중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

요약

이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행 하려면

초록

말라 microfilaments, microtubules, 및 중간 필 라 멘 트 (IF)의 구성 골격 세포 모양, 극성, 및 운동 성의 제어에 핵심 역할을 한다. 말라와 microtubule 네트워크의 조직을 광범위 하 게 공부 하지만 IFs의 하지 아직 완전히 특징 이다. IFs는 평균 직경 10 nm의 형태로 세포 세포질에 걸쳐 확장 네트워크가 있다. 그들은 말라와 microtubules 분자 모터와 cytoskeletal 링커를 통해 물리적으로 연결 됩니다. 이 꽉 협회는 대부분의 세포 기능에 필요한 3 개의 cytoskeletal 네트워크의 조정된 규칙을 보장 하는 규제 메커니즘의 핵심 이다. 그것은 따라서 IFs 혼자와 각각 다른 cytoskeletal 네트워크의 함께 시각화 중요 합니다. 그러나, 만약 네트워크는 특히 glial 세포에서에서 대부분 셀 형식에 매우 조밀한 해상도 표준 형광 현미경 검사 법으로 달성 하기 매우 어려운 게 (~ 250의 해상도 측면 nm). 직접 확률적 광학 재건 현미경 (dSTORM) 한 작업량의 측면 해상도 증가 허용 하는 기술 이다. 여기, 우리가 측면 dSTORM 해상도 조밀한 조직 IF 네트워크의 그리고, 특히,의 경우 번들 microtubules를 둘러싼 해결을 보여줍니다. 이러한 꽉 협회는 이러한 두 네트워크의 조정된 규칙에 참여, 설명 어떻게 vimentin IFs 템플릿 및 microtubule 조직 안정화로 microtubule 종속 기공을 인신 매매에 영향을 미칠 수. 더 일반적으로, 우리는 듀얼 컬러 dSTORM 기술로 두 개의 cytoskeletal 컴포넌트의 관찰 그들의 상호적인 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하는 방법을 보여줍니다.

서론

세포질 중간 필 라 멘 트 (IFs)는 10 nm 직경 호모-또는 heteropolymers의 경우 단백질의 세포 유형 특정 하위 집합입니다. IFs는 세포 기능 세포 운동 성, 확산 및 스트레스 응답의 큰 범위에 참여합니다. 그들의 주요 역할은 90 이상 인간의 질병 직접 경우 단백질;에 돌연변이 의해 발생 하는 사실에 의해 강조 표시 예를 들어, 경우 구성에서 변경 함께 종양의 성장과 확산^1,2,3. 3 골격 시스템 제어 셀 분극, 부문 및 마이그레이션^2,3같은 세포질 기능을 공동에서 작업 하는 증거가 성장 하고있다. 공간 구조와 기능 간의 밀결합을 이므로 다른 필 라 멘 트와 함께 IF의 구조 조직에 대 한 통찰력을 얻을 하 고 cytoskeletal 잡담 이해 결정적 이다. 이 문서에서는 수퍼 해상도 기술 듀얼 컬러 dSTORM (직접 확률적 광학 재건 현미경)⁴ 와 어떻게 경우 사이 상호 작용을 조사 하는 데 사용은 및 microtubules 수행 하는 프로토콜에 고정, 교양 2 차원 (2D)에 셀입니다.

