방법 논문

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

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DOI:

10.3791/57082

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2018년 2월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

이 논문에서

요약

메서드는 마우스 두뇌와 셀 문화에서 불용 해 성과 녹는 돌연변이 huntingtin 종의 분류에 대 한 설명 되어 있습니다. 설명 하는 메서드는 특성화 및 정량화 huntingtin 단백질 플럭스와 단백질 항상성 질병 병 인에 고 섭의 존재를 분석 에이즈의

초록

Misfolded 단백질의 축적 중심 Huntington의 질병 (HD)에 병 리 그리고 많은 다른 신경 퇴행 성 질환입니다. 특히, HD의 주요 병 적인 특징은 높은 분자량 복합물으로 돌연변이 체 HTT (mHTT) 단백질의 탈 선 축적 하 고 세포내 포함 시체 조각 및 다른 단백질으로 구성. 기존의 방법 측정 하 고 이해 하는 다양 한 형태의 mHTT 포함 된 집계의 기여 등 형광 현미경 검사 법, 서쪽 오 점 분석, 필터 트랩 분석 실험.

그러나, 이러한 방법의 대부분 특정, 구조 이며 따라서 mHTT 단백질 유량 집계 용 해도 및 해상도의 복잡 한 특성의 전체 상태를 확인 하지 않을 수 있습니다.

집계 mHTT 및 다양 한 수정된 양식 및 단지의 식별, 분리 및 세포 집계 및 파편의 가용 화는 필수입니다. 여기 우리 녹는 mHTT, 단위체, 올리고, 조각, 시각화를 격리 하는 방법을 설명 하 고 있는 불용 성 고 분자량 (HMW) 축적 mHTT 종. HMW mHTT 추적 질병 진행, 마우스 동작 표시기와 해당 하며 특정 치료 개입1군인이 변조 되었습니다. 이 방법은 마우스 뇌, 주변 조직 및 세포 배양 함께 사용할 수 있지만 다른 모델 시스템 또는 질병 상황에 적용할 수 있습니다.

서론

적절 한 접는 보장 하는 단백질 품질 관리 네트워크 장애 및 세포 단백질의 저하는 가능성이 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 병 리 및 다른 "단백질 misfolding" 2,3장애. Proteostasis 네트워크 구성 요소와 병 리에 그들의 공헌에 대 한 자세한 이해는 그러므로 향상 된 치료 내정간섭을 개발 하는 중요 한. HD는 HD 유전자 huntingtin (HTT) 단백질4에서 polyglutamines (polyQ)의 확장 된 스트레칭 결과 내에서 CAG 반복의 비정상적인 확장에 의해 발생 합니다. HD pathogenesis의 일관 된 병 적인 기능이 이다는 결과 misfolding, 축적, 그리고 정상적인 세포 항상성 그리고 기능을 여러 가지 방법으로 방해를 표시 되었습니다 HTT 두뇌의 영역에서와 주변 조직에의 5 , 6. 동안 HTT 표현 편, 고가에 중간 가시 뉴런 선택적으로 취약 하 고 가장 명백 하 게 영향을 받는 주목할 만한 대뇌 피 질의 위축 또한 HD pathogenesis 연관.

HD 환자 및 동물 모델의 두뇌에 HTT의 집계의 형성 일반적으로 질병의 진행 및 지배적인 부정 이득의 mHTT7기능에 대 한 프록시 표식으로 봉사 했다. 비록 정확한 기계 장치는 단백질에 의해 misfolding와 집계 mHTT 유발 독성에 기여할 수 있습니다, 불분명 남아 있다 HD 환자와 다양 한 동물 모델의 뇌에서 이러한 흠도의 형성은 고정 하 고 피할 수 없는 기능입니다. 포함 표시 대부분의 N 맨끝을 포함 하는 누적된 HTT 조각 구성 확대 polyQ, 그 베이스를 나타내는 전장 HTT의 대안 접합8,처리9 할 수는 HD. N-터미널 HTT 파편의 병 인에 중요 한 역할 수 빠르게 집계, nucleate, 고 가속 또는 집계 프로세스10전파 HTT의 pathologic 형태를 구성 수 있습니다.

