방법 논문

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

11.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57077

⸱

2018년 5월 24일

 ,  , 
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine, Washington State University

이 논문에서

요약

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

초록

초파리 melanogaster 의 병원 성 감염 시 hemocytes 감염을 통해 면역 반응에 중요 한 역할을 재생합니다. 따라서,이 프로토콜의 목표, 즉 hemocytes의 특정 면역에 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 개발 하는 것입니다. 여기, 3 × 10에 제시 된 방법을 사용 하 여6 라이브 hemocytes ex vivo 감염에 대 일 분에서 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 얻을 수 있습니다. 또는, hemocytes는 감염 된 vivo에서 구명 hemocyte 추출에 의해 감염 된 후 24 시간에 3rd 탈피 애벌레의 주사를 통해 하실 수 있습니다. 이러한 감염된 1 차 셀 고정, 스테인드, 고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 그럼, 3D 표현 병원 체 침입을 결정적으로 보여 이미지에서 생성 되었습니다. 또한, qRT-PCR에 대 한 높은-품질 RNA 병원 체 mRNA 다음의 탐지를 위해 얻어질 수 있다 감염, 그리고 충분 한 단백질 서쪽 오 점 분석에 대 한 이러한 셀에서 추출할 수 있습니다. 함께 찍은, 우리 병원 체 침입의 확실 한 조정 및 세균성과 바이러스 성 병원 체 종류와 hemocyte 추출 위한 효율적인 방법 초파리 에서 충분 한 라이브 hemocytes를 사용 하 여 감염의 확인 하는 방법 제시 vivo ex vivo에서 감염 실험의 애벌레

서론

초파리 melanogaster 타고 난 면제1의 연구에 대 한 기초가 튼튼한 모델 생물 이다. 타고 난 면역 반응 동안 hemocytes 병원 체 도전 하 응답에서 중요 한 역할을 재생합니다. Hemocytes는 캡슐화 기생충, 곰 팡이, 바이러스, 그리고 세균성 감염2,3중 phagocytic 행동을 통해 병원 체 퇴치에 중요 한 기능을가지고 위한 중요 합니다.

최고의 호스트의 병원 성 미생물 감염에 타고 난 면역 반응 이해, 그것은 병원 체 감염 시 호스트 셀을 침공 하는 방법을 시각화 하는 것이 중요. 이 시각화의 메커니즘의 이해에 기여 한다. 병원 체 세포내 지역화의 세부 사항 및 세포질 응답, 이러한 데이터는 감염 하는 미생물이 작용 하는 세포 세포 호스트 응답에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 따라서, 영상 현미경 검사 법에 의해 후 3D 모델 재구성 호스트 세포에 병원 균의 정확한 위치를 확인 하려면 유용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Coxiella burnetii (C. burnetii), Q 열, 기본 초파리 hemocytes에 둘 다 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 동물 매개 질병의 원인이 되는 대리인의 침공 시각. 최근에, 그것은 초파리 는 Biosafety 수준 2 9 마일 단계 II (NMII) 복제 4 C. burnetii 의 긴장과이 긴장은 초파리4를 복제할 수는 를 나타내는에 취약 입증 되었다 초파리 C. burnetii 병 인을 공부 하는 모델 생물으로 사용할 수 있습니다.

이전 연구는 호스트의 타고 난 면역 반응 검사를 hemocytes를 사용 했습니다. Hemocytes 형태학 관찰5,,67, 형태학 분석2,8, 먹어서 분석2,3, qRT-PCR2 사용 되었습니다. , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent 분석10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 및 immunohistochemistry9,14. 초파리 S2 세포, 다양 한 생체 외에서 실험에 사용할 수도 있지만 immortalization 및 잠재적인 기존의 바이러스 감염 그들의 행동15,16변경. S2 세포 같은 불멸 하 게 셀 라인, 반대로 1 차 셀의 사용 수 있습니다 타고 난 면역 기능 연구에 대 한 시스템에서 전체 유기 체의 더 대표. 또한, hemocytes에서 vivo에서, 추출, 이전 감염 다른 호스트 단백질 및 조직, 비보 전 감염 전에 hemocytes의 추출에 비해 우위를 셀 수 있습니다. 다른 방법의 수는 hemocytes 살아8,17,,1819계속 시간의 짧은 기간에 hemocytes의 충분 한 수를 이용 되어 있다.

