서 원조 하 고 부드럽게 펠 릿을 일시 중단.
    9. 2,870 g에서 원심 분리기, 2 분 동안 중간 브레이크
    10. 삭제는 상쾌한 고 부드럽게 일 버퍼에는 혈소판을 일시 중단.
    11. 2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 일 버퍼와 볼륨을 조정 합니다.
  2. 혈소판 부착 monolayers의 준비
    1. 1.3.3 당 유리 coverslip (부착 혈소판)를 준비 합니다.
  3. 혈소판의 동원 정지
    1. 채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.
    2. 신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판을 바꿉니다
  4. 마우스 혈소판 단층의 자극
    1. 백혈구 (단계 3.3)의 관류, 전에 트 롬 빈의 관류에 의해는 혈소판을 자극 (0.5 nM) 37 ° c.에 3 분 동안 HHHSA 버퍼에

3. 형광 라벨 및 백혈구 (PMN 또는 인간과 RAW264.7 THP-1 또는 Murine 플로우 기반 분석 결과 대 한 기본 마우스 Monocytes)의 관류

  1. 형광 라벨
    1. 셀 permeant 녹색 형광 핵 산 얼룩 (1 µ M) 백혈구 (1 x 106/mL) 레이블을. 37 ° c.에 30 분에 대 한 셀을 품 어
    2. 5 분, 300 x g에서 원심 분리 하 여 PBS 가진 세포를 세척 하 고 0.5 x 106 셀/mL (5 mL 당 유량에 따라 테스트 조건) 분석 결과 버퍼에서의 농도에 세포를 중단.
  2. 흐름 챔버 시험 준비
    1. 셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다. 미리 따뜻한 물 목욕 37 ° c
    2. 받아 관류 주사기 (50 mL), 설치 주사기 주사기 홀더, 및 세트에 펌프 철회 모드. 0 ml, 펌프 볼륨을 설정 하 고 50 mL 주사기 26.70 m m 직경 설정.
    3. 튜브의 한쪽 끝을 팔꿈치 luer 커넥터를 연결 합니다. 주사기에 luer 잠금 커플러 놓고 luer 잠금 커플러를 팔꿈치 luer 커넥터와 튜브를 연결 합니다. 흐름 약 실에 무료 튜브 끝을 연결 합니다.
  3. 백혈구 관류 및 접착
    1. 셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다.
    2. 백혈구 관류와 접착에는 혈관에 대 한-또는 혈소판 단층, 분석 결과 버퍼 채우기 1 mL 피펫으로와 튜브를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 두 번째 튜브 다음 놓고, 튜브를 집어넣은 흐름 챔버에 연결.
    3. 백혈구 관류, 이전 세포 현 탁 액을 3mm CaCl2 와 2 mM MgCl2 를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
    4. 챔버와 튜브에서 가능한 공기를 제거 하는 셀의 관류 사전 분석 결과 버퍼 perfuse
    5. 꽉 그들을 당기고 하 여 튜브 끝을 닫고 갇혀에서 기포를 방지 세포 현 탁 액을 분석 결과 버퍼에서 튜브를 전환 합니다. 첫 번째 셀 도착할 때까지 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀을 perfuse.
    6. 2 분에 대 한 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀 perfuse 및 (예를 들어, EVOS FL) 거꾸로 위상 대비/형광 현미경으로 압 연 및 부착 세포의 2-6 분 사이 6 사진을 캡처할 100 배 확대를 사용 하 여 연결 에 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라.
      참고: 흐름 속도/전단 응력 흐름 챔버 크기와 perfusate의 점도에 따라 달라 집니다. 여기에서 사용 하는 관류 챔버에 대 한 ( 재료의 표참조):
      Τη= *Φ 97.1*
      Τ: 전단 응력 (1 dyn/cm2)
      Η: 점성 (0.015 dyn * s/cm2)
      Φ: 유량 (0.67 mL/min)
  4. 백혈구 드 접착
    1. De-adhesion에서 덫을 놓아 되 고 기포를 방지 튜브를 압박 하 여 분석 결과 버퍼에 셀 서 스 펜 션에서 튜브를 전환 합니다.
    2. 세포 관류 적절 한 흐름 속도/전단 응력 (참조 3.3.7 참고) 분석 결과 버퍼와 분리 합니다.
  5. 백혈구 환생
    1. 백혈구 환생에 대 한 백혈구 (3 단계) perfuse는 적절 한 양의 백혈구 준수 (~ 50 셀/보기 분야) 때까지.
    2. 분석 결과 버퍼에 백혈구 정지를 바꿉니다.
    3. 시간 경과 의해 37 ° c.에 30-60 분 마다 10-15 s transmigrating 셀을 기록

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결과

공부 하 고 내 피 백혈구 접착, 붙일 레이블된 THP-1 셀 했다 3 다 인/c m2에서 2 분에 대 한 TNFα 또는 비 자극 하는 내 피 단층 위에 끼얹는다. 부착 monocytic 세포의 총 수는 2-6 분 동안 6 독립 필드를 캡처하여 관류의 2 분 후 결정 되었다. 부착 세포 6 사진 거꾸로 위상 대비/형광 현미경 (예를 들어, EVOS FL)으로 캡처한 계량 했다 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라에 연결 된 10 배 확대를 사용 하 고 평균 부착 세포로 표현 되었다 / mm2. TNFα와 내 피 자극 시 THP 1 체포 크게 unstimulated endothelium에 비해 증가. 대표 현미경과의 정량화 단단히 부착 THP-1 비-또는 TNFα-자극 내 피 세포를 그림 1에 표시 됩니다. 혈소판-백혈구 접착 1 다 인/c m2에...

