실험실 주택의 청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜

요약

실험실 주택 터키석 송사리 집 고 효율적으로 개별 물고기의 수천 고용 표준 zebrafish 시설에 사용 하는 동일한 인프라는 중앙 집중식된 물 여과 시스템에서 확장할 수 있습니다. 여기 우리가 유지 보수 효율적 송사리 수 있도록 표준화 된 절차의 목록을 자세하게.

초록

실험적인 목적을 위해 사용 하는 비 모델 실험실 물고기에서 농업 관행의 개발은 크게 혜택 참조 물고기의 설립에서 모델 시스템, 제 브라와 메 다카. 최근 몇 년 동안, 신흥 물고기-청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)-노화와 생태의 생물학의 분야에서 연구 그룹의 성장 수에 의해 채택 되었습니다. 4-8 개월의 포로 생활 스팬,이 종 감 금에서 발생 하는 shortest-lived 척추 이며 노화 속도와 수명이 변경으로 이어질 수 있는--짧은 시간에에서 테스트 실험 개입을 과학적으로 지역 사회를 수 있습니다. 이 종, 미 발달 diapause, 특징의 독특한 생물학 주어 폭발적인 성적 성숙, 표시 형태학과 행동 성적인이 형태 성-그리고 그들의 상대적으로 짧은 성인 수명- 임시 농업 관행은 긴급 수요입니다. 이 프로토콜 허용 최적의 청록색 송사리 실험실 관리, 강력한 실험실 동물 모델로이 종 채택 하 사회 과학을 사용 하는 주요 축산 측정값 집합을 보고 합니다.

서론

그들의 짧은 생애 경 간 및 빠른 라이프 사이클을 감안할 때, 청록색 송사리를 유망한 새로운 모델 유기 체 생물학^1,2,3로 급속 하 게 성장 하고있다. 이 종 한 teleost, 미 발달 diapause, 급속 한 성적인 성숙, 및 post-reproductive 수명 연장된 단계^4,5의 구성에 대 한 고유한 라이프 사이클에 의해 특징입니다. 최근 작품은 포로 야생^6,7에서이 종의 생물학 elucidating에 기여 했다. 청록색 송사리 짐바브웨, 모잠비크는 아프리카 사바나에 우기 동안 양식 계절 신선한 물 시체에 살고 있습니다. 건조 한 계절, 태아 건조 진흙 물 diapause 이라는 스트레스 저항 생활 단계 미 덕의 부재에 남아 있다.

이 종족에 대 한 유전자 지도 생성 된^8,9, 그리고 최근에 그들의 게놈 시퀀스 및 조립^10,11되었습니다. 여러 가지 타고 난된 실험실 물고기 종자를 개발 하 고 transgenesis 및 CRISPR/Cas9를 통해 편집 하는 게놈이이 종, 사실상 경쟁 실험실 척추 모델 유기 체 ^{로 청록색 송사리를 홍보에 제공 되 12,,1314}.

실험실 프로토콜 이미이 종¹⁵게시 되었습니다, 비록 현재 프로토콜에서 우리 개발 특히 노화 및 생존을 조사 연구 목적으로 실험 실험실 지침의 포괄적인 목록. 현재 프로토콜 연구원은 제 브라와 메 다카 축산에 이미 익숙한 키 조정의 최소 수를 채택 하 여 청록색 송사리 축산에 조예가 될 수 있습니다. 동시에이 프로토콜 번성 청록색 송사리 식민지를 필수 도구로 생선 농업에 사전 경험 없이 연구를 제공 합니다.

프로토콜

물고기는 물 재순환 시스템에서 28 ° C에서 발생 하는 (물 매개 변수 참조), 10-20% 일일 물 처리와. 3 다른 탱크 크기 권장: 0.8 L, 2.8 L, 그리고 9.5 l. 각 탱크는 2 mL/s의 지속적인 물 흐름을 받습니다.

1. 시 약 준비 (재료에 포함 되지 않음)

참고: 아프리카 터키석 송사리 (Nothobranchius furzeri) 설립된 연구소 주식에서 제공 될 수 있습니다. 연례 송사리 건조 방지 배아 우편으로 발송 될 수 있다. 8-30 ° C의 온도 범위 내에서 배아를 우주선에 중요 하다.