이 연구에서는 hemocytes C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria), 또는 무척추동물 무지개 빛깔의 병원 성 미생물 감염에 대 한 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 하는 방법 소개 6 (IIV6) 바이러스입니다. Vivo에서 및 비보 전 hemocyte 감염에 대 한 방법을 설명합니다. Vivo에서-와 ex vivo-감염된 hemocytes confocal 현미경 검사 법으로 구상 되었고 C. burnetii 의 3D 모델을 구축 하는 데 사용. 또한, 프로토콜을 사용 하는 추출, ex vivo-감염된 hemocytes 유전자와 단백질 식에 사용 된 분석 실험. 특히, IIV6 및 Listeria감염의 정도 검사, 총 RNA 또는 단백질 했다 격리 qRT-PCR 또는 서쪽 오 점 분석에 대 한 셀에서. 함께 찍은, 프로토콜 빠르게 3rd 탈피 애벌레와 기본 hemocytes, vivo에서 또는 전 비보감염 증거에서 hemocytes의 높은 숫자를 수집 하는 메서드를 제공 합니다에 대 한 적합 한 플랫폼 미생물 병원 체 감염 연구 그리고 현미경 검사 법, transcriptomics, proteomics 등 해당 다운스트림 분석.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 감염 비보 전

  1. 매체 및 장비
    1. 무 균 조건 하에서 준비 신선한 초파리 Hemocyte 분리 매체 (작성자) 75% 슈나이더의 초파리 를 포함 보통 25%로 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 필터 살 균 그것.
    2. 레이어는 stereomicroscope에서 10 cm x 10 cm 파라핀 영화의 2-3 조각.
    3. 유리 모 세관을 준비 합니다. 최대의 55%를 모 세관 끌어당기는 히터를 설정 합니다. 약 10 µ m의 날카로운 포인트를 모 세관 튜브를 당겨.
    4. 백필 미네랄 오일 모 세관입니다.
    5. Nanoinjector (그림 1A)에 채워진된 모 세관 튜브를 조립 하 고 집게 (그림 1B) 끝을 끊어서 융합된 세관 팁을 엽니다. 팁의 외부 직경은 hemocytes의 쉬운 이해를 위한 100 µ m 이어야 한다.
    6. 모 세관 튜브 끝에서 가능한 많은 기름 추출 다음 작성자와 작성. 최대 촬영 hemolymph와 오일의 테두리 쉽게 시각화, 포함 석유와 작성자 사이 공기 거품 (그림 1B').
  2. Hemolymph 추출
    1. 선택 3rd 탈피 초파리 애벌레 안쪽에서 음식의 벽 집게를 사용 하 여 부드럽게 리 바이 알 및 100 µ m 여과기 (그림 1C)에 그들을 배치. 3rd 탈피 애벌레는 성인 여성에 의해 누워 비옥한 계란을 다음 3-6 일 찾을 수 있습니다.
      참고: 이러한 실험 사용 유전자 형, w1118; P {w+ mCHml GAL4.Δ =} 2, P {w+ mCUAS-2xEGFP =} AH2, 이후이 동물에서 hemocytes 표현 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 현미경으로 세포의 식별에 도움.
    2. 애벌레에 붓는 살 균 물의 5 mL와 5 미 장소 작업 지우기에 여과기 과잉의 물을 제거 하는 여과기를 흔들어 (그림 1C').
    3. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 애벌레를 전송 합니다. 5 CO2 가스와 함께 그들을 anesthetize (그림 1D).
    4. 등-면 (그림 2A) 최대 stereomicroscope, 아래 파라핀 필름에 애벌레를 놓습니다.
    5. 제자리에 후부 표 피 중단을 장소 애벌레 후부 시체에 가볍게 모 세관 유리 정밀한 날카로운된 집게 (그림 2B)를 사용 하 여 엽니다.
    6. Hemolymph 파라핀 필름 (그림 2C)에 흐르는 것을 허용 한다.