그러나, 이러한 포함의 존재 HTT 유발 독성 또는 세포 죽음11와 반드시 연결 되지 않습니다. HTT 불용 성 집계를 포함12성 oligomeric 종 및 β-시트 소 통해 녹는 단위체에서 집계 과정을 제안 하고있다. 이러한 다양 한 단백질 종 표준 생 화 확 적인 분석 실험을 통해 해결 낮은 세제 세포의 용 해 버퍼에서 그들의 안정성과 표준 생 화 확 적인 분석 실험을 사용 하 여 시각화에 어려움으로 인해 필드에 도전이 되었습니다. 따라서, 방법론 고려 사항 학위 및 누적 및 집계 mHTT의 패턴 감지에 중요 하다.

여기에 제시 된 프로토콜 제공 HTT, 특히 HD pathogenesis 및 질병 진행1,13 와 밀접 하 게 추적에 표시 되는 불용 성 HMW HTT 종 형성의 여러 중간체를 시각화 하는 방법 14. 해결 하 고 추적 mHTT의 여러 종 수 연구원은 질병 병 인을 연구 하 고 그들의 변조 및 질병 병 인에 미치는 영향을 통해 잠재적인 치료 내정간섭을 평가 생화학 도구를 제공 합니다.

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프로토콜

동물 윤리 문-실험 실시 했다 관심과 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (에 의해 승인 된 동물 연구 프로토콜의 사용의 실험실 동물에 대 한 가이드와 함께 따라 IACUC), 어바인가 주 대학에는 AAALAC 공인 기관. 모든 노력 동물 고통 최소화 되었다.

1입니다. 세포의 용 해 버퍼의 준비

  1. 세포의 용 해 버퍼 "수용 성" 준비 (10 mM Tris pH 7.4, 1% 트리톤 X 100, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤)와 0.22 μ m 필터를 통해 살 균 필터.
    1. 작업 "수용 성" 세포의 용 해 버퍼, N-Ethylmaleimide (NEM)를 측정 하 고 철저 하 게 100mm phenylmethysulfonyl flouride (PMSF)에 100% 녹아 분해 EtOH.
      참고: 세포의 용 해 버퍼 억제제: (i) 20 m m N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 밀리미터 PMSF; (iii) 1 m m 나트륨 orthovanadate (나3보4); (iv) 1 µ g/mL leupeptin; (v) 1 µ g/mL aprotinin; (vi) 20 m m 나트륨 불 화물 (NaF).
      주의: 프로토콜에 걸쳐 NEM 작업할 때 얼굴에 마스크를 착용 하십시오. 세포의 용 해 버퍼 작업 해야 할 활성 저 해제 되도록 신선한.
    2. 다음과 같은 순서로 protease 억제제와 수용 성 세포의 용 해 버퍼를 추가 억제제: 나트륨 불 화물 (NaF), 찬 세포의 용 해 버퍼, 나트륨 orthovanadate (나3보4), Aprotinin와 Leupeptin 볼륨까지.
  2. "불용 성" 세포의 용 해 버퍼에 대 한 "성" 세포의 용 해 버퍼의 2 개 mL를 20 %SDS 500 µ L을 추가 하 여 4 %SDS 보충. 실 온에 둡니다.
    참고: SDS 4 ° C에서 보관 하는 때 밖으로 침전 한다 이 온도 실 온에서 보관 하십시오. 최종 세포의 용 해 버퍼 구성: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% 트라이 톤 X-100. 150 mM NaCl; 10% 글리세롤; 4 %SDS (불용 성만)

2. 수용 성/불용 성 분류 프로토콜

참고: 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.