1. 물 1 g/L humic 산 시스템에 용 해 하 여 humic 산 (부 화) 솔루션을 준비 합니다. 오토 클레이 브 그리고 최대 10 주 동안 4 ° C에서 저장소.
2. HUFA Artemia 농축 준비, HUFA 농축 소금물 새우 솔루션의 농도 500 µ L/L에서 매일 소금물 새우 hatcher를 추가 합니다.
3. Methylene 청색 이전 압력가 시스템 물에서 재고 솔루션의 100 µ L/L를 용 해 하 여 메 틸 렌 블루 솔루션을 준비 합니다. Methylene 청색 빛에 민감한 때문에, 어두운 병에 솔루션을 유지 또는 호 일 커버. 실시간에 저장소
4. 태아 부 화에 대 한 고체 기판으로 코코넛 섬유를 준비 합니다. 또는 사용 하는 필터 종이 (섹션 1.5 참조).
   1. 증류수와 presoak 코코넛 섬유입니다. 오토 클레이 브 그리고 5 주까지 4 ° C에서 저장소.
   2. 배아 전송의 날, 촉촉한 코코넛 섬유와 페 트리 접시를 준비 합니다.
   3. 코코넛 섬유 연기 후드와 불꽃, 효 모와 박테리아에 의해 오염 줄이기 위해 옆으로 직경 90 mm 페 트리 접시를 채우십시오.
   4. 살 균 티슈로 1 ㎝의 높이에 코코넛 섬유를 압축. 시키는 초과 물을 흡수 하는 종이 접시 위에 종이 수건을 눌러 코코넛 섬유에서 수 분의 대부분을 제거 합니다. 프레임, 금속 숟가락을 열 고 코코넛 섬유의 전체 표면에 아래로 누릅니다. 이 코코넛 섬유 곰 팡 이/세균 오염을 방지합니다.
5. 태아 부 화에 대 한 고체 기판으로 필터 종이 준비 합니다.
   1. 배아 전송의 날, 90 mm 페 트리 접시에 맞는 필터 종이 디스크의 3 레이어를 놓습니다. 습도 유지 humic 산 솔루션의 5 mL를 추가 합니다.

2입니다. 번 식

1. 청록색 송사리 스트레인 유지 보수에 대 한 번 식
   참고:이 프로토콜에 따라 성적 성숙에 도달입니다 ~ 4 주에 7-9 주 사이 후 해칭 및 통치 봉우리. 통치 주파수 및 식품 품질; 먹이에 따라 하는 것이 중요 따라서, 탱크 사육 당 하루 두 개 이상 feedings는 것이 좋습니다 배아 수율 (참조 섹션 5.6.) 인상
   1. 9.5 L 사육 탱크 설치. 시스템 물으로를 한 남자와 두 여성 물고기를 추가할 수 있습니다.
   2. 남성 아프리카 터키석 송사리 표시는 여성의 성희롱으로 이어질 수도, 짝짓기 하는 동안 지배 짝짓기 스트레스를 줄이고 생식 출력 향상을 여성 보다 약간 작은 신체 크기를 가진 남성을 선택 합니다. 6/7 주 된 암컷과 5 주 된 남성을 설정 합니다.
   3. ~ 2-3 cm의 최종 깊이 도달 하는 압력가 모래 플라스틱 용기 (10 x 10 x 5 cm)를 번 식 탱크의 중심에 모래 상자를 배치.
   4. 터키석 송사리 지속적으로 번 식 하 고 수확 배아 배아 부 화에 대 한에 일주일에 한 번 보자.
      참고: 모래 기판의 사용 중앙 집중식된 여과 시스템에 도전 포즈 하 고 나중에 다른 방법으로 대체 한다. 가능한 대안 zebrafish 사육 탱크의 사용 될 수 있습니다.
2. Transgenesis에 대 한 번 식
   참고: 배아 주사에 사용할 1-셀-단계에서 동기화 하 고이에서는 그들은 수정 직후 수집.
   1. 주입 및 유전자 변형 라인의 세대에 대 한 사용 하 여 한 셀 단계 배아를 수확, 한 남자와 두 여성 물고기 (2.1와 같은.) 번 식 탱크를 설정 합니다.
   2. 2 일 전에 배아 컬렉션, 개별 탱크에서 남성 분리 하 고 성인 여성와 남성 시각적 접촉에서 유지.
   3. 컬렉션의 날, 사육 탱크에 남성과 모래 상자를 추가 하 고 2 시간에 대 한 산란 그들.

