말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

세계 보건 기구에 따르면 말라리아의 212 백만 새로운 경우 2015 년에 전세계 있었고 약 429,000 명이 사망, 주로 어린이 나이¹의 5 년. 종종 연관 된 혈관 부전, 심한 질병으로 이어지는 메커니즘 남아 병이 정의². 변형 체iRBCs extracellular 소포 (EVs)로 알려진 작은 이중 지질 막 분야 분 비. 그것은 알려져 이러한 EVs는 잠재적으로 관련 감염 프로세스 및 호스트 면역 반응 감염; 그러나, 약간 말라리아 감염³동안 이러한 작은 소포의 정확한 기능에 대 한 알려져 있다. 그들은 두 가지 중요 한 역할을 재생 가능: 한 반면에, 그들은 수 있습니다 기여할 병 인 세포^4,5;를 활성화 하 여 그리고 다른 한편으로, 그들은 셀룰러 통신 기생충 및 기생충과 호스트^6,7을 중재할 수 있습니다. 사실, EVs를 통해 서로 간의 기생충 단백질 또는 핵 산을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 Trypanosoma brucei rhodesiense EVs 독성 요소 Serum Resistance-Associated (SRA)를 전송할 수 있습니다 그리고 다른 T. brucei 와 호스트 모두 적혈구⁸타겟팅 할 수 있습니다. 또한, P. falciparumiRBCs EVs 내의 핵 산을 전송 하 여 서로 간에 통신 합니다. 기생충을 최적화 하 고의 성장을 동기화 수 있습니다. 사실, EVs gametocyte 변환의 주요 레 귤 레이 터 수 되 고 따라서 전송 단계⁷의 규정에 기여.

뿐만 아니라 EVs는 기생충을 통제, 그들은 또한 기생충-호스트 상호 작용을 중재. 우리는 최근에 iRBCs에서 EVs 호스트 파생 microRNAs (miRNAs; 21-25의 뉴클레오티드⁹의 범위에 작은 RNA 종) 인간의 내 피 세포에 의해 채택 되었다을 포함 발견 했다. EVs에 miRNAs 안정 Ago2와 복잡 한 형성 (구성원 RNA 유도 침묵의 복잡 한), 받는 사람 세포에 전달 되 면 구체적으로 유전자 발현을 침묵 하 고 셀¹⁰의 장벽 속성에 영향을 미치는입니다. 표준 프로토콜 EVs의 기능을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 자, 먼저 받는 사람 세포에 의해 그들의 통풍 관을 조사 하기 위해 EVs의 형광 라벨 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, confocal 현미경을 사용 하 여 셀 내부 EV의 운명을 추적 수는. 여러 형광 염료 EVs를 추적을 사용할 수 있습니다. 아민-반응성 염료, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 그리고는 소포 안에 한 번 Calcein-오전 될 형광. 밝게 하 고 더 많은 일정 한 신호를 제공 하기 때문에 우리 PKH, amphiphilic 레이블을 사용을 선호 합니다. 이 방법은 EVs와 받는 사람 세포 간의 상호 작용을 이해 하는 중요 한 정보를 제공 합니다. 경우에 따라 EVs는 세포의 표면에 묶는, 하는 동안 일부 소포는 급속 하 게 채택 되었다. 글귀, 시 EVs는 그들은 그들의 규정 하는 기능을 발휘 하는 세포에 그들의 화물을 제공 합니다.

여기, 우리는 세포 단층을 통해 형광 dextran의 전송을 측정 하 여 체 외에서 내 피 세포의 장벽 기능을 측정 하는 프로토콜을 설명 합니다. 방사선된 마커 같은 더 민감한 추적기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 사용 하기 위해 특별 한 안전 조치를 요구 한다. 다른 분석 실험 꽉 접합 무결성 측정 transendothelial 전기 저항 (TEER) 같은 생체 외에서 의 장벽 기능을 측정 하기 위해 존재 한다. 마지막으로 조로-1, 긴밀 접합 단백질 면역 형광에 의해 시각화 뿐만 아니라¹⁰으로 꽉 접합 무결성 평가 수 있습니다. EVs 잠재적인 규정 특성을 가진 여러 화물을 포함 하는 복잡 하 고 유형이 다른 엔터티 있기 때문에, 그것을 받는 사람 세포에 미치는 영향을 연구 하는 특정 RNA overexpress 유용 합니다. 따라서, 우리는 또한 관심¹⁰의 miRNA를 표현 안정적 셀 라인을 생성 하는 것을 목표로 하는 프로토콜을 정의 합니다.