  1. 각 샘플에 대 한 튜브의 두 세트를 라벨: "성"과 "불용 성"
  2. 얼음 처럼 차가운 작업 성 세포의 용 해 버퍼 protease 억제제 (1.1.1 참조) 조직에 보충의 X-µ L를 추가 합니다.
    참고: X = 볼륨에 따라 조직 금액; 표 1을 참조 하십시오.
  3. 마우스 뇌 조직 (즉,가)에 대 한 dounce 유리 1 mL douncer에 "불용 성"에 피펫으로 천천히 30 번 표시 튜브 (얼음에 계속).
    참고: 조심 하지 거품 양식을 것입니다 하 고 불완전 한 균질을 얻을 수 있습니다 douncing, 시작 후 액체의 표면에 휴식 한다.
  4. 셀 (즉, 헬러, HEK293T), 한 번 감기, 1 x PBS로 세포를 씻어. PBS를 제거 하 고 세포 세포의 용 해 버퍼의 최소 볼륨 적용할 셀 스 크레이 퍼와 리프트.
    참고: 셀 라인, 위에 셀 했다 6 잘 플레이트 당 5 x 105 셀에 도금 및 confluency의 가까이에 성장. 하나는 잘 비교 마우스가 사용 된 볼륨입니다.
  5. 전송 homogenate 또는 세포 lysate에 레이블이 "불용 성" 튜브와 얼음 1 시간 (시작 시간 마지막 관 처리 후)에 lyse.
    참고: 세포 lysates 위해 헤어 셀 덩어리 부 화를 시작 하기 전에 여러 번 triturate. 거품의 형성을 하지 마십시오. 짧게 소용돌이 펄스 1 각 샘플 lysing 반쯤 s.
  6. 샘플 20 분 15000 x g에서 4 ° C에서 원심
  7. "성" 분수 상쾌한을 복구 합니다.
    1. 피펫으로와 제거,이 분수 오염으로 펠 릿/흐림 레이어를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. "성"에 피펫으로 녹는 분수 표시 관. 얼음에 계속.
  8. 각 세척; 후 5 분 동안 15000 x g에서 4 ° C에서 500 µ L의 세포의 용 해 버퍼 (x2) 및 원심 분리기로 펠 릿을 세척 그것은 흐린 레이어 중 일부에서 pipetted는 경우 괜 찮 아 요입니다.
  9. 최종 세척 후 조직 펠 릿만을 떠나 모든 나머지 워시 버퍼를 제거 합니다.
    참고:이 시점에서 불용 성 샘플 지금 지켜져야 한다 실내 온도에.
  10. X-µ L 세포의 용 해 버퍼 4 %SDS 보충 resuspend 펠 릿 (볼륨 펠 릿 크기에 따라 조정할 수 있습니다; 표 1참조).
  11. 30 각 샘플을 sonicate 프로브 sonicator 실내 온도에서 s (125 와트, 20 kHz 펄스, 진폭 40%, 재료의 표참조).
  12. 30 분;에 대 한 샘플 (압 연 종)를 삶아 짧게 원심 (15 s) 어떤 샘플을 잃지으로 6000 x g에서.
  13. DC (세제 호환) 단백질 분석 실험을 수행 ( 재료의 표참조) 또는 (샘플 세포 배양에 대 한 각각의 세포의 용 해 버퍼의 1/5 및 1/10 조직 lysates의 시작된 희석 권장) 단백질 농도 측정에 Lowry 단백질 분석 결과.
    참고: 단백질 농도 높은 세제 농도 때문 DC 또는 리 분석 결과 사용 하 여 읽을 해야 합니다.
  14. Aliquot 샘플을 동결-해 동 문제를 피하기 위해 50 µ L 배치로.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 추가 생 화 확 적인 분석 이전 두 분수-20 ° c.에 저장 하 여

3. 서쪽 오 점 및 정량화

  1. 수행 보고 서쪽 오 점 다른1,13 30 µ g의 샘플 버퍼 (염료, 감소 x 1 로드 x 1.6) 로드에 1:1 희석 합니다.
    참고: 분수 당 단백질의 30 µ g 충분 하지만 최적 해상도 대 한 조정 될 수 있다. 3-8% 트리 아세테이트 폴 리 아크릴 아 미드 젤은 불용 성 부분을 위해 사용 되어야 한다. 4-12% 두번째-트리 스 젤은 수용 성 부분을 위해 권장 됩니다.
  2. 짧게 5 분 원심 분리기에 대 한 샘플 (압 연 종)을 종 기 (15 s) 6000 x g 샘플 수집에서.
  3. 감소 된 샘플에 대 한 제조 업체의 프로토콜에 따라 분수 SDS 페이지와 서쪽 오 점 분석.
    참고: 불용 성 분수 0.45 μ M 니트로 막에 전송 하는 경우 가장 좋은 해결 합니다. 관심사의 단백질의 크기에 따라 수용 성 부분을 위해 0.45 또는 0.2 µ M 니트로 사용할 수 있습니다. 일부 최적화 HMW 재료의 최고의 전송 하기 위해 필요할 수 있습니다.
  4. 단백질 효율 로드를 시각화 하기 위해 전체 단백질 얼룩 (예를 들어, MEMcode, 참조 테이블의 재료)와 막 얼룩.
    참고: 서쪽 오 점 평균 픽셀 강도 의해 분석할 수 있습니다. 녹는 분수 실험 시스템에 적합 한 최고의 집 유지 단백질에 정규화 될 수 있습니다. 상대 단백질 풍부도 불용 성 분수 가역 단백질 얼룩 또는 별도 오 점에 히스톤 3 정규화 하 여 확인 했습니다.

