미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

요약

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

초록

초파리 melanogaster 의 병원 성 감염 시 hemocytes 감염을 통해 면역 반응에 중요 한 역할을 재생합니다. 따라서,이 프로토콜의 목표, 즉 hemocytes의 특정 면역에 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 개발 하는 것입니다. 여기, 3 × 10에 제시 된 방법을 사용 하 여⁶ 라이브 hemocytes ex vivo 감염에 대 일 분에서 200 초파리 3^rd 탈피 애벌레에서 얻을 수 있습니다. 또는, hemocytes는 감염 된 vivo에서 구명 hemocyte 추출에 의해 감염 된 후 24 시간에 3^rd 탈피 애벌레의 주사를 통해 하실 수 있습니다. 이러한 감염된 1 차 셀 고정, 스테인드, 고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 그럼, 3D 표현 병원 체 침입을 결정적으로 보여 이미지에서 생성 되었습니다. 또한, qRT-PCR에 대 한 높은-품질 RNA 병원 체 mRNA 다음의 탐지를 위해 얻어질 수 있다 감염, 그리고 충분 한 단백질 서쪽 오 점 분석에 대 한 이러한 셀에서 추출할 수 있습니다. 함께 찍은, 우리 병원 체 침입의 확실 한 조정 및 세균성과 바이러스 성 병원 체 종류와 hemocyte 추출 위한 효율적인 방법 초파리 에서 충분 한 라이브 hemocytes를 사용 하 여 감염의 확인 하는 방법 제시 vivo ex vivo에서 감염 실험의 애벌레

서론

초파리 melanogaster 타고 난 면제¹의 연구에 대 한 기초가 튼튼한 모델 생물 이다. 타고 난 면역 반응 동안 hemocytes 병원 체 도전 하 응답에서 중요 한 역할을 재생합니다. Hemocytes는 캡슐화 기생충, 곰 팡이, 바이러스, 그리고 세균성 감염^2,3중 phagocytic 행동을 통해 병원 체 퇴치에 중요 한 기능을가지고 위한 중요 합니다.

최고의 호스트의 병원 성 미생물 감염에 타고 난 면역 반응 이해, 그것은 병원 체 감염 시 호스트 셀을 침공 하는 방법을 시각화 하는 것이 중요. 이 시각화의 메커니즘의 이해에 기여 한다. 병원 체 세포내 지역화의 세부 사항 및 세포질 응답, 이러한 데이터는 감염 하는 미생물이 작용 하는 세포 세포 호스트 응답에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 따라서, 영상 현미경 검사 법에 의해 후 3D 모델 재구성 호스트 세포에 병원 균의 정확한 위치를 확인 하려면 유용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Coxiella burnetii (C. burnetii), Q 열, 기본 초파리 hemocyt....

프로토콜

1. 감염 비보 전

1. 매체 및 장비
   1. 무 균 조건 하에서 준비 신선한 초파리 Hemocyte 분리 매체 (작성자) 75% 슈나이더의 초파리 를 포함 보통 25%로 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 필터 살 균 그것.
   2. 레이어는 stereomicroscope에서 10 cm x 10 cm 파라핀 영화의 2-3 조각.
   3. 유리 모 세관을 준비 합니다. 최대의 55%를 모 세관 끌어당기는 히터를 설정 합니다. 약 10 µ m의 날카로운 포인트를 모 세관 튜브를 당겨.
   4. 백필 미네랄 오일 모 세관입니다.
   5. Nanoinjector (그림 1A)에 채워진된 모 세관 튜브를 조립 하 고 집게 (그림 1B) 끝을 끊어서 융합된 세관 팁을 엽니다. 팁의 외부 직경은 hemocytes의 쉬운 이해를 위한 100 µ m 이어야 한다.
   6. 모 세관 튜브 끝에서 가능한 많은 기름 추출 다음 작성자와 작성. 최대 촬영 hemolymph와 오일의 테두리 쉽게 시각화, 포함 석유와 작성자 사이 공....

결과

수집 3 × 10에 ex vivo 감염에 대 한 hemocytes 살고⁶ hemocytes 200 초파리 3^rd 탈피 애벌레에서 추출 되었다. 우리의 방법 개발, 다양 한 다른 기술 시도 했다. 개별 애벌레 해 부까지 1.5 h 걸릴 것 이라고 하 고 ~ 8000 셀의 평균이 방법¹⁸, 대부분의 컬렉션의 끝에 의해 살아 있던을 사용 하 여 얻은 했다. 다음, 우리는 hemocytes를 포함 하는 hemolymph를 추출 하려고, 한 번 사용 하 여 표 피와 유리 모 세관 튜브¹⁹, 하지만 모 세관 막힌 되었다 20 애벌레에서 소재와 hemolymph 하지 못했습니다 유리에 의해 효율적으로 채택 될 모 세관입니다. 마지막으로, 우리는 기계적으로 미세 집게¹², 일괄 처리 당 .......