    7. 파라핀 영화에 한 번에 20-50 애벌레에서 hemocytes를 포함 하는 hemolymph의 풀을 확인 합니다.
    8. 소요는 유리를 사용 하 여 풀링된 hemolymph nanoinjector (그림 2D)에 모 세관.
      참고: hemolymph의 약 10-20 µ L을 하 고 있어야 합니다.
    9. 작성자 (그림 2E)의 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로는 hemolymph를 꺼냅니다.
    10. 반복 단계 1.2.4)-1.2.9) 애벌레의 모든 일괄 처리에 대 한.
  3. Hemocytes의 수를 계산 합니다.
    1. 죽은 세포 얼룩 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 5 µ L 플라스틱 부드럽게 작성자와는 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 hemocytes 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 hemocytes를 포함 하 여 작성자의 5 µ L를 전송 하 고 부드럽게 혼합.
    2. 1:1 Trypan 파랑: hemocyte 혼합물에서 셀의 10 µ L는 hemocytometer에 플라스틱.
    3. 라이브 hemocytes는 하지로 얼룩진 Trypan 블루는 hemocytomter의 4 모서리 필드의 각을 계산 하는 수식을 사용 하 여 밀리 리터 당 hemocytes의 농도의 수를 계산:
      figure-protocol-1
      여기서 X는 밀리; 당 라이브 hemocytes의 농도 a, b, c, 그리고 d는 필드의 각 4 (Trypan 블루 제외 결정)로 라이브 셀 수는 hemocytometer에 계산. 셀 계산의 총 수의 2에 의해 Trypan 블루 셀의 1:1 희석 때문입니다. Trypan 푸른 물 셀 죽으로 간주 됩니다.
  4. 비보 전 감염
    1. Timepoints 및 생물에 따라 세포와 시드를 우물의 수 복제 각 실험에 필요한 결정 합니다. 5.0 × 104 hemocytes는 RNA와 단백질 정화 감염 다음 필요한.
    2. 작성자는 다음 수식을 사용 하 여 감염에 대 한 희석에 병원 체의 볼륨을 계산:
      figure-protocol-2
      어디 감염 (MOI)의 다양성은 바이러스의 수 또는 박테리아 세포 당 원하는.
      참고: 사용 하는 나는 개별 실험 및 분석 실험 수행에 따라 다릅니다. 여기, 10 게놈 등가물 (GE) / C. burnetii, Listeria의 10 CFU/셀 또는 IIV6의 1 TCID50/cell의 셀이 사용 되었다.
    3. 튜브에 바이러스 성 또는 세균성 볼륨에 작성자의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 24-잘 접시의 각 음에 대 한 병원 체 매체의 500 µ L를 준비 합니다.
    4. 장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드.
    5. 24-잘 접시의 우물에는 hemocytes를 포함 하 여 작성자를 분할.
    6. 잘에서 hemocytes에 병원 체 매체의 500 µ L를 추가 합니다.
    7. 1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심
    8. 1 h 28 ° c.에 대 한 접시를 품 어 모든 15 분 부드럽게 앞, 다음 5 오른쪽 왼쪽 뒤에서 접시 기울기 손으로 s.
    9. 침공/첨부 파일 단계 1.4.8의 1 h), 후 부드럽게 병원 체 매체에서 플라스틱 세척 신선한 작성자와 hemocytes 그리고 신선한 작성자의 500 µ L 리필.
    10. 원하는 시간에 대 한 감염된 hemocytes를 품 어. 이러한 실험, C. burnetii에서-또는 IIV6에 감염 된 hemocytes는 24 시간, 및 Listeriaincubated-감염된 hemocytes 1, 2, 또는 4 h 알을 품는.

