가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

요약

메서드는 마우스 두뇌와 셀 문화에서 불용 해 성과 녹는 돌연변이 huntingtin 종의 분류에 대 한 설명 되어 있습니다. 설명 하는 메서드는 특성화 및 정량화 huntingtin 단백질 플럭스와 단백질 항상성 질병 병 인에 고 섭의 존재를 분석 에이즈의

초록

Misfolded 단백질의 축적 중심 Huntington의 질병 (HD)에 병 리 그리고 많은 다른 신경 퇴행 성 질환입니다. 특히, HD의 주요 병 적인 특징은 높은 분자량 복합물으로 돌연변이 체 HTT (mHTT) 단백질의 탈 선 축적 하 고 세포내 포함 시체 조각 및 다른 단백질으로 구성. 기존의 방법 측정 하 고 이해 하는 다양 한 형태의 mHTT 포함 된 집계의 기여 등 형광 현미경 검사 법, 서쪽 오 점 분석, 필터 트랩 분석 실험.

그러나, 이러한 방법의 대부분 특정, 구조 이며 따라서 mHTT 단백질 유량 집계 용 해도 및 해상도의 복잡 한 특성의 전체 상태를 확인 하지 않을 수 있습니다.

집계 mHTT 및 다양 한 수정된 양식 및 단지의 식별, 분리 및 세포 집계 및 파편의 가용 화는 필수입니다. 여기 우리 녹는 mHTT, 단위체, 올리고, 조각, 시각화를 격리 하는 방법을 설명 하 고 있는 불용 성 고 분자량 (HMW) 축적 mHTT 종. HMW mHTT 추적 질병 진행, 마우스 동작 표시기와 해당 하며 특정 치료 개입¹군인이 변조 되었습니다. 이 방법은 마우스 뇌, 주변 조직 및 세포 배양 함께 사용할 수 있지만 다른 모델 시스템 또는 질병 상황에 적용할 수 있습니다.

서론

적절 한 접는 보장 하는 단백질 품질 관리 네트워크 장애 및 세포 단백질의 저하는 가능성이 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 병 리 및 다른 "단백질 misfolding" ^2,3장애. Proteostasis 네트워크 구성 요소와 병 리에 그들의 공헌에 대 한 자세한 이해는 그러므로 향상 된 치료 내정간섭을 개발 하는 중요 한. HD는 HD 유전자 huntingtin (HTT) 단백질⁴에서 polyglutamines (polyQ)의 확장 된 스트레칭 결과 내에서 CAG 반복의 비정상적인 확장에 의해 발생 합니다. HD pathogenesis의 일관 된 병 적인 기능이 이다는 결과 misfolding, 축적, 그리고 정상적인 세포 항상성 그리고 기능을 여러 가지 방법으로 방해를 표시 되었습니다 HTT 두뇌의 영역에서와 주변 조직에의 ^{5 , 6}. 동안 HTT 표현 편, 고가에 중간 가시 뉴런 선택적으로 취약 하 고 가장 명백 하 게 영향을 받는 주목할 만한 대뇌 피 질의 위축 또한 HD patho....

프로토콜

동물 윤리 문-실험 실시 했다 관심과 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (에 의해 승인 된 동물 연구 프로토콜의 사용의 실험실 동물에 대 한 가이드와 함께 따라 IACUC), 어바인가 주 대학에는 AAALAC 공인 기관. 모든 노력 동물 고통 최소화 되었다.

1입니다. 세포의 용 해 버퍼의 준비

1. 세포의 용 해 버퍼 "수용 성" 준비 (10 mM Tris pH 7.4, 1% 트리톤 X 100, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤)와 0.22 μ m 필터를 통해 살 균 필터.
   1. 작업 "수용 성" 세포의 용 해 버퍼, N-Ethylmaleimide (NEM)를 측정 하 고 철저 하 게 100mm phenylmethysulfonyl flouride (PMSF)에 100% 녹아 분해 EtOH.
      참고: 세포의 용 해 버퍼 억제제: (i) 20 m m N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 밀리미터 PMSF; (iii) 1 m m 나트륨 orthovanadate (나₃보₄); (iv) 1 µ g/mL leupeptin; (v) 1 µ g/mL aprotinin; (vi) 20 m m 나트륨 불 화물 (NaF).
      주의: 프로토콜에 걸쳐....