3. 배아 축산

1. 배아 컬렉션
   참고: 배아 컬렉션 체질 및 모래 상자에서 배아를 수확 하 여 수행 됩니다. 정상적인 조건 하에서 각 모래 상자 30에서 200 배아에 있어야 합니다.
   1. 컬렉션의 날, 번 식 탱크에서 모래 상자를 제거 합니다. 스 트레이너 (~0.9 m m 변형 크기)으로 모래 상자를 비어와 시스템 물으로 린스. 이것은 압력가 마로 소독에 대 한 모래를 수집 하는 큰 탱크를 통해 행 해질 수 있다.
   2. 부분적으로 시스템 물에서 여과기 잠수함 그리고 부드럽게, 배아는 센터에서 그룹화 시키는 소용돌이.
   3. 10 mL 피 펫 파스퇴르와 배아를 수집 합니다.
   4. 90 mm 페 트리 접시 시스템 물 40 mL에 배아를 전송 합니다.
   5. 빛 stereomicroscope에서 페 트리 접시에 배아를 검사 하 고 그 파열된 chorion 및 손상의 징후를 제거.
   6. 배아 표백직접 진행 합니다.
      참고: 항상 잠재적인 크로스-스트레인 배아 오염을 방지 하기 위하여 물고기 스트레인 당 한 여과기를 사용 합니다.
2. 표백 하는 태아
   참고: 배아 표백 미생물 오염 부 화 미디어에서 물고기 탱크에 존재를 방지할 수 있습니다.
   1. 표백, 이전 일회용 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 수집 된 배아를 포함 하는 배양 접시에서 시스템 물 제거.
   2. 방지 하려면 원치 않는 곰 팡이 및 세균 성장, 수집 된 배아를 갓된 H₂O₂ (압력가 마로 소독 시스템 물에 1 %v / v) 50 mL를 추가 합니다.
   3. 50 mL 해결책에 90 mm 페 트리 접시에서 낮은 속도로 5 분에 대 한 배아를 흔들어.
   4. H₂O₂ 솔루션 일회용 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 세 번의 메 틸 렌 블루 솔루션 50 mL와 함께 5 분 대 한 배아를 씻어. 메 틸 렌 블루 솔루션을 제거 합니다.
   5. 배아를 H₂O₂ (압력가 마로 소독 시스템 물에 1 %v / v) 50 mL를 추가 하 고 5 분 동안 흔들어.
   6. H₂O₂ 솔루션을 제거 하 고 세 번 50 mL 메 틸 렌 블루 솔루션 5 분 동안 세척.
   7. 동기 배아 개발, 90 mm 페 트리 접시에 메 틸 렌 블루 용액 40 mL 당 100 배아의 최대 밀도 증가에 28 ° C에 태아를 품 어.
      참고: 표백 솔루션에서 태아 외피를 확장 하지 않습니다. 이 계란 chorion에 손상을 하 고 태아 사망률을 증가 시킬 수 있습니다. 배아 표백 변경된 chorion 생리학 및 부 화 성공 귀 착될 수 있는 계란 chorion에 주요 물리 화학 변화를 일으킬 수 있습니다.
3. Methylene 청색에서 태아 외피
   참고: 메 틸 렌 블루 용액에 액체 화 기생충의 성장을 방지 하 고 죽은 태아 및 unfertilized 계란의 탐지를 가능 하 게.
   1. 라이브 건강 한 배아의 생존에 영향을 주는 곰 팡이 및 세균 오염을 방지 하기 위해 페 트리 접시에서 (메 틸 렌 블루 블루 스테인드) 모든 죽은 태아를 제거 incubated 배아를 검사 합니다.
   2. 오래 된 메 틸 렌 블루 솔루션을 제거 하 고 신선한 솔루션으로 대체.
   3. 28 ° C 인큐베이터 (그림 1A)를 페 트리 접시를 반환 합니다. 7-10 일 안에, 개발된 배아 보이는 검은 눈을 보여 확인 하십시오. 코코넛 섬유 또는 필터 종이 고체 기판 매체 (그림 1B)에 이러한 배아를 전송.
   4. Methylene 청색에 미 개발된 태아를 유지, 매일 모니터링 하 고 일단 검은 눈을 개발 고체 기판 매체에 전송.
   5. 반복 단계 3.3.1-3.3.3 매일 배아 검은 눈을 볼 수 있다.
      참고: 메 틸 렌 블루에 배아의 지속적인 노출 성인 물고기 생리학에 장기적인 변화 유도 수 있습니다.
4. 필터 종이 배아 전송
   참고: 청록색 송사리 배아는 자연 조건 업과 건조 기판에 개발할 수 있습니다. 또한, 건조 태아 외피 배아를 동기화 하 여 같은 날에 그들을 해치는 연구 가능 합니다.
   1. 개발된 태아 7-10 일 이내 검은 눈을 볼 수 있을 것 이다로 이전 준비 필터 종이 접시에 메 틸 렌 블루 솔루션에서 배아를 전송 일회용 파스퇴르 피 펫 또는 정밀한 곡선된 핀셋을 사용 합니다.
   2. 집게, 최대 90 m m 플레이트 (그림 1B) 당 100 배아와 태아 ~ 5 m m 떨어져 확산.
   3. 페 트리 접시 parafilm으로 밀봉.
   4. 2-3 주, 그들은 완전히 황금 홍 채를 개발 하 고 (그림 1C)을 부 화에 대 한 준비가 될 때까지 28 ° C에 태아를 품 어.
      참고:로 그들의 생존 능력을 극적으로 감소 될 것 이다 2 주에 이상에 대 한 준비-해치 배아의 부 화를 연장 하지 않습니다.
5. 코코넛 섬유를 배아 전송
   참고: 압력가 마로 소독, 살 균 코코넛 섬유 (또는 유기 물 이끼) 사용할 수 있습니다 유효한 대안 매체로 서 고체 기판 부 화에 대 한.
   1. 준비-사용 코코넛 섬유 접시에 메 틸 렌 블루 솔루션에서 배아를 전송 하는 일회용 파스퇴르 피 펫 또는 정밀한 곡선된 핀셋을 사용 합니다.
   2. 태아 ~ 5 m m 간격, 90 m m 플레이트 (그림 1B) 당 100 배아까지 확산.
   3. 페 트리 접시 parafilm으로 밀봉.
   4. 2-3 주, 그들은 완전히 황금 홍 채 ( 그림 1C)에 예를 들면 개발 될 때까지 28 ° C에 태아를 품 어.
      참고: 장기 저장 (최대 1 년)에 대 한 전송 3 일 게시물 컬렉션에서 배아 메 틸 렌 블루 솔루션에서 17 ° c.에 고체 기판 접시에 그들은 검은 눈을 개발할 때까지 태아를 품 어.