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결과

분류에 따라 가용성과 불용 성 세포 lysates의 해상도 서양 분석 및 필터 지체 분석 (그림 2)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 예를 들어, HEK293T 세포 transfection 시 약 (예를 들어, lipofectamine 2000)를 사용 하 여 페 했다, HTT exon과 97 글루타민을 포함의 인코딩 cDNA 1 개15 폴 리 프롤린 풍부한 지역 이어서 반복 하 고 이러한 셀 수 있었습니다. 44 h. 세포 치료에 대 한 표현 중 5 µ M와 MG132는 프로테아좀 차단 또는 수확 전에 h 18로 lysed 컨트롤 DMSO 위에서 설명한. 분별 법 프로토콜, 다음 돌연변이 체 HTT exon 1 녹는 단위체로 약 45 kDa 4-12% 두번째-트리 페이지 젤에 고 3-8% 트리 아세테이트 페이지 젤 (...

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토론

일관 되 고 양적 결과 보장 하기 위해 위의 프로토콜에 대 한 몇 가지 예방 조치 필요 합니다. 첫째, 두 분수에서 mHTT 저절로 형성 집계 여러 동결 해 동 주기, 시 시간이 지남에 특히 높은 농도에. 그것은 따라서 단백질 preps의 aliquots 고정만 위의 프로토콜에 설명 된 대로 시험을 실행 하기 전에 필요한 볼륨을 해 동 하는 중요 한. 또한, 불용 성 분수 녹고 시 흰색 비례적 수율, 경우 재구성 추가 5 s 쥡니다 펄스, 5 분 종, 및 생 화 확 적인 분석 실험을 통해 분석 전에 다시 정량 필요할 수 있습니다.

이 분석 결과 대 한 양적 해상도 로드 컨트롤 또는 각 샘플 내 집 유지 유전자의 녹는 분수의 평균 픽셀 강도 정상화 하 여 달성입니다. 다음과 같이, GAPDH 사용 했다 집 유지 유전자로 수용 성 부분을 위해 그것은 cytosol (그림 1)에 주로 localizes. 다른 일반적으로 사용 되 집...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 NIH (RO1-NS090390)에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 박사 조 안 Steffanfor 기술 지원 및이 분석 결과의 개발 하는 동안 토론을 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
멸균 필터MilliporeSCGP505RE나사 캡, 멸균 진공 필터,
1mL 티슈 그라인더, DounceWheaton357538
Sonicator, Qsonica모델 Q125
DC 단백질 분석Biorad5000111Lowry 분석
Tris 1M 완충 용액Alfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M 용액TeknovaS0251
글리세롤FisherBP229-1
20% SDS 용액TeknovaS0295
N-ethylmaleimideSigmaE1271
Phenylmethylsulfony FlourideSigmaP7626100%에서 100mM 원액 생성 EtOH, 4°C에 보관; C
오르토바나데이트 나트륨SigmaS6508물에 0.5M 스톡 용액 생성
LeupeptinSigmaL2884물에 10mg/ml 스톡 솔루션 생성
아프로티닌SigmaA1153물에 10mg/ml 스톡 솔루션 생성
FluorideSigmaS4504물에 500mM 스톡 솔루션
생성 Anti-HTTMilliporeMAB5492웨스턴 블롯에는 1:1000, 필터 지연 분석에는 1:500을 사용합니다
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875용해성 웨스턴 블롯에는 1:1000을 사용합니다
, , , 과 비교 가능, Sodium. .

참고문헌

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