결과

분류에 따라 가용성과 불용 성 세포 lysates의 해상도 서양 분석 및 필터 지체 분석 (그림 2)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 예를 들어, HEK293T 세포 transfection 시 약 (예를 들어, lipofectamine 2000)를 사용 하 여 페 했다, HTT exon과 97 글루타민을 포함의 인코딩 cDNA 1 개¹⁵ 폴 리 프롤린 풍부한 지역 이어서 반복 하 고 이러한 셀 수 있었습니다. 44 h. 세포 치료에 대 한 표현 중 5 µ M와 MG132는 프로테아좀 차단 또는 수확 전에 h 18로 lysed 컨트롤 DMSO 위에서 설명한. 분별 법 프로토콜, 다음 돌연변이 체 HTT exon 1 녹는 단위체로 약 45 kDa 4-12% 두번째-트리 페이지 젤에 고 3-8% 트리 아세테이트 페이지 젤 (.......

토론

일관 되 고 양적 결과 보장 하기 위해 위의 프로토콜에 대 한 몇 가지 예방 조치 필요 합니다. 첫째, 두 분수에서 mHTT 저절로 형성 집계 여러 동결 해 동 주기, 시 시간이 지남에 특히 높은 농도에. 그것은 따라서 단백질 preps의 aliquots 고정만 위의 프로토콜에 설명 된 대로 시험을 실행 하기 전에 필요한 볼륨을 해 동 하는 중요 한. 또한, 불용 성 분수 녹고 시 흰색 비례적 수율, 경우 재구성 추가 5 s 쥡니다 펄스, 5 분 종, 및 생 화 확 적인 분석 실험을 통해 분석 전에 다시 정량 필요할 수 있습니다.

이 분석 결과 대 한 양적 해상도 로드 컨트롤 또는 각 샘플 내 집 유지 유전자의 녹는 분수의 평균 픽셀 강도 정상화 하 여 달성입니다. 다음과 같이, GAPDH 사용 했다 집 유지 유전자로 수용 성 부분을 위해 그것은 cytosol (그림 1)에 주로 localizes. 다른 일반적으로 사용 되 집.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
멸균 필터	Millipore	SCGP505RE	나사 캡, 멸균 진공 필터,
1mL 티슈 그라인더, Dounce	Wheaton	357538
Sonicator	, Qsonica	모델 Q125
DC 단백질 분석	Biorad	5000111	Lowry 분석
Tris 1M 완충 용액	Alfa Aesar	J60636
Triton X-100	Fisher	BP151-100
NaCl 5M 용액	Teknova	S0251
글리세롤	Fisher	BP229-1
20% SDS 용액	Teknova	S0295
N-ethylmaleimide	Sigma	E1271
Phenylmethylsulfony Flouride	Sigma	P7626	100%에서 100mM 원액 생성 EtOH, 4°C에 보관; C
오르토바나데이트 나트륨	Sigma	S6508	물에 0.5M 스톡 용액 생성
Leupeptin	Sigma	L2884	물에 10mg/ml 스톡 솔루션 생성
아프로티닌	Sigma	A1153	물에 10mg/ml 스톡 솔루션 생성
Fluoride	Sigma	S4504	물에 500mM 스톡 솔루션
생성 Anti-HTT	Millipore	MAB5492	웨스턴 블롯에는 1:1000, 필터 지연 분석에는 1:500을 사용합니다
Anti-GAPDH	Novus Biologicals	NB100-56875	용해성 웨스턴 블롯에는 1:1000을 사용합니다

, , , 과 비교 가능, Sodium. .