인간의 Rbc는 Swissethics (swissethics.ch)의 지침에 따라 건강 한 기증자의 혈액에서 얻은 했다.

참고: P. falciparum 기생충 문화 (3D 7)와 EV 생산은 이전에 설명 된 Mbagwu, 외 알. ¹¹ P. falciparum 인간의 병원 체 이기 때문에 처리에 대 한 현지 규정을 참조 하십시오. 문화는 유지 되어야 한다 살 균 전체 시간.

1. 형광 EVs의 라벨

참고: 다음 절차는 EV 막의 지질 지역에서 큰 지방 족 꼬리와 안정적으로 녹색 형광 염료 (PKH67)를 통합 하는 라벨 기술 이용 합니다. 반응은 200 µ L PKH67의 20 µ M 최종 농도 포함 하는 볼륨을 얼룩 마지막에 수행 됩니다. 주위 온도 (20-25 ° C)에서 모든 단계를 수행

1. 장소 100 µ g EVs의 microcentrifuge 튜브에 PBS의 1 mL에.
2. 펠 렛를 7 분에 대 한 최대 속도 (20000 x g) microcentrifuge 관에서 EVs 원심
   참고: 말라리아 EVs에 존재 이므로, 레드-어두운 갈색 펠 릿 관찰 해야. 경우는 상쾌한 붉은, 다음 EVs 있다 lysed.
3. 원심, 후 어떤 EVs를 제거 피하기 위하여는 상쾌한을 신중 하 게, 발음.
   참고: 재현성 및는 얼룩의 효율성을 증가 하기 위하여 희석제 C에 EVs를 resuspending 하기 전에 나머지 버퍼의 양을 최소화 합니다.
4. 희석제 C의 100 µ L에서 EV 펠 릿 resuspend (EV 정지 X 2)와 완전 한 분산을 막으려고 피펫으로 부드럽게.
5. 새로운 microcentrifuge 튜브를 준비 하 고 희석제 C. 소용돌이 잘 혼합의 100 µ L을 PKH67 ethanolic 염료 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 얼룩이 지기 직전이 2 배 염료 솔루션 (40 µ M)를 준비 합니다.
   참고: 이기종 얼룩을 방지 하려면 추가 하지 마십시오 PKH67 ethanolic 염료 솔루션 EV 펠 릿에 직접.
6. 빠르게, 염료 솔루션 (단계 1.5) X 2의 100 µ L EV 정지 (단계 1.4) X 2의 100 µ L 결합 되어 있습니다. 그런 다음 10 번 위아래로 pipetting으로 샘플을 혼합.
7. 빛과 믹스에서 vortexing에 의해 3-4 회 동안 보호 5 분 인큐베이션 단계 1.6 5 분에서에서 EV/염료 정지를 품 어.
   참고: 긴 시간에 대 한 EV/염료 정지 잠복기 때문에 얼룩이 지는 그래서 빠른 이점이, 제공 합니다.
8. 혈 청의 동일한 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 여 착 색 반응 중지 하 고 과잉 염료의 바인딩 수 있도록 1 분 동안 품 어.
   참고: 얼룩이 지는 중지 하기 전에 20 분 20000 x g에서 원심 분리 하 여 EVs에서 혈 청을 고갈 합니다.
9. PBS로 3 번 세척 하 고 스핀 다운 5 분에 대 한 20000 x g에서 1 µ g / µ L의 최종 농도 도달 하는 PBS의 100 µ L에 EVs를 Resuspend.

2. Confocal 현미경 검사 법에 의해 EVs의 시각화

참고: 다음 프로토콜 설명 유리 coverslips에 성장 하는 내 피 세포에 의해 EV 국제화의 추적을 합니다. 내 피 세포는 반 불멸 하 게 인간의 골 수 내 피 세포¹²에 설명 된 대로.