토론

잘 이해 하려면 어떻게 호스트 세포 감염 될, 이전 안 된 병원 체와 세포 유형 조합⁴에 실험 하는 경우에 특히 셀, 병원 체의 지역화를 명확 하 게 중요 하다. 동안 감염에 따라 세포질 응답 캐스케이드 공부 생산 병원 체 침입을 나타낼 수 있습니다, 이미징 및 세포 응답 데이터의 조합 병원 체 침입 및 감염을 필수적 이다. 호스트 세포에 병원 체의 2 차원 이미지를 보여 주는 보고서 생산적인 감염을 표시 하는 경향이 있다, 몇 가지 질문 수 호스트 세포에서 초기 병원 체 침입의 타이밍에 대하여 남아 있다. 따라서, 3D 모델을 2D 이미지의 z-섹션 검색에서 재건 이러한 질문을 해결 하 고 호스트 세포 (그림 4 및 5)에 병원 체 위치를 나타내는 수 있습니다. 그러나, 기본 hemocytes를 사용 하 여 제한 셀 문화에 그들의 장 수 이다. 이전 보고서 상태 셀 문화 미디어에서 hemocyte 생존은만 8 h

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
슈나이더의 Drosophila 미디엄	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	21720024	1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences  (하이클론)	SH30070.03HI	1.1.1), 2.1.2)
필터(0.22 &마이크로; L)	RESTEK	26158	1.1.1)
스트레이너(100 &마이크로; m)	Greiner bio-one	542000	1.2.1), 2)
실체 현미경	Amscope	SM-1BSZ-L6W	1.2), 2)
유리 모세관	Fisher Scientific	21-171-4	1.1), 1.2), 2)
모세관 풀러	Narishige International USA, Inc.	PC-10	1.1.3)
미네랄 오일	Snow River Products		1.1.4)
나노인젝터	Drummond Scientific Company	3-000-204	1.1), 1.2), 2.2)
겸자	VWR	82027-402	1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery 장치	Genesee Scientific	59-122BC	1.2), 2)
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15250061	1.3)
혈구계	Hausser Scientific	3100	1.3)
24 웰 플레이트	Greiner bio-one	662160	1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.		1.4), 2.2)
Drosophila 과일 주스 플레이트	콜드 스프링 하버 프로토콜		2.1)
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full 한천	피셔 생물 시약	BP1423-500	2.1.1.1)
메틸 파라벤	Amresco	0572-500G	2.1.1.2)
절대 에탄올	피셔 생물 시약	BP2818-500	2.1.1.2)
Welch's 100% 포도 주스 냉동 농축액, 340mL	아마존	B0025UJVGM	2.1.1.3)
페트리 접시, 10 x 35mm	Fisher Scientific	08-757-100A	2.1.1.4)
현미경 커버 유리	Fisher Scientific	12-545-80	1.4.4), 2.2.2)
효모, Bakers Dried Active	MP Biomedicals	0210140001	2.1) 물 2부를 첨가합니다. 효모 (v / v)의 1 부분
텅스텐 바늘	Fine Science Tools	10130-20	2.1)
집게	VWR	HS8313	2.1)
파라 포름 알데히드	Fisher Scientific	FLO4042-500	3.1.3)
트리톤 X-100	Fisher Scientific	BP151-500	3.1.3)
소 혈청 알부민	Fisher Scientific	BP9706-100	3.1.3)
4',6-디아미디노-2-페닐린돌	Thermo Fisher Scientific	62247	3.1.4)
안티페이드 마운팅 매체	Thermo Fisher Scientific	P36930	3.1.6)
컨포칼 마이크로솝	Leica	TCS SP8-X 백색광 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	3.2)
3D 이미징 재구성 소프트웨어	Leica	LASX 3D 시각화 모듈	포함3.3)
현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-552-3	3.1.6)
무척추 동물 무지개 빛깔 바이러스 6 (IIV6)	Dr. Teixeria, L.		4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes	ATCC	strain: 10403S	4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987)는 50 µ를 함유하는 Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences)에서 성장하였다; g/ml 스트렙토마이신 30 °C.
DNase I	Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)	18068015	gDNA 분해
cDNA 합성 키트	Bio-Rad	1708891	cDNA 합성
IIV6_193R_F	IDT		qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R
	IDT		qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd
	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- GAA GCG, TTT CTC, CAA ACG -AG
	시그마-알드리치		qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR 시약	Thermo Fisher Scientific	K0251, K0252, K0253	qRT-PCR
Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107, 7500 Software v2.0	qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes 항체	abcam	ab35132	웨스턴 블롯
안티 액틴 항체 토끼	SIGMA-ALDRICH	A2066	웨스턴 블롯
안티 토끼 IgG (H + L), HRP Conjugate	Promega	W4011	웨스턴 블롯

RpII_qRTPCR_rev 에서 생산