지난 여러 슈퍼 해상도 기법 개발 되었습니다 10 년, 그리고 거기 발견 2014⁵화학에 있는 노벨상의 근원에 있었다. 이러한 모든 기술 중에서 거짓말 같은 팜⁶ (Photo-Activated 지역화 현미경) photoswitchable 형광 단백질을 사용 하 여 폭풍⁷ 쌍의 fluorophores 또는 dSTORM^{4 단일 분자 지역화 기반 방법} 기존의 fluorophores와. 이러한 모든 메서드는 (i) 형광 기자 들의 대부분의 스위치 "off" 상태로 구성 된 동일한 원칙을 기반 으로"(비-형광), (ii)는 형광으로 그들의 부분 집합의 확률적 활성화 상태 지역화 하기 위해 그들의 공간 위치 나노미터의 정확도, 및 (iii) 가능한 fluorophores의 많은 하위 집합을 활성화 하려면이 과정의 반복입니다. 20 ~ 40까지 가로 해상도 제공 하는 활성화 된 분자의 모든 지역화를 사용 하 여 최종 이미지 재구성 nm. 팜/폭풍을 수 있도록 여러 상용된 광학 시스템 이제 일상적인 실험에 대 한 생물학에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기, 하나의 같은 시스템 microtubules의 IFs 구조 협회 연구 사용 되었다. 모든 단일 분자 지역화 기반 방법 중, 듀얼 컬러 dSTORM 기술을 선정 되었다, 그것은 매우 얇은 플레이트 영역을 관찰 하는 데 적합 하기 때문에 (< 1 µ m) 부착 셀의 이미지 해상도의 상당한 향상을 제공할 수 있습니다 최소한의 시간과 돈을 투자입니다. 실제로, dSTORM 면역 형광 세포 얼룩을 정기적으로 사용 하는 표준 유기 염료와 호환 되는 매우 편리 하 고 다양 한 기술입니다.

듀얼 컬러 dSTORM 실험 조건을 최적화 하는 제한 된 경우에 특히 두 염료 선택된 버퍼에 제대로 깜박일 수 있습니다 하는 데 필요한 하나의 색상 dSTORM 이미지 fluorophore Alexa647⁸를 사용 하 여 얻기 위해 상대적으로 간단한 동안, 레이저 파워입니다. 우수한 논문 dSTORM^{9,10,11,,1213}, 멀티 컬러 이미지를 설정 하는 방법에 사용할 수 있으며 이러한 서류 자세히의 가능한 소스 설명 유물과 저하 이미지 해상도 그들을 극복 하는 방법. 이 문서, 셀 고정, immunostaining, 샘플 준비 최적의 실험 조건, 이미지 수집 및 이미지 재구성에서는 밀도 세포질 경우 네트워크와에 microtubules의 이미지 순서 설명 듀얼 컬러 dSTORM와 glial 세포입니다. 간단히, Chazeau 외¹² 에서 설명 하는 추출/고정 방법을 glial 세포에 적응 되었고 후 정착 단계, 최적화 된 항 체 농도와 사용, 10 m m 폭풍 버퍼 MEA 뎀시⁹ 외 인에 설명 된 실험 설정 및 샘플 형식에 대 한 최적의 발견.

Glial 세포는 주로 세 가지 유형의 경우 단백질을 표현: vimentin, nestin와 GFAP (glial 산 성 fibrillary 단백질). 이 3 개의 단백질은 이다¹⁴공동 유해를 표시 했다. 우리는 이전 슈퍼 해상도 구조화 조명 현미경 (SR SIM)이 세 경우 단백질 같은 단일 경우 필 라 멘 트에 찾을 수 있습니다 그리고 glial 세포 ¹⁵에서 비슷한 분포 및 역학 표시는 사용 하는 것을 보였다. 3 IF 단백질 사이의 유사성 때문 vimentin 얼룩 사용 되었다 기자로 서 모든 경우에 네트워크에 대 한. DSTORM를 사용 하 여, 우리 어떻게 회절 가능 했다 microtubules 따라 경우 양식 번들 현미경 기법¹⁵제한 해결 관리. 이러한 관측 vimentin IFs 템플릿 microtubules 수 하는 방법을 이해 하 고 셀 마이그레이션¹⁶극성 축 유지 보수 홍보 그들의 성장 궤도 조절 하는 데 도움이 됩니다. 슈퍼 해상도 이미지 두 cytoskeletal 서브 시스템의 상호 작용에 중요 한 정보를 제공 하 고 공간 협회와 셀 형 특정¹⁷수 있는 로컬 기능 사이의 링크에 대 한 통찰력을 가져. 일반적으로, 밀도 및 특이성 좋은 immunostaining 조건에 도달 하 듀얼 컬러 dSTORM cytoskeletal 요소 또는 다른 유형의 세포, 사이 누화를 공부에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 astrogliosis 중 고 세포종에서 골격 변화 특성을 더 도움이 될 것입니다, 그리고 가장 일반적인 및 가장 악성 종양의 경우 단백질의 표정은 이다 중앙 신경 변경 ^{18 19,,2021}.