2. vivo에서 감염

  1. 감염
    1. 따뜻한 실 온 15 분 접시에서 초파리 과일 주스 천 배지 이전 만들어집니다20을설명 합니다.
      1. 물과 압력솥의 700 mL를 agar의 30 g 추가 40 분 동안 그것.
      2. 메 틸 paraben 절대 에탄올 10 mL에 0.5 g을 녹.
      3. 과일 주스 농축의 300 mL에 메 틸 paraben 솔루션을 추가 합니다.
      4. 신속 하 게 압력가 한 솔루션으로 농축 혼합 하 고 10 × 35 mm 페 트리 접시에 5 mL을 분배.
      5. 후 15 분 동안 냉각 판, 4 ° c.에서 그들을 저장합니다
    2. 3rd 탈피 애벌레 1.2.1 단계 준비)-1.2.3).
    3. 한 천 배지에서 효 모 반죽을 놓습니다. 애벌레 (그림 3A) 건조를 피하기 위해 마이그레이션할 수 한 천 배지에서 잘 컷을 확인 합니다. 파라핀 영화 (그림 3B, C)를 사용 하 여 집게를 들고와 0.001 m m 지적된 텅스텐 바늘을 조립.
    4. 높은 titer mCherry의 50 µ L 플라스틱 표현-C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL)를 파라핀에 스테레오 현미경 영화 하 고 애벌레 박테리아의 수영장.
    5. 박테리아의 수영장으로 애벌레를 놓습니다. 텅스텐 바늘 (그림 3D) 애벌레를 찌 르 기. 한 천 배지 (그림 3E)에 애벌레를 전송 합니다.
    6. 한 접시에 나머지 병원 체 매체 전송 및 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.
    7. 원하는 시간 후 감염 (그림 3F)까지 습 한 공기에는 접시에 애벌레 계속. 이 실험에서 C. burnetii-24 h에 대 한 접시에는 감염 된 애벌레.
  2. Hemolymph 추출 및 hemocytes의 도금
    1. 준비 단계 1.1 다음과 같은 장비와 매체).
    2. 장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드. 우물에 작성자의 500 µ L 플라스틱
    3. 에서 추출 하는 hemolymph 단계 1.2.4 감염 된 애벌레)-1.2.8).
    4. 그럼 다음에 hemolymph를 추출 단계 2.2.2).
    5. 2.2.3 반복) 및 2.2.4) 애벌레의 여러 일괄 처리에 대 한.
    6. 1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심

3입니다. 시각화

  1. 담합 및 얼룩
    1. 우물에서 라운드 커버 유리에 hemocytes 수 있도록, 후 부드럽게 각 우물에서 매체를 제거 합니다.
    2. 부드럽게 정착된 hemocytes의 각 음에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 200 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 20 분 동안 hemocytes를 품 어.
    3. 4% 제거 PFA 부드럽게 0.1%를 포함 하는 PBS의 200 µ L을 추가 하 고 트라이 톤 X-100 그리고 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 각 잘 하. 실 온에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.
    4. PBS를 제거 하 고 부드럽게 200 µ L의 ' 1 × 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 각 영역을 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.
    5. DAPI 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 각 우물에 PBS를 추가. 실 온에서 5 분 동안 hemocytes를 품 어.
    6. 유리 현미경 슬라이드에서 antifade 설치 매체의 10 µ L를 드롭.
    7. 각 우물에서 PBS를 제거한 후 덮개 유리 잘 지적 집게를 사용 하 여 24-잘 접시에서 제거 합니다. 부드럽게 유리 슬라이드에 아래로 hemocytes antifade 장착 매체에 커버 유리 넣습니다.
    8. 어두운 하룻밤에 그것을 배치 하 여 건조를 허용 합니다.
  2. Confocal 영상
    1. DAPI, EGFP, 및 mCherry의 세 가지 컬러 이미징 공초점 현미경을 구성 합니다. 다음 설정 사용: (예) 405 DAPI 여기 nm, 방출 (em) 415-480 nm; 488 전 EGFP nm, em 493-564 nm; 587 ex mCherry nm, em 597-700 nm.
    2. 현미경과 63 X를 사용 하 여 샘플에 초점에 샘플 배치 / 1.4 수 가늠 구멍 (NA) 목표. 이미징에 대 한 보기 필드에에서 원하는 hemocytes를 찾습니다.
    3. 샘플의 적절 한 노출을 달성 레이저 파워 및 검출기 이익 조정 합니다. 여러 z-비행기 노출 수준 전체 샘플 두께 적합 한지를 확인 하십시오.
    4. 전체 hemocyte의 z 축에서 위쪽 및 아래쪽 위치를 찾아. Z 단면에 대 한 시작 및 끝 위치도이 위치를 설정 합니다.
    5. 검색 줌 이미지는 hemocyte에 포함 된 영역을 사용 합니다. 3 X의 확대/축소 요소는 자주 사용 하 고 있다.
    6. X-y 평면에서 1024 x 1024 픽셀 등 적절 한 해상도 이미지 시리즈와 z 차원에서 0.3 µ m 간격을 수집 합니다.
  3. 3D 모델 재구성
    참고: 오픈 소스 소프트웨어는 3D 모델 재구성에 대 한 대부분의 아래에 설명 된 함수를 수행 하는 존재 합니다.
    1. 3D 모델 재구성 confocal 현미경과 관련 된 소프트웨어에 z sectioned 이미지 시리즈 파일을 가져옵니다.
    2. DAPI와 mCherry C. burnetii 는 EGFP hemocyte 표현에 표현 스테인드 핵의 공동 지역화를 표시 하는 셀을 선택 합니다. 자르기만 단일 셀을 포함 하도록 이미지 시리즈.
    3. 3D 뷰어 옵션 소프트웨어의 사전 패키지 된 알고리즘을 사용 하 여 3D 모델을 재구성을 선택 합니다. 3D 표현 혼합, 표면, 및 혼합된 옵션 중 원하는 유형을 선택 합니다. 이 방법에서는, hemocytes, 핵, 및 C. burnetii 표시 됩니다 표면 모델을 사용 하 여.
    4. 마우스 버튼을 누른 화면 커서를 드래그 하 여 보기의 다양 한 위치에서 3D 복원된 셀을 관찰 합니다. 셀 방향 및 이미지를 최적화 하기 위해 모델된 광원의 위치를 조정 합니다. 불투명도, 최소 및 최대 임계값, 스 페 큘 러, 주위, Shineness, 및 감마에 대 한 다른 옵션 이미지를 최적화 하기 위해 존재 합니다.
    5. 횡단면은 hemocyte의 내부 내용을 시각화를 클리핑 및 단면 명령을 사용 하 여 모델을 가져가 라.