1. 메 마른 환경에서 working coverslips 0.01% 폴 리-L-리 신 실 온 (RT)에서 10 분의 초과 코트.
2. 폴 리-L-리 신 솔루션을 발음 하 고 완전히 말리는 것을 coverslips 허용.
3. Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포 수를 수행 합니다.
4. 완전 한 내 피 세포 성장 매체 폴 리-L-리 신-코팅 coverslips에 보충 혼합을 포함 하 고는 단층에 성장 하는 세포의 1 mL에 1 x 10⁵ 내 피 세포를 전송 합니다.
   참고: 매체 성장 인자 세포는 단층을 형성 하 고 꽉 접합을 형성 있도록 포함 되어 있습니다.
5. 세포는 단층을 형성, 일단 신중 하 게 매체를 발음 하 고 셀을 씻어 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다. 한 번 더 세척을 반복 합니다. PKH67 표시 된 EVs의 50 µ g을 추가 하 고 4 시간 품 어.
   참고: 통풍 관에 대 한 최적의 시간 포인트를 찾으려고 한 시간 코스 수행할 수 있습니다.
6. 4 h 후 매체, 발음 하 고 3 회 초과 및 언바운드 EVs를 제거 하는 PBS 가진 세포를 씻어. 15 분에 대 한 PBS에 3 %paraformaldehyde 솔루션 셀을 수정 합니다.
   참고: 메탄올 중단 될 수 있습니다 걸 고정 과정; 따라서, fixatives 또는 다른 용 매 기반 fixatives 포함 된 어떤 메탄올을 피하기 위해 최상 이다. 메탄올-무료 포 름 알 데히드는 정착 액으로 사용 하는 것이 좋습니다.
7. 3 회 PBS로 세포 세척. 0.1%의 신중 하 게 250 µ L 추가 세포를 permeabilize에 PBS에 트라이 톤 X-100. 5 분에 대 한 RT에서 품 어.
8. PBS로 3 회 세척. 일반적인 바인딩을 차단 하는 RT에 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5 %BSA)의 400 µ L를 추가 합니다.
9. PBS 한번 셀을 씻어. 5 µ L의 각 커버 슬립 당 200 µ L PBS/1% BSA의 phalloidin 재고 솔루션 diluting 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 200 µ L는 coverslip에 얼룩 솔루션의 실시간에서 20 분 동안 품 어 고
10. PBS로 3 회 세척. 30에 대 한 DNA counterstain 2 µ g/mL PBS의 200 µ L에서의 최종 농도에 Hoechst 33342 s.
11. PBS의 400 µ L을 추가 하 여 2는 coverslip 배를 씻어. 조심 스럽게 집게는 coverslip 잡아 하 고 유리 슬라이드에 미디어를 마운트 하는 antifade의 드롭 상단 반전. 부드럽게 휴지로 초과 미디어를 제거 하 고 매니큐어와 양쪽 인감.
12. 4 ° c.에 빛에서 보호 하는 슬라이드 저장
13. 레이저 업무가 405, 488, 543 nm와 63 X, 형광 방출 450-470 nm (파란색), 505-530 nm (녹색), 및 620에서 1.3 나 오일 목표에 confocal 현미경을 사용 하 여 셀을 시각화 nm.
    참고: 일반적인 F-말라 얼룩 결과 그림 1에 표시 됩니다.

3. 내 피 세포 침투성

참고: 내 피 세포 침투성 내 피 세포 단층에 걸쳐 rhodamine B isothiocyanate-dextran (평균 MW 70000)의 이전을 측정 하 여 평가입니다. Dextran 혈관 침투성을 공부 하는 훌륭한 도구를 제공 합니다.

1. 0.4 %Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포를 계산 합니다.
2. 24-잘 조직 문화 삽입 (0.4 µ m 기 공 크기)와 차별화 된 monolayers를 적어도 5 일 동안 그대로 두고 합류 10⁵ 셀 x 0.6의 밀도에서 내 피 세포 격판덮개 두 번째 매일 매체를 새로 고칩니다.
3. 세포는 단층에 도달, 로드 EVs (1 mL에서 50 µ g) 상단 챔버에. 20 mg/mL의 최종 농도에서 최고 잘 rhodamine dextran을 추가 합니다. 5% CO₂와 37 ° C에서 세포를 품 어.
4. 40 µ L 중간 aliquots에서 형광 방출 측정에 의해 잘 아래 형광 dextran의 이전을 모니터링 합니다. 544 nm 여기 및 측정에 대 한 590 nm 방출에서 다중 레이블 microplate 리더를 설정 합니다.
   참고: 확산된 dextran 양의 수 측정할 수 재고 솔루션 설립 보정 곡선을 사용 하 여. 또한, 운동 실험 시간 과정 (그림 2) 외부 챔버 매체의 작은 샘플을 제거 하 여 수행할 수 있습니다. 어떤 치료 없이는 dextran 셀 단층을 통해 무마 합니다.