프로토콜

1. Coverslips 준비 (1 일, 30 분)

1. 18 m m nº1.5H (5µm + 170 µ m) 유리 coverslips를 플라스틱 선반에 놓습니다.
2. 랙 아세톤과 5 분 담가 가득 100 mL 비 커에 넣어.
3. 100 mL 비 커에 전송 랙 절대 에탄올 5 분 담가 가득합니다.
4. 절대 에탄올 가득한 새로운 100 mL 비 커에 선반을 전송 하 고 초음파 청소기 장치에서 비 커를 배치 (재료의 표 참조) 실내 온도에. "에" 누르고 10 분 기다립니다.
5. 층 류 흐름 후드 랙 넣고 coverslips 건조 또는 필터링 된 공기 흐름으로 coverslips를 건조 하 게.
6. 플라즈마 클리너 장치에 coverslips와 선반을 넣어. 진공 펌프에 스위치, 문을 닫고, 진공 청소 후 1 분 사용 된 coverslips에 대 한 플라즈마에 스위치를 3 분까지 기다립니다. 그들을 저장 하지 마십시오.

2. 셀 도금 (1 일, 20 분)

1. Glial 세포 라인 U373 최소 필수 매체 (MEM)에 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스, 및 1% 비필수 아미노산 10 cm 직경 플라스틱 페 트리 접시에 성장.
2. 층 류 흐름 후드 12-잘 접시에 깨끗 한 유리 coverslips를 놓고 잘 당 preheated 셀 매체의 1 mL를 추가 합니다.
3. (37 ° C, 5% CO₂) 셀 인큐베이터에서 세포를 포함 하는 접시를 가져가 라.
4. 매체를 제거 하 고 10 mL PBS를 추가.
5. PBS를 제거 하 고 추가 1 mL 0.05% 트립 신-EDTA.
6. 다시 2-3 분 인큐베이터에에서 접시를 놓습니다.
7. 접시에 37 ° C에 미리 데워 따뜻한 매체의 10 mL을 추가 하 고 셀을 resuspend.
8. 종자는 coverslips를 포함 하는 12-잘 접시에 잘 (셀 ~ 150 µ L) 당 약 100 000 셀입니다.
9. 셀 확산 수 있도록 적어도 6 h (또는 숙박)을 기다립니다.

3. 셀 고정 (주 2 일 2 시간)

1. 80mm 파이프, 7 m m MgCl₂, 1mm EGTA, 150 mM NaCl, 골격 버퍼를 준비 하 고 6.9에 산도 조정.
2. PBS 한번 셀을 씻어.
3. PBS를 제거 하 고 부드럽게 잘 추출/고정 솔루션의 당 1 mL을 추가 (0.25%도, 0.3% 골격 버퍼에 Triton X-100) 37 ° c.에 preheated
4. 60에 대 한 품 어 실 온에서 s.
5. 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 잘 데워와 갓 4 %PFA (paraformaldehyde) 솔루션의 골격 버퍼에 희석 당 1 mL를 추가 합니다.
   주의: 장갑을 사용 하 고 화학 후드 작동.
6. 다시 10 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서에서 12-잘 접시를 놓습니다.
7. 제거는 PFA 고 잘 당 PBS의 3 mL를 추가 합니다.
   참고: 장갑과 화학 후드 작업과 재활용된 PFA 특정 빈에 넣어.
8. PBS로 2 회 세척.
9. PBS를 제거 하 고 글에서 나오는 autofluorescence을 냉각 하기 위하여 PBS에 희석 갓된 10 mM NaBH₄ 솔루션을 추가 합니다.
10. 실 온에서 7 분 동안 품 어.
11. 특정 빈에 재활용된 NaBH₄ 를 넣어.
12. PBS로 세척 몇 번이 고 5 분입니다.
13. PBS를 제거 하 고 차단 솔루션 (PBS에 5 %BSA 솔루션)를 추가 합니다.
14. 1 시간 실 온에서 (또는 하룻밤 4 ° C에서)에 대 한 품 어.
    참고: 골격 버퍼는 몇 달 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다. PFA, NaBH₄ 도 (후드, 장갑, 그리고 특정 재활용 쓰레기통) 특별 한 주의 함께 처리 되어야 합니다. 솔루션 추가 하 고 셀의 무결성을 유지 하기 위해 부드럽게 제거 한다. 그것은 건조 하는 셀을 못하게 하는 것이 중요입니다.