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토론

이 생체 외에서 분석 결과 혈관 염증, 동안 백혈구 신규 모집의 기본 메커니즘을 조사 하는 간단한 방법 이지만 지적을 몇 가지 중요 한 포인트는. 이 분석 결과 성공적으로 수행 하기 위한 첫 번째 요구 사항은 백혈구는 그대로 고 confluent 혈관 또는 혈소판 단층의 살포 이다. 이 사전 코팅 콜라겐 유형 표면의 난에 의해 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 주요 혈관 세포를 작업할 때 그것은 부드럽게 권장된 콜라 포함 된 분리 솔루션을 사용 하 여 셀을 분리 하는 것이 중요 (참조 테이블의 자료), 덜 엄격한입니다, 하지만 효과적 트립 신으로. 혈소판 monolayers에 대 한 혈소판 활성화 및 집계를 방지 하기 위해 절연 동안 혈소판을 부드럽게 씻어 중요 하다.

또 다른 중요 한 고려 사항은 펌프의 연속성을 유지 하 고 있다 철수 모드는 불연속성을 리드 이후는 관류에 대 한 사용 방해 흐름 속도 전단 조건. 따라서, 부정확 실제...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 박사 마틴 M. 슈미트와 선 Fraemohs 감사합니다. 이 작품 (ZonMW VIDI 016.126.358, 혈액 수혈 연구 (LSBR Nr. 1638) Landsteiner 재단 및 도이치 가운데 (SFB1123/A2) R.R.K.에 게 수 여 과학적인 연구를 위한 네덜란드 기초에 의해 지원 되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
역 형광 현미경 예: EVOS-FLLife Technologies Europe bv
펌프 예: 모델: 210-CE  월드 정밀 기기78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dishcorning353001
50 mL 주사기Becton Dickinson300137
실리콘 튜빙;VWR228-0700
엘보우 루어 커넥터 남성Ibidi10802
암 루어 록 커플러Ibidi10823
플로우 챔버대학 병원 RWTH Aachen특허 DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strö mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgä Zelloberflä을 사용하십시오. 첸. 2005년. 
Ibidi 스티키 슬라이드 VI 0.4Ibidi80608
스티키 슬라이드용 커버슬립 Ibidi10812
콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리Life Technologies Europe bvA1048301
재조합 인간 TNF-&알파;Peprotech300-01A
펩타이드 6 용 트롬빈 수용체 활성제 (TRAP - 6)Anaspec / Eurogentec24191
SYTO 13 녹색 형광 핵산 염색Life Technologies Europe bvS7575
Hanks ' 균형 잡힌 소금 용액 10xSigma-Aldrich ChemieH4641
HEPES 버퍼 용액 1M, 액체Life Technologies Europe bv15630049
BUMINATE 알부민, 25% Baxter60010
주사용 물B. Braun3624315
염화칼슘 디하이드레이트Merck102382 
염화마그네슘 육수화물 Sigma-Aldrich ChemieM2670
ApyraseSigma-Aldrich ChemieA6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)Promocell GmbHC-12203
Endothelial Cell Growth Medium (ready-to-use)Promocell GmbHC-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)ATCC  PCS-100-011
혈관 세포 기저 매체 ATCCPCS-100-030
내피 세포 성장 키트-BBEATCCPCS-100-040
기본 인간 대동맥 평활근 세포(HAoSMC)ATCCPCS-100-012
혈관 평활근 세포 성장 키트ATCCPCS-100-042
인간 내피 세포주, EA.hy926ATCCCRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
마우스 내피 세포주, SV 40 형질전환(SVEC4-10)ATCCCRL-2181
인간 단핵 세포주, THP-1DSMZACC-16
RPMI 1640 with Ultra-GlutamineLonzaBE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7ATCCTIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High glucoseGibco11965092
AccutasePromocell GmbHC-41310
PercollSigma-Aldrich ChemieP1644
Histopaque 1119Sigma-Aldrich Chemie11191
10x PBSLife Technologies Europe bv14200075
BD  Vacutainer 플라스틱 혈액 채취 튜브와 나트륨 HeparinBecton Dickinson367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC 응고 나트륨 시트레이트 3.2% Greiner Bio455322
HCl/EtOH 혼합물(1.2 mol/L HCl 및 50% 에탄올)Sigma-Aldrich Chemie흄 후드에서 0.3L HCl(4 mol/L)과 0.7L의 70% v/v 에탄올을 혼합하여 준비합니다.
제 물

참고문헌

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