방법 논문

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

DOI:

10.3791/57040

⸱

2019년 5월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, 3Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

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우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.

초록

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장 내 오르가노이드 배양은 시험관내에서 장 줄기 세포를 조사하고 생물학을 토굴할 수 있는 독특한 기회를 제공하지만, 오르가노이드의 유전자 발현을 조작하는 효율적인 접근법은 이 분야에서 제한된 진전을 이루었습니다. CRISPR/Cas9 기술은 오르가노이드 생성을 위한 세포의 정확한 게놈 편집을 허용하는 동안, 이 전략은 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 서열 분석에 의하여 광범위한 선택 및 검열을 요구합니다. 여기에서, 우리는 장 오르가노이드의 능률적인 바이러스성 전송을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 접근 방식은 빠르고 매우 효율적이므로 CRISPR/Cas9 기술에 내재된 시간과 비용을 줄입니다. 우리는 또한 유전자 발현 또는 침묵을 확인하기 위하여 이용될 수 있는 면역 조직화학또는 면역형광 염색을 가진 추가 분석을 위한 본래 오르가노이드 문화에서 동결된 단면도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자 발현 또는 침묵에 대한 바이러스 벡터의 성공적인 환전이 달성된 후, 장 줄기 세포 및 토굴 기능을 빠르게 평가할 수 있다. 대부분의 오르가노이드 연구는 시험관 내 분석을 사용하지만, 오르가노이드는 생체 내 기능 분석을 위해 마우스에 전달될 수 있습니다. 더욱이, 우리의 접근은 현재 유효한 치료가 일반적으로 게놈을 바꾸기 보다는 오히려 유전자 발현 또는 단백질 기능을 변조해서 작동하기 때문에 약에 치료 반응을 예측하기 위한 유리합니다.

서론

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장기간에 걸쳐 소장이나 결장에서 3차원 (3D) 오르가노이드로 마우스 또는 인간 토굴 세포를 배양하는 능력은 이러한 문화가 생체 내에서 장 상피의 특징을 정의하기 때문에 중요한 돌파구를 제공했습니다. 1개 , 2개 , 3. 기본 토굴에서 파생 된 오르가노이드는 자기 갱신 및 자기 조직능력이 뛰어나며, 기원조직과 유사한 세포 기능을 나타낸다. 실제로, 오르가노이드는 생체 내 토굴의 구조적 조직뿐만 아니라 많은 분자 특징을 재구성하여 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 설명하기 위하여, organoid 연구 결과는 조직 재생에관련시킨 새로운 분자 통로를 밝혔습니다 1, 2,3,4,5 뿐만 아니라 기능을 강화할 수 있는 약 병리학 설정6,

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프로토콜

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이 프로토콜은 존스 홉킨스 의료 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시된 방법10,11,12,13에서수정됩니다.

1. 시약의 준비

  1. 신선한 293T 배지를 몇 시간 전에 준비하고 사용 하기 전에 적어도 10 분동안 수조에서 37 °C로 따뜻하게 준비하십시오 (표 1).
  2. 바이러스 성 포장을 위한 플라스미드 DNA2,13,14를 준비한다. (표2).
  3. 기타 필요한 모든 재료(재료표)를획득합니다.

2. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 입자 생산

  1. 인간 배아 신장 (HEK) ....

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결과

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여기에서는 자기장에 노출된 자기 나노 입자를 활용하여 관심 있는 세포에 렌티바이러스를 전달하는 신속하고 고효율의 트랜스덕션 기술을 설명합니다. 쉽게 사용할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 갓 단리 된 토굴 세포 (그림1A)를변환할뿐만 아니라, 오르가노이드 (그림2)및 더 일상적인 형질전환 접근법에 불응성 다른 세포를 변환하기 위해이 방법을 적용했습니다. 렌티바이러스 입자는 자기 나노입자에 쉽게 공액화될 수 있으며, 생성된 바이러스-나노입자 복합체는 자기판을 사용하여 자기장을 적용함으로써 효율적으로 전달된다. 이 접근을 낙하하기 위하여는, 우리는 GFP가 형광 현미경 검사법으로 형질전환한 세포를 확인하기 위하여 이용될 수 있었다 는 것을 GFP에 연결된 lentiviral 벡터를 처음으로 시험했습니다. GFP는 유기체 발달의 각 단계에서, 토굴 세포가 낭종 과 같은 .......