4. Immunostaining (일 2, 5 h)

1. 안티-vimentin 및 안티 tubulin 차단 솔루션에서 1: 500 희석 사용 하 여 기본 항 체의 솔루션을 준비 합니다.
2. 100 µ L 방울 희석된 주 항 체를 파라핀 영화 레이어에 넣고 아래쪽으로 직면 하는 세포와 그들의 위에 coverslips를 배치.
3. 2 헤 PBS 가진 coverslips 12-잘 접시에 가득 넣어에 대 한 1 차 항 체와 세포를 품 어. 5 분 궤도 셰이 커에 실 온에서 PBS에 각 시간에 대 한 세 번 린스.
4. 한편, 반대로 마우스 Alexa647과 반대로 쥐 Alexa555 차단 솔루션에서 1:1, 000의 희석 사용 하 여 보조 항 체 솔루션을 준비 합니다. 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체와 세포를 품 어. 4.2 처럼 진행 합니다. 빛 으로부터 세포를 보호합니다.
5. PBS는 coverslip 다시 12-잘 접시에 가득 합니다. 5 분 궤도 셰이 커에 실 온에서 PBS에 각 시간에 대 한 세 번 린스. PBS를 제거 하 고 PBS 섞인 0.1 µ m tetraspeck 구슬의 1 µ L의 0.5 mL를 추가 합니다.
6. 30 분 PBS와 린스에 대 한 궤도 통에 우물을 넣어. PBS를 제거 하 고 PBS에 4 %PFA 솔루션 5 분에 대 한 셀을 품 어. PBS에서 몇 번이 고 씻어.
   참고: 고정된 셀 몇 4 ° c.에 PBS에 주 동안 저장 될 수 있다 Immunostaining는 마지막 순간에 이루어져야 한다.

5. 샘플 준비 (3 일, 5 분)

1. MEA (시스테, 1 M, pH 8.3), 포도 당 산화 효소 (100 x, 50 mg/mL), 카 탈 라 제 (500 x, 20 mg/mL)의 aliquots는 얼음 바구니에 넣어.
2. NaCl Tris 버퍼의 50 mL를 준비 (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) 포도 (100 mg/mL)의 10% 보충.
3. 10% 포도 당으로 NaCl Tris 버퍼에 10mm MEA, 0.5 mg/mL (75 U/mL) 포도 당 산화 효소, 40 µ g/mL catalase (80-200 U/mL)와 이미징 직전 버퍼 이미징의 1.2 mL를 준비 합니다.
4. 마그네틱 샘플 홀더 (예: chamlide 챔버)에 레이블이 지정 된 셀을 포함 하는 coverslip 탑재 하 고 챔버를 완전히 채우기 위해 이미지 버퍼를 추가 합니다. 는 뚜껑을 넣고 이미징 버퍼와 뚜껑 사이 아무 공기 방울이 있는지 확인.
5. 절대 에탄올 샘플의 바닥을 청소 하 고 누출 하지 않습니다 확인 합니다. 그리스를 사용 하 여 필요한 경우 샘플 홀더를 제대로 인감.
   참고: 1 M 재고 MEA 솔루션 (pH 8.3 HCl을 사용 하 여 조정), 50 mg/mL에서 포도 당 산화 효소의 물에 20 mg/mL에서 catalase의 재고를 준비, aliquots 만들고 MEA 및 포도 당 산화 효소 및 catalase의 연도 대 한 최대 한 달 동안-20 ° C에서 저장. Aliquots을 refreeze 하지 마십시오. NaCl Tris 버퍼를 사전에 준비 하 고 몇 달 동안 실내 온도에 저장. 실험 (단계 5.3)의 날에 포도 당을 추가 합니다.