4. 결정 Puromycin 감도

참고: lentivirus와 셀 라인을 시험 하기 전에 그것은 그 특정 셀 라인에 대 한 선택 된 약물의 kill 곡선을 결정 하는 것이 중요. 모든 셀, 선택 된 약물의 증가 복용량을 사용 하는 복용량 응답 실험을 수행 하는 데 필요한 약물 농도의 최소 금액을 결정 합니다. 각 포유류 세포 라인 실험, 전에 다른 감도 있기 때문에 항생제의 최적 농도 아래 서 kill 곡선 적정 개발 하 여 결정 되어야 합니다.

1. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 완전 한 내 피 세포 성장 매체 포함 하는 보충 믹스에에서 1 x 10⁵ 셀/mL의 농도에서 내 피 세포 resuspend
2. 내 피 세포 성장 매체의 100 µ L의 최종 볼륨에서 96 잘 접시로 플레이트 1 x 10⁴ 셀.
3. 0.1-10 µ g/mL의 농도 얻기 위해 항생제를 포함 하는 매체의 100 µ L를 추가 ( 그림 3참조).
4. 세포 생존 능력 20 X 목표를 사용 하 여 가벼운 현미경 2 일 마다 검사 합니다. 10 월 14 일에 대 한 셀을 문화 고 puromycin 세포 성장에 따라 매 2-3 일을 포함 하는 미디어를 대체 합니다.
5. 10 µ L/잘 MTS 시 약 각 잘 믹스에 추가 하 고 표준 문화 조건에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 품 어.
6. 짧게 통에 접시를 흔들 및 490에서 플레이트 리더를 사용 하 여 치료 및 치료 세포의 흡 광도 측정 nm (그림 3).

5. 변환 Lentiviral 벡터와 내 피 세포의

1. 플레이트 1 x 10의 완전 한 매체 변환 전에 하루 1 mL에 내 피 세포를⁵ . 셀에는 50-80 %confluency 도달 했습니다 때 변환을 수행 합니다.
2. 얼음, lentivirus 녹여 그리고 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 바이러스의 aliquots. 스핀 30 200 x g에서 자료 다운 유출 피하기 위하여 열기 전에 튜브에 s.
3. Hexadimethrine 브 로마 이드 8 µ g/mL의 최종 농도에 셀을 추가 합니다.
   그러나 참고: Hexadimethrine 브 로마 이드 어떤 경우에는 셀에 대 한 독성이 있을 수 있습니다 변환 효율을 도움이 됩니다. 따라서, 변환 하기 전에 죽이 곡선을 수행 하 여 최적의 농도 결정 한다.
4. 부드럽게 혼합 하 판을 소용돌이 친다. 감염 (MOI)의 적당 한 복합성에 (0.5-2 x 10⁶ 입자) 사이 바이러스 성 입자의 적절 한 수량을 추가 하 고 부드럽게 30 대 판 소용돌이를 섞어 s.
5. 변환 효율을 높이 300 x g에서 45 분 RT에서 원심 분리기에서 셀 바이러스 성 입자 혼합 원심 37 ° C에서 셀 바이러스 성 입자 혼합물을 밤새 품 어.
6. 신중 하 게 바이러스 입자에 포함 된 매체를 제거 하 고 적절 하 게 삭제. 신선 하 고, 미리 데워 진 완전 한 문화 매체 바꿉니다.
7. 두 번째 날에 puromycin 선택 시작: 매체를 제거 하 고 신선한 매체 puromycin 섹션 4 (그림 3)에서 이전 결정의 정확한 농도 포함 하.
8. Puromycin 선택 후 세포를 수확 하 고 RNA는 RNA 키트 제조업체의 지침에 따라 격리를 사용 하 여 분리.
9. 선택 된으로 cDNA 합성을 수행 miRNAs 반전 녹음 방송을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조).
10. ¹³인용된 프로토콜 따라 정량 반응을 설정 합니다.

여기, 우리 호스트 셀 EVs의 상호 작용을 조사 하는 프로토콜을 설명 합니다. 붙일 레이블된 EVs의 글귀는 confocal 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 모니터링 됩니다. 그러나 내 피 세포 효율적으로 차지 EVs, EVs와 보육 시간 통풍 관을 추적 하기 위해 낙관 될 수 있다. 셀 내부 EVs의 더 나은 지역화, phalloidin와 말라 얼룩. 다음, 우리는 내 피 세포의 단층 성장 필터 멤브레인을 사용 합니다. Rhodamine B isothiocyanate-dextran 필터 멤브레인의 최고 약 실에 적용 하 고 내 피 단층의 침투성 바닥 챔버 (그림 2A)에 형광 dextran의 전송을 모니터링 하 여 측정 된다. 일반적으로, 내 피 세포의 침투성은 EVs (그림 2B)의 증가 금액으로 부 화에 따라 영향을 받습니다. 그들은 우물을 통해 단층, 그렇지 않으면 염료는 신속 하 게 확산을 형성할 것 이다 다는 것을 확인 하는 몇 일 동안 세포를 성장 하는 것이 중요 하다. 그것은 중요 한 것은 치료 없이는 dextran 것 이다 확산 천천히 셀 단층을 통해입니다.