4입니다. 유전자 및 단백질 분석에 대 한 응용 프로그램

  1. 후속 qRT-PCR를 위한 세포를 lyse 다음 IIV6 및 Listeria, 감염 또는 서쪽 오 점 분석 앞에서 설명한 다음 제조업체의 지침과21 .
    참고: qRT-PCR를 위한 뇌관 및 서쪽 오 점을 위해 항 체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
  2. 증폭된 제품의 적절 한 길이 있도록 agarose 젤 전기 이동 법, 앞에서 설명한22로 PCR 제품 분석.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

수집 3 × 10에 ex vivo 감염에 대 한 hemocytes 살고6 hemocytes 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 되었다. 우리의 방법 개발, 다양 한 다른 기술 시도 했다. 개별 애벌레 해 부까지 1.5 h 걸릴 것 이라고 하 고 ~ 8000 셀의 평균이 방법18, 대부분의 컬렉션의 끝에 의해 살아 있던을 사용 하 여 얻은 했다. 다음, 우리는 hemocytes를 포함 하는 hemolymph를 추출 하려고, 한 번 사용 하 여 표 피와 유리 모 세관 튜브19, 하지만 모 세관 막힌 되었다 20 애벌레에서 소재와 hemolymph 하지 못했습니다 유리에 의해 효율적으로 채택 될 모 세관입니다. 마지막으로, 우리는 기계적으로 미세 집게12, 일괄 처리 당 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

잘 이해 하려면 어떻게 호스트 세포 감염 될, 이전 안 된 병원 체와 세포 유형 조합4에 실험 하는 경우에 특히 셀, 병원 체의 지역화를 명확 하 게 중요 하다. 동안 감염에 따라 세포질 응답 캐스케이드 공부 생산 병원 체 침입을 나타낼 수 있습니다, 이미징 및 세포 응답 데이터의 조합 병원 체 침입 및 감염을 필수적 이다. 호스트 세포에 병원 체의 2 차원 이미지를 보여 주는 보고서 생산적인 감염을 표시 하는 경향이 있다, 몇 가지 질문 수 호스트 세포에서 초기 병원 체 침입의 타이밍에 대하여 남아 있다. 따라서, 3D 모델을 2D 이미지의 z-섹션 검색에서 재건 이러한 질문을 해결 하 고 호스트 세포 (그림 4 및 5)에 병원 체 위치를 나타내는 수 있습니다. 그러나, 기본 hemocytes를 사용 하 여 제한 셀 문화에 그들의 장 수 이다. 이전 보고서 상태 셀 문화 미디어에서 hemocyte 생존은만 8 h