4. 부 화 청록색 송사리

참고: 청록색 송사리 배아 수 수 성공적으로 부 화 humic 산 성 솔루션¹⁴에.

1. 정밀한 곡선된 핀셋을 사용 하 여, 전송 신중 하 게 50-100 4 ° c.에 humic 산 성 솔루션으로 가득 부 화 상자에 배아 개발 시스템 물에 1 g/L humic 산 humic 산 성 해결책에 의하여 이루어져 있다. 오토 클레이 브 그리고 최대 10 주 동안 4 ° C에서 저장소. 모든 배아 완전히 몰입 하는 것을 확인 하십시오. Humic 산 성 솔루션은 얕은, 하지 2cm 보다 깊은 해야 합니다.
   참고: humic 산 성 솔루션의 낮은 온도 향상 부 화 하며 솔루션에 배아의 완전 한 침수 동기화 된 해칭
2. 28 ° C 해칭 부 화기로 부 화 상자를 놓습니다. 커버 뚜껑 부 화 상자. 공급 하기 위해 충분 한 통 기 통풍, 공기 공급 배관에 의해 부 화 상자를 연결 합니다.
   참고:는 인큐베이션 기간 동안 충분 한 통 기 통풍 가스 방광을 채울 수 없는 튀김의 높은 비율에 있는 결과 ("배꼽-슬라이더" 표현 형, 섹션 5.1에서에서 참고)
3. 해칭, 후 일에서 부 화 상자에서 적절 한 수 질을 유지 하기 위해 추가 압력가 시스템 물 1: 1의 비율에 하루에 한 번 2 cm의 최종 깊이 유지.
4. 단단한 기판에 다시 깐된 배아를 전송 하 고 일주일 후 부 화 시도.
   참고: 해칭, 청록색 송사리는 쉽게 이해 하 고 살아있는 음식을 섭취. 최적의 성장에 대 한 초과 갓 부 화 소금물 새우 (Artemia 살 리 나) 하루에 두번 튀김 먹이. 전체 포만의 표시는 각 먹이의 10-15 분 후 프라이의 오렌지 색 인체를 이다. 초과, 먹지 고 분해 소금물 새우 매일 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 밖으로 사이 펀.

5. 청소년 및 성인 물고기를 양육

1. 5 일 후 부 화, 청소년 물 재순환 시스템으로 이동 합니다. 일회용 플라스틱 펫 (또는 플라스틱 숟가락), 신중 하 게 사용 하 여 0.8 L 탱크 400 µ m 프라이 스크린 (그림 2) 당 전송 5 청소년.
   참고: 그것은 그 청소년 송사리의 일부 것입니다 없습니다 가득 가스 방광, 결과 전형적인 "배꼽-슬라이더" 표현 형, 물고기 하지 적절 한 부 력 도달, 지속적으로 수영, 강제에 의해 특징에 심한 기형 발생에 성인 물고기입니다. 이 물고기 생존 분석 실험 또는 효율적인 번 식에 대 한 사용할 수 없습니다 하 고 검열 될 필요가 있다.
2. 14 일 후 부 화까지 하루에 두 번 청소년 초과에서 갓 부 화 소금물 새우 먹이. 매일 파편 각 탱크의 바닥에서 밖으로 사이 펀.
3. 나이의 14 일, 2.8 L 탱크 전송 청소년 물고기는 850 µ m 프라이 화면을 갖추고 있습니다. 이 시점에서 앞으로, 각 탱크 물고기 id 레이블, 날짜, 스트레인, 물고기 성별 정보와 물고기 식별 번호 (그림 3) 해치를 나타내는. 생존 분석, 이후이 시점에서 단일 탱크에서 각 물고기를 집 개별적으로.
4. 다음 7 일 동안 하루에 두 번 청소년 ~ 2 mL 당 물고기 소금물 새우의 먹이. 이 단계에서 물고기 1-3 라이브 혈액 벌레로 보완 될 수 있습니다 (혈액 벌레 애벌레는 물고기에 대 한 너무 큰 경우에, 빨리 그들을 면도날으로 작은 조각으로). 수 질 악화를 방지 하기 위해, 먹지 않는 음식 및 주 당 두번 추가 낭비 밖으로 사이 펀.
5. 3 주 후 부 화에서 탱크의 뒤쪽에서 프라이 화면을 제거 하 고 두 번 1 ~ 2 mL 혈액 벌레의 0.5 mL 및 소금물 새우의 각 물고기에 게 먹이를 시작. 이 단계에서 청소년 신체 크기에 1 cm에 도달 한다 고 전체 크기 혈액 벌레를 섭취 할 수 있어야.
6. 나이의 4 주 ~ 2 mL 소금물 새우 그리고 혈액 벌레의 1 mL와 함께 하루에 두 번 각 물고기를 먹이. 여성 공동 2.8 L 탱크 당 최대 3 암컷의 밀도에서 지 내게 될 수 있습니다.
7. 이 단계에서 물고기 완전 한 성적 성숙에 도달 하는지 확인 합니다. 남성에서 착 색의 징후와 큰 항문 지 느 러 미, 꼬리 지 느 러 미의 존재에 대 한 확인 하 고 인체 전체 여성에서 계란의 라운드.
   참고: 생존 코 호트 연구에 대 한 개별 탱크에 성인 물고기를 제기 수 있습니다 부정적인 영향을 물고기 동작 및 건강. 그러나, 생존 코 호트 연구 그룹 주택 엄격한 사회 계층으로 이어지는 사회 지배와 남성 영토의 설립으로 인해 상당한 혼란 요소를 추가 합니다.