6. 이미지 수집 (3 일, 셀 당 ~ 1 h)

1. 현미경에 전환 합니다. 수집 소프트웨어에 스위치와 시스템 시작을 누릅니다.
2. 설치 관리자 도구 그룹에서 인수 탭 확장 이미징 설치 도구를 선택 합니다. 인수의 레이저 WF (와이드 필드) 모드를 선택 합니다. 100 X 나 1.46 목표를 선택 합니다. TIRF u-HP 모드 조명 되 고 보기의 필드를 줄이기 위해는 겨냥 틀을 사용 하 여 선택 하 고 더 작은 영역으로 레이저 에너지를 집중. optovar 1.6 x 렌즈 100nm의 픽셀 크기를 사용 합니다.
3. 시계열 도구를 선택 하 고 시간 경과 50 000 프레임 및 프레임 사이의 0.0 ms를 설정. 인수 매개 변수 도구 그룹에서 채널 도구를 확장 하 고 "모두 보기"를 선택 하십시오.
4. Alexa647 트랙 설정: 여기 라인 레이저는 642와 405 그들을 수락 확인. 영상 설정에서 "655 LP" 방출 필터를 선택 합니다. "647을"를 이름을 바꿉니다.
5. 클릭 다른 가벼운 패스를 추가 하 고 선택 모드를 채널 도구에서 '+'에 "스위치 트랙 모든: 프레임" 이미지 설치 도구에서. 561 488, 405 레이저 라인을 확인 하 고 그들을 설정 하려면 수락. 선택은 "혈압 570-650 + LP750" 방출 필터 및 optovar 렌즈 1.6을 사용 하 여 x. TIRF-uHP 모드 선택 되어 있는지 확인 하십시오. 트랙을 "555"의 이름을 바꿉니다.
6. 획득 모드 도구를 선택 하 고 200 x 200 픽셀 프레임 크기를 설정 합니다. 초점 장치 및 전략 도구를 선택 하 고 (경우 초점 잠금 시스템) 1 000 프레임에 확실 한 포커스를 설정.
7. 목표에 석유를 넣고 샘플을 넣어. 찾기 탭을 선택 하 고 형광 램프의 셔터를 엽니다. 초점을 찾을 하 고 접 안 렌즈를 사용 하 여 이미지를 찾습니다. 조이스틱을 사용 하 여 보기의 필드의 중앙에 넣어.
8. 획득 모드 돌아가 인수 탭을 선택 합니다. "647" 트랙 선택, 642-레이저 전력 0.2%로 설정, 0 405-레이저 전원 설정, 노출 시간 설정 50 ms 및 50의 이득. 연속 수집 모드 관찰 화면에 셀을 선택 합니다. 초점을 조정 합니다. 보기의 필드에 하나 이상의 tetraspeck 구슬 있는지 확인, 필요한 경우 그들을 보고 대비를 증가. 자동-스케일 모드를 사용 하 여 디스플레이 대 한. Vimentin 네트워크의 넓은 필드 epifluorescence 이미지를 스냅 클릭 하 여가지고 고 그것을 저장 합니다. TIRF 조명을 확인 하려면 TIRF 클릭, 조명의 동종 분야 하 고 그것을 저장 하는 데 필요한 경우 조명 겨냥 틀의 각도 조정 합니다.
   참고: TIRF와 epifluorescent 이미지는 높은 품질의 원시 데이터 수집을 시작 하기 전에 중요 하다. 불연속, 비균일 레이블이 필 라 멘 트 품질 dSTORM 이미지 상승을 줄 것 이다.
9. "647" 트랙의 선택을 취소 하 고 선택 하 고 확인 "555" 트랙. Microtubule 네트워크의 epifluorescence 이미지 가져가 라 하 고 그것을 저장 합니다. TIRF 이미지와 너무 합니다.
10. "555" 트랙을 선택을 취소, 선택 하 고 "647" 트랙을 확인 다음 연속. 0으로 이득의 넣고 10 양 노출 시간 설정 642 nm 레이저 전원 100% 어두운 상태로 (~ 2 kW/cm²) Alexa647 염료의 대부분을 펌프. 일단은 fluorophores 점멸 시작, 15 ms에 노출 넣고 300를 얻을. 조명의 TIRF 모드를 선택 합니다. 자동 규모 없이 범위 표시 모드를 사용 하 여 단일 분자 신호 (빨간 색으로 표시 된) 카메라를 포화 하지 않습니다 확인. 채도 사라질 때까지 그 경우에 이득 감소. Tetraspeck 구슬 수집의 시작 부분에 포화 상태로 유지 됩니다. 셀의 연속 관측을 중지 하려면 중지 를 누릅니다.