MicroRNAs EVs의 핵심 구성 요소 받는 사람 세포를 전송 후, 그들은 유전자 발현 조절. 특히 miRNAs의 역할을 조사 하기 위해 받는 사람 셀 라인에 그들을 overexpress에 매우 유용 하다. 여기는 내 피 세포로 miRNAs transduce 하는 방법에 설명 합니다. 첫 번째 단계 puromycin 안정적 불리고 세포 (그림 4A)을 선택 하려면 내 피 세포를 죽이의 농도 결정 해 이루어져 있다. 마지막으로,는 miRNAs의 표현의 수준은 제어 하 고 정량 (그림 4B)에 의해 검증 될 수 있습니다.

그림 1: EVs는 내 피 세포에 의해 채택. 순화 EVs는 PKH67, 녹색에 내 피 세포의 단층으로 4 h incubated 표시 했다. 치료 되지 않는 내 피 세포는 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 씻은 후 광범위 한 언바운드 EVs를 제거 하려면, 셀 걸 (빨간색) 얼룩 phalloidin와 핵 (파란색) 얼룩 Hoechst 33342 스테인드 했다. 세포는 confocal 현미경 검사 법에 의해 관찰 되었다. 이미지는 레이저 confocal 현미경 및 63 x 1.3 나 오일 목표를 사용 하 여 촬영 했다. Hoechst 33342 405에 흥분은 nm와 배출 수집 450-470 nm (파랑); PKH67 488에 흥분은 nm, 505-530 nm (녹색); 수집 배출량 그리고 Phalloidin-594 543에서 흥분 nm, 배출량 620에서 수집 된 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 내 피 장벽에 EV 통풍 관의 효과. Dextran rhodamine 표시의 보급의 개략도 (A): 내 피 세포 성장 필터 멤브레인 위에 합류, 형광 dextran 상단 챔버에 적용 되 고 막 통해 시간이 지남에 확산. 침투성에 EVs의 효과입니다 상단 챔버에 EVs의 추가 후 아래쪽 챔버에 dextran의 보급의 속도 측정 하 여 평가 됩니다. EVs의 (B) 증가 금액 내 피 세포와 알을 품는. 시간이 지남에 트랜스-잘 막에 걸쳐 dextran rhodamine 표시의 전송 침투성 측정 할 수 있습니다. 침투성 내 피 계층에 걸쳐 50, 100 µ g/mL EVs의 외피의 2 h 후 크게 증가 된다. 데이터 3 실험에서 평균을 (± s.e.m.)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: puromycin의 적정. Puromycin (10mg/mL)의 재고 솔루션 10% 열 비활성화 (56 ° C, 30 분) 태아 송아지 혈 청, 2mm 글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 100 U/mL 페니실린/스 보충 RPMI 1640에 희석입니다. 15 µ L의 총 관 a.에 있는 매체의 10 mL에 추가 됩니다. 다음 튜브 A에서 솔루션의 7.5 mL 튜브 B. RPMI의 2.5 mL를 혼합 마지막으로, 희석의 100 µ L 7.5 µ L/mL, 5.62 µ L/mL의 최종 농도 게 셀의 100 µ L에 추가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: miR451a overexpressing 내 피 세포의 생성. 내 피 세포에 puromycin의 살인 곡선의 (A) 결정. 내 피 세포 puromycin 복용량을 증가 함께 알을 품을 했다. 생존은 MTS 분석 결과 72 h 후에 측정 됩니다. 데이터는 하나의 대표적인 실험의 평균을 (± s.e.m.)을 나타냅니다. (B) RNAs miR451a overexpressing 내 피 세포에서 파생 된 또는 부정적인 제어 수확 했다 그리고 miR451a 사본 실시간 PCR에 의해 공인 되었다. 정량 결과가 정부 유전자로 u 6을 사용 하 여 2 Ct 방법으로 정규화 하 고 (± s.e.m.) 의미를 표현 (n = 3 실험). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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