6. 먹이

참고: 실험실 청록색 송사리 아기 소금물 새우 (Artemia 살 nauplii)와 혈액 벌레 (Chironomus 종 애벌레) 먹이 수 있습니다. 청록색 송사리 프라이 아기 소금물 새우 독점적으로 먹인 다. 청소년 및 성인 물고기는 하루에 두 번 먹인 다 소금물 새우와 피 웜 (그림 2). 이상적으로,이 프로토콜에 표시 2 feedings를 초과 물고기 하루에도 여러 번 먹 일 수 있다.

1. 소금물 새우 경작
   1. 소금물 새우 hatcher를 역삼 투 (RO) 물과 홍 해 소금의 350 g 10 L을 추가 하 고 통 기 통풍 관을 가진 폭 기에 의해 해산.
   2. 고도의 불포화 지방산 (HUFA)의 5 mL와 함께 문화를 풍요롭게.
   3. 해칭 솔루션에 소금물 새우 낭종의 20 g을 추가 합니다. 소금물 새우 낭종 물 표면에 플 로트 및 적절 한 산소와 문화의 보장 하지 않는 검사 합니다.
      참고: 건조 소금물 새우 낭종의 매일 aliquots은 4 ° c.에 저장 될 수 있다
   4. 다음 날 오후에 HUFA의 5 mL의 다른 약 수와 문화를 제공 합니다.
2. 빗금된 소금물 새우 수확
   참고: 시작 문화에서 ~ 36 h, 후 소금물 새우 (탈피 II 단계) 수확 준비 되어 있다.
   1. 문화는 hatcher의 하단에 탭을 사용 하 여 컨테이너에서 5 패를 수집 하 고 10 분 동안 앉아 보자.
   2. 10 분 후 5 L 컨테이너의 상단에서 소금물 새우 껍질 (갈색)을 제거 하 고 필터 메쉬를 통해 부 화 소금물 새우 (오렌지 색상). 비 부 화 계란과 소금물 새우 죽은 포함 된 컨테이너의 하단에서 발견 하는 앙금을 제외에 주의.
   3. 린스로 물과 소금물 새우 2 L 용기에 부 화 하 고 10 분 동안 앉아 보자.
   4. 10 분 후 소금물 새우는 메쉬를 통해 다시 필터링 하 고로 물 2 L에 수집 합니다.
   5. 이전 3 단계를 반복 하 여 소금물 새우 솔루션 비 부 화 cysts 및 소금물 새우 껍질에서 자유롭다.
   6. 먹이 대 한 짜기 병에 소금물 새우 2 L 컨테이너에서 전송.
      상당히 강력 하 고 신뢰할 수 있는 참고:는 소금물 새우 경작입니다. 그러나, 실패 해칭 경우 소금물 새우의 부족을 피하기 위해, 더 작은 (500 mL) 백업 hatchers 사용할 수 있습니다.
3. 백업 hatcher를 설정
   1. 폭 기에 의해 홍 해로 물 500ml에 소금의 17.5 g을 분해.
   2. 500 µ L HUFA의 문화를 풍요롭게.
   3. 소금물 새우 낭종의 2 세대를 추가 합니다.
   4. 후 18-24 h, HUFA의 500 µ L로 한 번 더 문화를 제공 합니다.
      참고: 소금물 새우 ~ 24 h 후 수확 준비가 되어 있다.
4. 라이브 혈액 벌레의 준비
   1. 수 유 직전로 물을 사용 하 여 거르는 통해 혈액 벌레의 적절 한 금액을 필터링 합니다.
      참고: 라이브 혈액 벌레 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 7-10 일.
   2. 혈액 벌레로 물의 소량으로 플라스틱 용기에 씻어.
   3. 플라스틱 파스퇴르와 함께 피 펫 (좁은 팁 제거), 먹이 대 한 혈액 벌레 혼합물을 차지 합니다.
      참고: 취소 제어 소스에서 라이브 음식 식민지 실험실 송사리를 먹이 기생충과 잠재적으로 병원 성 미생물 지역 사회에서 외부 오염에 대 한 위험을 추가 합니다. 미래에 ad hoc 메 마른 물고기 피드 개발 되어야 한다.