11. 온라인 처리 도구를 확장 하 고 온라인 팜 처리 중 폭풍 이미지 시각화를 확인. 다음 매개 변수를 사용 하 여: 피크 마스크 크기 (9 픽셀 직경) 및 잡음에 피크 강도 대 한 6 9. 논문 매개 변수 처리 (충분히 밝고 하지 중복)에 고려는 분자를 정의 합니다. PAL-통계 도구에서 플롯 유형 선택: 히스토그램, 그리고 히스토그램 소스: 정밀도. 수집을 시작을 누릅니다.
12. 중, 촛점 (아무 초점 잠금 장치 경우) 필요한 경우. (노출, 레이저 힘) 매개 변수를 조정 (0.001%에서 시작) 단일 분자 사이 1 µ m의 최소 거리 fluorophores의 중간 밀도 유지 하는 405 nm 레이저 선 결국 전환 (> 9 픽셀 100 nm, 피크 마스크 크기) ( 그림 1A-B). 분자 밀도 조금 너무 높은 경우 TIRF 대신 조명 힐로 (높은 경향 및 광학 적 층 시트) 모드를 사용 합니다. 이 레이저 힘 20% 증가 합니다. 주위에 또는 10 아래 아래 복원된 이미지 히스토그램에 지역화 정밀도의 최대 중심으로 확인 nm.
    참고: 시간과 함께, 분자 수가 감소 하는 일반적으로 그리고 405 nm 레이저 파워를 따라 천천히 증가. 지역화 정밀 (슈퍼 해상도 이미지 아래에 표시 되는 히스토그램) 피크 10 아래 가능한 한 많이 감소 하는 목표는 nm (그림 1C). 필요한 경우, 너무 많은 밝은 구슬 필드에 존재 하는 경우 팜 이미지의 명암을 증가.
13. 10⁶ 국부 (일반적으로 40 000 프레임) 후에 도달 되는 영화를 막으려고 중지 를 누릅니다. 0.2%로 다시 레이저를 넣어 (642 nm)와 0 (405 nm). .Czi 형식으로 폭풍 수집의 원시 데이터를 저장 합니다. 트랙 "647" 채널 도구에서 선택을 취소 합니다 선택 하 고 트랙 "555" 확인.
14. 25 ms 노출 시간을 설정 하 고 0을 얻을. 연속 버튼 누르고 펌프 Alexa555 염료 어두운 상태 (~ 2 kW/cm² 각)을 100% 모두 561 488 레이저 설정. fluorophores 점멸, 250, 이득을 넣어 시작 힐로 조명 모드를 사용 하 고 단일 분자 범위 표시 모드와 카메라를 포화 하지 마십시오 확인. 그 경우는 이득 감소. 중지를 누릅니다. 488-레이저 파워 50%를 감소.
15. 수집을 시작을 누릅니다. 중, 채도의 제한에서 반드시 이득을 점차적으로 증가. 405 nm 레이저 파워 시야 (참조 단계 6.18)에 단일 분자의 중간 밀도 유지를 단계적으로 증가. 405 레이저 15% 보다 높은 경우 488 레이저 파워를 20-30% 감소. 그런 다음 점차적으로 분자를 가능한 한 빨리 점멸 유지 하기 위해 405 레이저 라인을 증가 하는 동안은 488 감소. 최대한 강도로 561 여기 레이저와 결합 488 레이저 라인 모두 온 / 오프는 fluorophores의 405 레이저 라인만에 비율을 증가 하는 반면 증가 한다.
16. 아니 더 많은 분자는 깜박이 이상의 500 000 있어 (후 약 20 000 프레임)에 도달 된 수집 이상 중지 합니다. .Czi 형식으로 폭풍 수집의 원시 데이터를 저장 합니다.
    참고: 항상 더 높은 파장을 피하기 위해 표백 (또는 활성화) 다른 색상의 시작 합니다. 그것은 정기적으로, 예를 들어 이미지 버퍼를 변경할 수 때문에 chamlide 챔버는 봉인 하지 다른 버퍼 조건을 테스트 합니다. 488 레이저 라인을 사용 하 여 알 렉 사 555 염료를 고갈 하 561 레이저 파워 (100 mW 레이저)와 제한 된 경우에 필요 하다.