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

우리는 표현 하는 mCherry Coxiella burnetii의 주식을 제공 하기 위한 박사 로버트 Heinzen에 감사입니다. 우리는 비행 주식 제공 무척 추 동물 무지개 빛깔 바이러스 6 및 블루밍턴 재고 센터 제공을 위한 닥터 루이스 테 세이 라 감사 합니다. 이 프로젝트는 NIH 부여 R00 AI106963 (A.G.G.)와 워싱턴 주립 대학에 의해 부분적으로 투자 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
슈나이더의 Drosophila 미디엄 Thermo Fisher Scientific (Gibco)217200241.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine SerumGE Healthcare Life Sciences  (하이클론)SH30070.03HI1.1.1), 2.1.2)
필터(0.22 &마이크로; L)RESTEK261581.1.1)
스트레이너(100 &마이크로; m)Greiner bio-one5420001.2.1), 2)
실체 현미경AmscopeSM-1BSZ-L6W1.2), 2)
유리 모세관Fisher Scientific21-171-41.1), 1.2), 2)
모세관 풀러Narishige International USA, Inc.PC-101.1.3)
미네랄 오일Snow River Products1.1.4)
나노인젝터Drummond Scientific Company3-000-2041.1), 1.2), 2.2)
겸자VWR82027-4021.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery 장치Genesee Scientific59-122BC1.2), 2)
Trypan BlueThermo Fisher Scientific (Gibco)152500611.3)
혈구계Hausser Scientific31001.3)
24 웰 플레이트Greiner bio-one6621601.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherryDr. Heinzen, R.1.4), 2.2)
Drosophila 과일 주스 플레이트콜드 스프링 하버 프로토콜2.1)
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full 한천피셔 생물 시약BP1423-5002.1.1.1)
메틸 파라벤Amresco0572-500G2.1.1.2)
절대 에탄올피셔 생물 시약BP2818-5002.1.1.2)
Welch's 100% 포도 주스 냉동 농축액, 340mL아마존B0025UJVGM2.1.1.3)
페트리 접시, 10 x 35mmFisher Scientific08-757-100A2.1.1.4)
현미경 커버 유리Fisher Scientific12-545-801.4.4), 2.2.2)
효모, Bakers Dried ActiveMP Biomedicals02101400012.1) 물 2부를 첨가합니다. 효모 (v / v)의 1 부분
텅스텐 바늘Fine Science Tools10130-202.1)
집게VWRHS83132.1)
파라 포름 알데히드Fisher ScientificFLO4042-5003.1.3)
트리톤 X-100Fisher ScientificBP151-5003.1.3)
소 혈청 알부민Fisher ScientificBP9706-1003.1.3)
4',6-디아미디노-2-페닐린돌Thermo Fisher Scientific622473.1.4)
안티페이드 마운팅 매체Thermo Fisher ScientificP369303.1.6)
컨포칼 마이크로솝LeicaTCS SP8-X 백색광 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경3.2)
3D 이미징 재구성 소프트웨어LeicaLASX 3D 시각화 모듈포함3.3)
현미경 슬라이드Fisher Scientific12-552-33.1.6)
무척추 동물 무지개 빛깔 바이러스 6 (IIV6)Dr. Teixeria, L.4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenesATCCstrain: 10403S4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987)는 50 µ를 함유하는 Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences)에서 성장하였다; g/ml 스트렙토마이신 30 °C.
DNase IThermo Fisher Scientific(Invitrogen)18068015gDNA 분해
cDNA 합성 키트Bio-Rad1708891cDNA 합성
IIV6_193R_FIDTqRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R
IDTqRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd
SIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- GAA GCG, TTT CTC, CAA ACG -AG
시그마-알드리치qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR 시약Thermo Fisher ScientificK0251, K0252, K0253qRT-PCR
Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific4351107, 7500 Software v2.0qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes 항체abcamab35132웨스턴 블롯
안티 액틴 항체 토끼SIGMA-ALDRICHA2066웨스턴 블롯
안티 토끼 IgG (H + L), HRP ConjugatePromegaW4011웨스턴 블롯
RpII_qRTPCR_rev 에서 생산

참고문헌

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720(2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721(2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628(2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593(2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173(2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173(2007).
  20. Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088(2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910(2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

3Dex vivoin vivoqRT PCR

관련 논문