7. 송사리 실험실 긴장 유전형

참고: 뿐만 각 변형 내에서 섹스를 결정 하기 위해 청록색 송사리 긴장 사이 구별을 특정 유전자 (microsatellite) 마커 사용된⁹ (표 1)를 하실 수 있습니다.

1. 샘플링
   1. 젖은 스폰지 위에 그물에 물고기를 안전 하 게 잡으십시오.
   2. 면봉 면봉을 사용 하 여 꼬리 지 느 러 미에는 operculum에서 물고기 시체에서 2-3 비늘.
   3. 면봉에서 비늘을 선택 하 고 2-3 척도 NaOH 솔루션을 포함 하는 1 mL 튜브에 전송 (200 µ L 0.5 mol/L NaOH, 1% β-Mercaptoethanol, 및 0.5% 폴 리 비닐 pyrrolidone).
   4. 15에 대 한 PCR 튜브를 회전 척도 NaOH 솔루션에 완전히 몰입 하는 것을 확인 하는 s.
2. 게놈 DNA 분리
   1. 95 ° c.에 20 분에 대 한 샘플을 품 어
   2. RT에서 쿨, 1의 1/10 볼륨 샘플 중화 M Tris HCl, pH 8.0.
   3. 최고 속도로 5 분에 대 한 샘플 원심

8. 물 매개 변수

참고: 유기 체 그 용도 성인 형질의 축산 대상 종의 수명에 걸쳐 매우 안정적인 축산 조건을 필요 합니다. 따라서, 청록색 송사리 같은 물 유기 체를 경작 물 매개 변수의 엄격한 관리를 필요로 합니다. 물 재순환, 추가 4 단계 여과 물, 물 매개 변수, 모든 탱크를 제공 하는 시간이 지남에 같은 물 조건 제어를 달성 하기 위해 강력한 기초를 보장 합니다. 시스템 물 역 삼 투 (RO) 물, 상업 해양 소금, 중 탄산 나트륨 추가에서 다시 구성 하는 것이 좋습니다.

1. 물 순환 시스템 체계: 첫째, 물고기에서 폐수를 모든 유엔 먹는 음식 파편 및 큰 입자는 고체 입자 금속 필터를 통해 흐름 탱크. 금속 필터는 일주일에 세 번; 씻어 서 둘째, 다음 첫 번째 기계적 여과, 물 큰 집 수에서 전달 이며 다음 펌핑 바이오 필터, 어디 박테리아 변환할 암모니아 아 질산염과 질산염; 셋째, 바이오 필터에서 물 25 µ m 필터 슬리브, 미세한 크기 입자 트랩에 양수 된다. 마지막으로, 물 박테리아 및 바이러스 로부터 물을 소독 하는 자외선 (UV) 램프를 통해 흐른다. 다음 4 단계, 필터링 된 물 물고기 탱크를 반환합니다.
2. 탱크에서 미생물 성장을 감소, 질산염의 축적을 방지 하 고 감소를 전반적으로 염 분, 시스템의 10-20%는 매일 삭제 됩니다.
3. 28 ° C, 7.0-7.5 범위 내 물 pH 상수에서 물 온도 상수를 유지 합니다.
4. 송사리는 다양 일 분을 용납, 비록을 피하기 위해 oodinosis, 전도도 범위 650-710 마이크로 지멘스 내에서 유지 합니다. 1 년 동안 12 h 명암 주기 식민지 건강과 생산성을 보장합니다.
   참고: 송사리 물 전도도 1500 마이크로-지멘스까지 허용할 수 있습니다.

결과

청록색 송사리 적절 한 농업 메디아 생존 GRZ 변형 (예: 그림 4A)에 12-18 주 사이에 발생 합니다. 메디아 생존의 다이어트, 주파수, 수 유 및 주택 온도 조건에 따라 달라 집니다. 불 쌍 한 축산 결과 제시 하는 생존 곡선에서 초기 사망률 및 반복, 갑자기 여러 굴절 포인트 (그림 4B) 특징, 시간에 걸쳐 생존의 증가.