7. 이미지 재건 (5 분)

1. PAL-드리프트 도구에서 8의 최대 크기를 가진 자동 세그먼트 모델 기반 보정 유형을 사용 합니다. 눌러 적용 여러 번 연속에서 드리프트 해결 될 때까지. 이 모델 기반 보정 알고리즘 수정 드리프트 교차 상관 분석에 따라 적용 됩니다.
2. PAL-필터 도구를 사용 하 여 분자를 현지 최고의 했다만 선택 하 여 폭풍 이미지의 모양을 향상 시킬. 예를 들어 30 지역화 정밀도 제한 및 120-180 nm PSF.
3. 1 PSF. 렌더링 선택 자동 동적 범위 값이 95 %HR 렌더링 자동 동적 SWF 90% 값의 확장 요소와 가우스 디스플레이 모드 뿐만 아니라 PAL 렌더링 도구 5 또는 10 nm의 픽셀 해상도 사용 합니다. 최고 품질의 렌더링을 선택 합니다.
4. 처리 탭 (후 처리 모드)의 팜 메뉴에서 팜 변환을 선택 합니다. 선택 하 고 다음 적용을 누릅니다. 형식으로 만든된 이미지를 저장 합니다. LSM (그리고 하지.czi, 매우 중요 한).
   참고: 이미지 재구성 수집 또는 수집 소프트웨어의 이미지 처리 모드를 사용 하 여 저장 후 즉시 수행할 수 있습니다. 오프 라인 모드를 후 처리에서 매개 변수 (피크 마스크 크기, 잡음에 피크 강도)의 값이 다른 스택 분석 가능 하다. 항상 "겹치는 분자 취소" 하지 "평균 지역화 하기 전에"를 선택 합니다.

8. 폭풍 이미지 (10 분)의 지역화 정밀 추정

1. 폭풍 원시 데이터를 열고 탭 팜 방법 선택 하 고 손바닥 을 다시 처리 하는 이미지를 사용 합니다. 선택키를 누릅니다.
2. 9와 6 (또는 이미지에 대 한 선택 매개 변수)의 소음에 피크 강도 피크 마스크 크기를 사용 하 여 재구성을 시작 하려면 적용 을 누릅니다.
3. 사각형 그래픽 도구를 선택 하 고 단일 분자를 유리 표면에 주위 raw 이미지에 사각형을 그립니다. 일반적으로 몇 가지 단일 분자 거기 있다.
4. 프레스 적용 다시, 그리고 사각형 영역 내에 있는 분자 분석.
5. PAL-통계 도구에서 플롯 유형 선택: 막대 그래프 및 히스토그램 소스: 위치 또는 Y 위치, 위치 막대 그래프를 시각화.
6. 이미지 아래 왼쪽에 있어 목록으로 테이블을 저장 합니다.
7. 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 만들 히스토그램의 X 및 Y 위치 (그림 1D).
8. 가우스에 의해 배포판에 맞게 하 고는 σ_X , σ_Y 값을 저장 합니다. 지역화 정밀 σ_SMLM (σ_{X *}σ_Y)에 의해 추정 된다 ^0.5.
9. 가능한 많은 분자에 8.3-8.8 단계를 반복 하 고 평균 σ_SMLM

9. 채널 등록 (5 분)

1. 피지 (이미지 J) 소프트웨어를 사용 하 여 각 색상의 폭풍 이미지를 엽니다.
2. 각 tetraspeck 구슬의 위치를 측정 하기 위해 자동 선택 도구 선택 합니다.
3. 각 구슬에 대 한 X 및 Y 변화를 계산 하 고 그들을 평균.
4. "변환" 명령을 사용 하 여 계산으로 두 번째 이미지 번역 X 및 Y 교대.
5. 병합 채널 명령을 사용 하 여 두 이미지를 병합 합니다.