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토론

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오르가노이드로서 성인 장 상피의 1차 배양은 줄기세포 기능, 장상피 항상성 및 병리학 1,2,3에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 4. CRISPR/Cas9 기술은 오가노이드9를유전자 조작하는 데 사용될 수 있지만 원하는 유전 적 변화에 대한 서열 분석에 기초한 광범위한 스크리닝 및 선택에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜의 목표는 렌티 또는 레트로바이러스가 장내 오르가노이드에 자성 나노입자 전달을 위한 비디오 기반 자습서를 통해 명확하고 간결한 지침을 제공하고 추가 분석을 위해 동결된 절편을 제공하는 것입니다.

이 프로토콜은 장 오르가노이드를 유전적으로 엔지니어링하고 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다

감사의 글

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이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), 미국 폐 협회, 알레게니 건강 네트워크의 보조금에 의해 지원되었다 홉킨스 연구 기금과 홉킨스 소화기 질환 기초 연구 핵심 센터.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMThermo Fisher Scientific11965092293T 세포용 기본 배지
DMEM/F12+Thermo Fisher Scientific12634010오가노이드 배양 배지 및 오가노이드 분해 완충액용 기본 배지
OPTI-MEMThermo Fisher Scientific11058021바이러스 플라스미드 형질주입 배지
Fetal Bovine SerumCorning35-011-CV바이러스 채취 배지 및 293T 배지의 구성 요소
Pen/StrepThermo Fisher Scientific15140122오가노이드 배양 배지 및 crypt dissociation buffer
PBS (Ca2+, Mg2+)Thermo Fisher Scientific10010049 세척 버퍼 및 crypt 해리 버퍼 구성 요소
Mem-NEAAThermo Fisher Scientific11140050오가노이드 배양 배지의 구성
GlutamaxIIThermo Fisher Scientific35050061오가노이드 배양 배지의 구성 요소
HEPESThermo Fisher Scientific15630080오가노이드 배양 배지의 구성 요소
EGFMillipore SigmaE9644오가노이드 배양 배지의 구성 요소
NogginPeprotech250-38 B오가노이드 배양 배지
R-spondinR&의 구성 요소; D7150-RS-025/CF오가노이드 배양 배지의 구성 요소
인간 재조합 인슐린Millipore SigmaI9278-5ml오가노이드 배양 배지의 구성
니코틴아미드Millipore SigmaN3376-100G형질 도입 배지의 구성 요소
Wnt3AR& D5036-WN-010형질 주입 매체의 구성 요소
Y27632Millipore SigmaY0503-1MG형질 전달 매체의 구성 요소
0.5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020크립트 해리 버퍼
DTT (dithiothreitol)Thermo Fisher ScientificR0861크립트 해리 버퍼
Dispase IMillipore의 구성 요소 SigmaD4818-2MG오가노이드 분해 완충액
DNase IMillipore Sigma11284932001오가노이드 분해 완충액
성분(성장 인자 감소)코닝356231오가노이드 내장을 위한 매트릭스로 사용
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070바이러스 생산에서 트랜스펙션을 위한 배지
ViralMag R/LOz BiosiencesRL40200바이러스 형질도입의 자성 입자
자석 플레이트Oz BiosiencesMF10000바이러스 형질도입을 촉진하는 마그네틱 플레이트
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019바이러스 생산에서의 형질주입 에이전트
Poly-D-LysineMillipore SigmaA-003-E293T 세포 파종 전 플레이트용 코팅
4% 포름알데히드 용액BosterAR1068오가노이드
O.C.T 임베딩 화합물고정용 솔루션 Thermo Fisher Scientific4583S오가노이드 포매
5mL 팔콘 폴리스티렌 튜브Corning352054
50mL 팔콘 튜브Sarstedt62.547.100
Orbitron rotator II Rocker ShakerBoekel Scientific260250
Olympus Inverted microscop CK30OlympusCK30crypt 스캔 및 카운팅용
Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescenceNikonAxiovert 200crypt 형광 관찰용
Amicon Ultra-15 Ultracel-100 멤브레인이 있는 원심 필터 장치Milipore SigmaUFC910024바이러스
농축용pluriStrainer 20 &마이크로; m (Cell Strainer)pluriSelectSKU 43-50020오가노이드 단편 준비용
Falcon Cell StrainerFisher Scientific352340크립트 분리 후 비슷한 크기의 cyrpts 준비용
Greiner CELLSTAR  멀티웰 배양 플레이트 48웰(뚜껑으로 TC 처리)Millipore SigmaM8937-100EAForD2:D37+D16:D37g 오가노이드 절편
동물 균주: C57BL/6JJackson Lab#000664오가노이드 배양용
의 구성 요소 요소 요소 의 구성 요소용

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment an....

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재인쇄 및 허가

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