그림 1: 각 인큐베이션 기판 대표 배아 발달 단계. (A) 갓 배아, 28 ° c.에 인큐베이터에서 메 틸 렌 블루 솔루션에서 incubated 수집 (B) 고체 매체를 전송할 준비가 배아 중 종이 또는 코코넛 섬유 필터. (C) 배아 준비가 해치 할 일반적인 황금 홍 채를 표시 합니다. 눈금 막대는 1 mm.에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 청록색 송사리 후 부 화 개발의 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 3 단계 이후에서 물고기에 대 한 대표적인 물고기 ID 태그. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 70 남성 청록색 송사리에 대 한 대표적인 생존 곡선. (A) 실험실 제기 청록색 송사리에 대 한 일반적인 생존 곡선. (B) 생존 곡선의 비교는 최적의 농업 조건 (블랙)에서 발생 하는 물고기에서 얻은 고 가난한 농업 (빨간색과 파란색). 수평 빨간색 파선 50% 생존, 평균 수명 (x 축에 표시)에 교차 생존 곡선을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

ID	앞으로 뇌관		반전 뇌관		크기 범위 (bp)
* NfuSU0007	GGCTAAGCCTTGCTGACAGA		CAGGGAGCTGAAAACCTCAG		166-214
* NfuSU0010	CGCAGTCTGATCAAATCGTGT		TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC		220-272
NfuSU0016	CATGGCTAAACCGTGATGAA		GAAGGACGCCAGCTATGAAG		209-240
NfuSU0022	AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA		TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT		198-238
NfuSU0027	TCCAGCTGAATCGGTAATGA		AAACTCGAGGGTGCAATCTG		164-226
NfuSU0049	CTGGACAAAGTGCCAATCAC		CTCCCACAGTCCCAAAACAT		196-197
NfuSU0050	CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA		GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG		252-295
NfuSU0060	CTAGCCACTCCCCTGGTTTA		CCGTCACGATGTGCTGATAC		216-248
NfuFLI0030	CAGAAGCTAAAGGCCAGACG		GGGAAACAATAGGGAACCAC		174-205
* NfuFLI0091	ACGCTGACTCTACCCAGTC		CTGCCTGCTACTGACAATG		355-373
*-섹스 결정 마커

표 1: 스트레인 식별 유전형 뇌관입니다.

토론

우리 실험실 청록색 송사리, 성인 물고기 주택 뿐만 아니라 태아 컬렉션, 부 화, 등의 재배에 대 한 프로토콜을 설명, 사육 및 먹이. 우리의 프로토콜 노화와 수명에 대 한 실험 연구에 대 한 특히 성인 물고기에 초점을 맞춘 연구 실험실을 구체적으로 타겟팅 됩니다. 청록색 송사리 표준 zebrafish 시설;에 올려질 수 있다 그러나, 송사리 농업의 중요 한 측면에서 표준 zebrafish 케어¹⁶다. 이러한 배아 부 화, 액체와 건조 부 화 단계 구성의 특정 단계 뿐 아니라 단백질이 풍부한 혈액 벌레, 보충 다이어트 소금물 새우만 다이어트에서 초기 전환 포함 됩니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계 8-30 ° C의 온도 범위 내에서 운송 배아를 포함합니다. 번 식, 경우 통치 주파수 및 식품 품질; 먹이에 따라 달라 집니다. 따라서, 배아 수율 (참조 섹션 5.6.) 인상 탱크 사육 당 하루 두 개 이상 feedings를 좋습니다. 태아는 표백, 동안 표백 솔루션에서 태아 외피를 확장 하지 않습니다. 이 계란 chorion 및 증가 태아 사망률에 손상을 일으킬 수 있습니다. 메 틸 렌 블루와 배아를 배양 할 때로 그들의 생존 능력을 극적으로 감소 될 것 이다 2 주에 이상에 대 한 준비-해치 배아의 부 화를 연장 하지 마십시오. 청록색 송사리를 부 화, 대 한 humic 산 성 솔루션의 낮은 온도 향상 부 화 하며 솔루션에 배아의 완전 한 침수 동기화 된 해칭 가스 방광을 채울 수 없는 튀김의 높은 가격에 부 화 결과 동안 충분 한 통 기 통풍 ("배꼽-슬라이더" 표현 형, 섹션 5.1 참조 하십시오).

번 식에 대 한 프로토콜의 한계는 포즈에 여과 시스템을 중앙 집중식 도전과 미래에 다른 방법으로 대체 한다 모래 기판의 사용을 포함. 가능한 대안 zebrafish 사육 탱크의 사용 될 수 있습니다. 배아 표백 변경된 chorion 생리학 및 부 화 성공 귀 착될 수 있는 계란 chorion에 주요 물리 화학 변화를 일으킬 수 있습니다. Methylene 청색에 배아의 지속적인 노출 성인 물고기 생리학에 장기적인 변화 유도 수 있습니다. 성인 물고기 생존 코 호트 연구에 대 한 개별 탱크에서 높이 생선 행동과 건강을 부정적인 영향을 수 있습니다. 그러나, 생존 코 호트 연구 그룹 주택 엄격한 사회 계층으로 이어지는 사회 지배와 남성 영토의 설립으로 인해 상당한 혼란 요소를 추가 합니다. 따라서, 우리는 생존 연구에 대 한 남성 생선의 절연은 합리적인 타협 판단. 취소 제어 소스에서 라이브 음식 먹이 실험실 송사리 식민지는 기생충과 잠재적으로 병원 성 미생물 지역 사회에서 외부 오염에 대 한 위험을 추가합니다. 미래에 ad hoc 메 마른 물고기 피드 개발 되어야 한다.