결과

현미경 50 mW 405 nm 및 장비 100 mW 488, 561와 642 nm 고체 레이저, 한 EMCCD 512 x 512 카메라, 알파 계획 apo는 100 X / 1.46 객관적이 고 밴드 통과 570-650 / 긴 655 방출 필터를 통과 아래 제시 하는 대표적인 결과 위해 사용 되었다.

그림 1A raw 이미지 수집 하는 동안 사용 해야 하는 잡음 비율 분자 밀도 신호의 예를 제공 합니다. 좋은 품질의 이미지 이웃 분자 사이 ~ 1 µ m의 최소와 함께 얻을 수 있습니다. 좋은 깜박이 조건에 fluorophores 하나의 프레임에 존재 해야 합니다. 이미지 버퍼 조건 (pH, 감소 요원, 산소 시스템 청소)를 조정 하는 데 필요한 좋은 점멸 및 영향에-및 오프-요금 fluorophores, 따라서 ...

토론

프로토콜의 중요 한 단계

선물이 여기 microtubules의 dSTORM 이미지에 유물과 glial 세포에서 IFs를 최소화 하는 프로토콜. 샘플 준비 및 이미징의 모든 단계에서 아티팩트를 만들 수 있습니다: 고정, 차단, immunolabeling, 드리프트, 비-최적의 깜박이 조건²³중. 우리는 가장 중요 한 단계 아래 목록.

표면에 fluorophores의 비 특정 바인딩 제한 하는 중요 한 단계는 청소는 coverslips 및 따라서 dSTORM 이미지에 배경 잡음을 제한.

PFA (paraformaldehyde) (n ° 3 단계)와 트리톤, 그리고 정착의 혼합을 사용 하 여 추출 및 고정 솔루션의 단계 샘플을 수정 하는 것이 좋습니다. 기정 프로토콜 Chazeau 외

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
최소 필수 배지(MEM)	Gibco	41090-028	세포 배양
비필수 아미노산	Gibco	1140-050	세포 배양 1/100e
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140-122	세포 배양 1/100e
Fœ tal 소 혈청	Gibco	10270-106	세포 배양 1/10e
0,05 % 트립신-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	세포 배양
PBS 10x	피셔 과학	11540486	세포 배양
커버슬립 18 mm n° 1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	커버슬립
파라포름알데히드(PFA) 용액	Sigma	F8775	세포 고정
글루타르알데히드	Sigma	G5882	세포 고정
트리톤 X100	Sigma	T9284	비이온 계면활성제. 세포 고정에 사용
수소화붕소 나트륨 (NaBH4),	시그마	452904-25ML	세포 고정
BSA,	시그마	A7906	샘플 패시베이션, PBS에서 3 %,
단클론 항 비멘틴 (V9) 항체, 마우스에서 생성	시그마	V6630	1 차 항체
쥐, 안티 알파 튜불린	Biorad	MCA77G	1 차 항체
염소 항-쥐 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 555	Fisher 과학	10635923	2차 항체
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 647	Fisher 과학	10226162	2차 항체
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µ m, 형광 블루/그린/오렌지/다크 레드	Fisher scientific	T7279	형광 비드
Chamlide 마그네틱 챔버	라이브 셀 기기	CM-B18-1	마그네틱 샘플 홀더, 최대 용량 1,2 mL
시스테아민(MEA)	Sigma	30070	점멸 완충액용
Aspergillus niger	Sigma	G0543
포도당	시그마
소의 간에서 추출한 점멸 완충액 카탈라아제	그마	C9322	점멸 완충액용
트리스(트리즈마)	시그마	T1503	점멸 완충액용
Wash-N-Dry 커버슬립 랙	시그마	Z688568
파라필름	시그마	P7793-1EA	파라핀 필름
초음파 세척기	피셔 사이언티픽	15-335-6
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