이 프로토콜에 미래 개선 여전히 3-4 주 이내 성적 성숙 완료 리드 제어, 비-라이브 다이어트에 집중할 것 이다. 요약 하자면, 우리의 프로토콜 넓은 과학계에 청록색 송사리 실험실 경작에 대 한 접근을 제공 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
프로브 교정 버퍼 용액 pH=7.0	Roth	A518.1	1L 버퍼 용액 pH=7.0 용수 시스템 pH 전극 교정을 위한
프로브 교정 버퍼 용액 pH=4.0	Roth	P712.1	1L 버퍼 용액 pH=4.0 용수 시스템 pH-전극
교정 전도도 표준	VWR	83607.260	500 mL 용수 시스템 교정을 위한 전도도 표준 1,413 uS/cm 전도도 전극
Easy Strips Test 6in1	JBL	2533900	시스템 물의 염소 값 측정을 위한 테스트
스트립 암모니아 테스트	JBL	2536500	시스템 물의 암모니아 함량을 결정하기 위한 테스트
홍해 소금	홍해		22kg 양동이
산수소나트륨	VWR	27780.360
부식산	시그마- Aldrich	53680-50G
새로운 HUFA Artemia 농축	ZM Systems UK		75g 병
메틸렌 블루	Roth	AE64.1
과산화수소 용액	Sigma- Aldrich	31642-1L	30% (w/w)
코코넛 섬유	Dragon	ZCS010
Whatman 종이	GE 헬스케어	3030-690
에탄올 순수	VWR	20821.467	100%
실리카 모래	현지 애완 동물 가게
Artemia Eggs 프리미엄 등급	샌더스
Bloodworm	현지 유통업체		Poseidon Aquakultur 독일
dNTP 솔루션 믹스	Biolabs	N04472	10mM
Taq DNA 중합효소	Invitrogen	18038-042	5U/열
PCR 10x 버퍼	Invitrogen	18038-042
MgCl2	Invitrogen	18038-042	50mM
NaOH	시그마- Aldrich	S8045-500g	50mM
Tris-HCl, pH=8.0 용액	Sigma- Aldrich	T2694-1L	1M
HCl 37%	Sigma- Aldrich	H1758-500mL
어항	Aquaneering		용량: 0.8L, 2.8L, 9.5L; 배플, 튀김 메시 및 뚜껑 장착
Orbital shaker	VWR	89032-100	모델 5000
미생물 인큐베이터	Thermo Scientific, Heratherm	50125882	모델 IMC18; 액체 상태에서의 저장 배아의 경우, t=27-28°deg로 설정; C
냉각 인큐베이터	바인더	9020-0209	모델 KT115; 고체상의 저장 배아의 경우 t = 27-28 °C로 설정; C
부화 인큐베이터	Thermo Scientific, Heratherm	51028114	모델 OGS180; 배아 부화의 경우 t = 27-28 °로 설정; C
실체 현미경	Leica		모델 M80
번식 모래 / 부화 상자	Roth	1598.1	1000mL
페트리 접시	Sarstedt	82.1473	92x16mm
50 mL 원추형 튜브	Sarstedt	62.547.254
15 mL 원뿔형 튜브	Sarstedt	62.554.002
일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫	로스	EA71.1	2mL; 벌레로 물고기를 먹이거나 배아를 선택하는 경우 팁을 잘라 직경 3-4mm의
혈청학 피펫	Sarstedt	86.1689.001	50mL
주사기	Henke Sass Wolf	4100-000V0	10mL
금속 여과기			섬도 < 1 밀리미터 ; 배아 수집용
핀셋	Dumont	0508-5/45-PO	type5/45; 배아 이식용
25 L 염수 새우 부화기	Aquaneering	ZHBS25	메인 부화기
500 mL 염수 새우 부화기	JBL	6106100	모델 Artemio 1; 백업 부화기
좁은 메쉬 어망	JBL
모래 비커	VWR	BURK7102-5000	5000mL
소금물 새우 분리 비커	VWR	BURK7102-2000	2000mL
플라스틱 지퍼 백	Roth	P279.2	죽은 물고기 보관
Pipetboy	Integra	155000	모델 Pipetboy acu2
Parafilm	P-Lab	P701605
에어 튜빙	www.zajac.de	AQ380	4-6mm 직경
1L 유리병	VWR	215-1595
2 L 유리병	VWR	215-1596
500 mL 스퀴즈 병	Roth	K665.1	소금물 새우로 물고기 먹이기
120-μ m 소금물 새우 여과기	플로리다 아쿠아 팜	BB-PC2	소금물 새우/벌레 수집용
마감 필터 양말	Aquaneering	MFVB025C	25-μ m
중앙 여과 어류 하우징 시스템			Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz