Method Article

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

DOI:

10.3791/57092

⸱

December 12th, 2017

 , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemoreceptors와 겨냥 한 ligand 특이성의 분자 기준의 구조 연구의 자연 ligands의 밀리 그램 양의 순수 하 고, 접힌 ligand 바인딩 도메인의 생산에 의해 크게 촉진 수 있습니다. Heterologously의 대장균 (대장균) 박테리아 chemoreceptors periplasmic ligand 바인딩 도메인을 자주 표현 하려고 포함 시체에 그들의 타겟팅에 발생. 여기, 메서드 포함 시체, refolding와 정화, Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3의 periplasmic dCACHE ligand 바인딩 도메인을 사용 하 여 예를 들어에서 단백질 복구를 위해 제공 됩니다. 접근 포함를 쪼갤와 관심사의 단백질의 표현을 그의6-태그, 격리 및 요소 중재 solubilisation 포함 시체, 친화성 크로마토그래피에 의하여 요소 고갈, 그리고 정화에 의해 refolding 단백질 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 따라. 원형이 색 성 분광학은 순수 단백질의 접힌된 상태를 확인 하는 데 사용 됩니다. 그것은이 프로토콜은 일반적으로 밀리 그램 양의 dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인의 가용성과 crystallisable 형태로 다른 세균성 chemoreceptors의 생산 하는 데 유용 증명 되었습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemotaxis 및 운동 성 세균성 식민 및 호스트1,2,3의 내 습을 홍보 함으로써 Campylobacter jejuni 병 인에 중요 한 역할을 보여왔다. 화학 신호에 의해 유도 chemotaxis 박테리아를 성장 위한 최적의 환경으로 이동할 수 있습니다. 이 프로세스는 불린다 chemoreceptors, 단백질 또는 트랜스듀서와 같은 단백질 (Tlps)의 집합에 의해 세포내 및 환경 화학 신호의 인식 포함 됩니다. 대부분 chemoreceptors는 바인딩 도메인 (LBD), 막 횡단 도메인 및 세포질 신호 도메인, 후자는 신호를 전송 하는 신호 cytosolic 단백질 상호 작용 하는 extracytoplasmic ligand 단백질 막 포함 하는 flagellar 모터4,5,,67.

11 다른 chemoreceptors C. jejuni 게놈4,8에서 확인 되었습니다. 날짜 하려면, 이러한 chemoreceptors의 일부 특징 되어 있다 그리고 Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, Tlp1113 의 리간드 특이 알려져 있다. 이 종에서 나머지 chemoreceptors 그리고 다른 박테리아에 수많은 chemoreceptors의 자연 ligands의 접힌 및 매우 순수한 재조합 chemoreceptor LBDs14, 의 생산에 의해 크게 촉진 될 수 있다 15 , 그러나 16., heterologously 대장균 세균성 chemoreceptors의 periplasmic LBDs를 자주 표현 하려고 포함 시체17,18,19로 그들의 대상으로 발생 . 그럼에도 불구 하 고,이 현상을 수 용이 하 게 쉬운 격리 및 복구 단백질의 손에. 여기, 메서드 포함 시체에서 단백질 복구, refolding와 정화, 예를 들어 periplasmic LBD의 C. jejuni chemoreceptor Tlp3 사용 하 여 제공 됩니다. 이 예제에서는 Tlp3 LBD 풍부 하 게 2 분 히스티딘 kinases와 원핵생물20,21, chemoreceptors에 있는 감지 영역의 dCACHE 가족20 에 속하기 때문에 선정 되었다 22 , 23.

이 방법에서는, pET151/D-이동 벡터에 따라 식 구문 통합 N 맨끝 그의6설계 되었습니다-태그 뒤에 담배 엣지 후속 태그 제거19에 대 한 바이러스 (TEV) 효소 분열 사이트. 프로토콜은 단백질 overexpression을 대장균, 격리 및 포함 몸과 요소 고갈에 의해 refolding 단백질의 solubilisation 중재 하는 요소에 설명 합니다. Refolding, 다음 샘플은 선택적 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하 고 있다. 순화 된 단백질의 접힌된 상태는 원형이 색 성 분광학을 사용 하 여 확인 됩니다. 이것은 이전 복구 하 고 다른 chemoreceptor, 헬리코박터 파일로리 TlpC19의 LBD 정화 개발 된 방법의 수정 된 버전. 이 절차는 그림 1에서 요약의 단백질 순수성을 가진 세균성 문화의 1 L 당 순수 하 고, 태그 Tlp3 LBD의 10-20 밀리 그램 생성 > 90 %SDS 페이지 예상된.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 표현의 그의6-Tlp3- 대장균 에 LBD

  1. 50 µ g mL-1 암 피 실린 BL21 Codon 플러스 (DE3)를 포함 하는 메 마른 Luria Bertani (파운드) 국물의 150 mL 접종-RIPL 셀 그의6의 표현에 대 한 pET151/D-이동 벡터와 변형-Tlp3-LBD (아미노산 잔류물 42-291), 그리고 품 어 그것 통 (궤도 직경, 25 m m)에 37 ° C에서 200 rpm으로 하룻밤.
  2. 포함 하는 살 균 파운드 국물과 50 µ g mL-1 암 피 실린의 800 mL 6 2 L 삼각 플라스 크를 준비 합니다. 야간 문화 단계 1.1에서에서 얻은 20 mL와 함께 각 플라스 크 예방 600 nm에 도달 0.6에서 광학 밀도까지 200 rpm에서 연속 떨고와 37 ° C에서 그들을 품 어.
  3. 1 mL aliquot 펠 릿 벤치탑 원심 분리기 (13000 x g, 4 ° C, 10 분)를 사용 하 여 플라스 크 (uninduced 컨트롤 샘플) 중 하나에서 고는 상쾌한 삭제. 이후 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 세균성 펠 릿을 저장 합니다.
  4. 1mm 이소프로필 β-D-thiogalactoside (IPTG)의 문화 각 플라스 크에 추가 하 여 단백질 발현을 유도. 추가 4 h 200 rpm에서 통에 37 ° C에서 플라스 크 배양을 계속 한다.
  5. 4 ° C에서 15 분 동안 5000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 하 고는 상쾌한 삭제.
    참고:이 시점에서 절차 수 있습니다 수 일시 중지-80 ° C 냉장고 저장용으로 셀 펠 릿을 배치 하 여.

2. 절연 및 포함 시체의 변성

  1. 250 mL 비 커에 1.5 단계에서 얻은 하는 모든 셀 펠 릿 전송 및 버퍼 A의 100 mL (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl) 추가. 완전히 (경우 냉동) 해 동, 세포를 허용 하 고 resuspend는 펠 릿. 달리 명시 되지 않는 한 얼음 샘플을 유지.
  2. 세 번 하는 세포를 lyse genomic DNA의 완전 한 전단 고압 균질 화를 통해 resuspended 세포를 전달 합니다.
  3. 4 ° c.에 15 분 동안 10000 x g에서 lysate 원심 상쾌한 (녹는 분수)의 1 mL 샘플을 수집 하 고 후속 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 그것을 저장. 상쾌한의 나머지를 취소 하 고 얼음에 펠 릿을 놓습니다.
    참고:이 펠 릿은 색상에 흰색 (손상 되지 않은 세포는 갈색의 그늘에서 쉽게 구별할 수 색에) 포함 시체를 포함.
  4. 철저 하 게 20 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 B에에서 포함 시체 펠 릿 resuspend (10 mM Tris HCl pH 8.0, 0.2 m m phenylmethanesulfonyl 불 (PMSF), 1% 트라이 톤 X-100). 이 용이 막 및 막 단백질의 solubilisation. 1-2 분 물의 resuspension 원조 소용돌이.
  5. 원심에서 4 ° C에서 15 분 동안 10000 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
  6. Vortexing 1-2 분 펠 릿 작은 조각으로 나누어져 확인에 대 한 튜브에 의해 철저 하 게 20 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 B에에서 펠 릿을 resuspend. 피펫으로 물의 resuspension 펠 릿을 아래로 샘플.
    참고: 그것은 불순물에서 무료 포함 시체를 철저 하 게 펠 릿을 resuspend 하는 것이 중요입니다.
  7. 2.5 단계를 반복 합니다. 인지는 상쾌한 흐린 색의 반복 단계 2.6 2.5 (순서 대로)는 상쾌한까지 명확 하 고 무색입니다.
  8. Vortexing 1-2 분에 대 한 튜브에 의해 (10 mM Tris HCl pH 8.0 0.2 밀리미터 PMSF) 얼음 처럼 차가운 버퍼 C 20 mL에 펠 릿을 resuspend.
  9. 2.5 단계를 반복 합니다.
  10. 25 mL의 얼음 변성 버퍼 D (10 mM Tris HCl pH 8.0, 8 M 요소, 10 m m dithiothreitol (DTT), 0.2 밀리미터 PMSF) 포함 시체 펠 릿을 해산을 추가 합니다. 1-2 분, 또는 펠 릿은 작은 조각으로 부 러 때까지 vortexing에 의해 철저 하 게 resuspend.
  11. 혼합 4 ° c.에 30-120 분 30 rpm의 회전 속도와 축 회전에 의해 서 스 펜 션
  12. 30000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리에 의해 변성된 단백질 해결책을 명확히는 상쾌한 얼음에 놓고는 펠 릿을 삭제 합니다.
  13. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 24 SDS 젤 분석을 위한 약 수 고-20 ° c.에 그것을 배치합니다
    참고:이 시점에서, 절차 스냅 어 aliquoted 샘플 액체 질소에 의해 일시 중지 될 수 및 스토리지-80 ° C에서 그것을 유지.

3. 단백질을 Refolding

  1. 250 mL의 버퍼 E (3m 우 레 아, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 0.4 M L-아르기닌 monohydrochloride, 20 mM 감소 L-티, 2 mM 산화 L 티) 500 mL 비 커에 준비 하 고 4 ° c.까지 버퍼를 냉각
  2. 그의6을 포함 하는 변성된 단백질 혼합의 60 mg을 추가-Tlp3-LBD 500 rpm에서 버퍼를 교 반 하면서 단계 버퍼 E의 2.13 ~ 250 mL에서에서 얻은. 연속 교 반 24-48 h에 대 한 500 rpm으로 4 ° C에서 refolding 믹스를 품 어. 이 단계에서 최종 단백질 농도 0.2 mg mL-1.
  3. 8-10 L 물통에 버퍼 A의 7 L를 준비 하 고 24-48 h에서 열린다 다음 단계 (단계 3.4)에 대 한 준비에 4 ° C까지 냉각 ( 그림 1의 순서도 참조).
  4. 28mm 비정상적된 직경, 10 m m ethylenediaminetetraacetic 산 disodium 소금 (EDTA-없음2) 200 mL에 12-14 kDa에 분자량 컷오프의 투 석 튜브의 ~ 50 cm 조각 담가 그리고 끓는 때까지 가스 불꽃을 통해 그것을 열. 린스의 ddH2오 200 mL와 함께 투 석 막
  5. 투 석 배관 폐쇄와 함께 투 석 막의 한쪽 끝을 클램프와 혼합물 분리 튜브에 3.2 단계에서 얻은 refolding 250 mL를 전송. 다른 클램프와 오픈 엔드를 닫습니다. 아무 누출 확인 막의 무결성을 확인 하십시오.
  6. 버퍼 A 단계 3.3에서에서 준비 미리 냉각 7 l 투 양동이에 투 관을 놓습니다. 바, 그것은 감동 하는 동안 투 석 튜브를 만지지 것입니다 보장 자기 저 어를 놓습니다.
  7. 500 rpm에서 교 반 계속 4 ° C에서 샘플을 dialyse 하 고 적어도 4 시간 동안 12 h의 버퍼를 변경 합니다. 마지막 버퍼 변경 후 샘플 dialyse 하룻밤을 둡니다.
    참고: 투 석, 동안 요소 (3 M)의 초과 점차적으로 제거 refold를 단백질 수 변성된 단백질 해결책에서. 투 석의 끝에 무거운 단백질 강 수를 관찰할 수 있습니다.
  8. 통에서 분리 튜브를 제거 하 고 500 mL 비 커에 그 내용을 전송. 달리 명시 되지 않는 한 얼음, 단백질 해결책을 유지.
  9. 어떤 침전 된 단백질 제거를 500 mL 유리병에 0.43 µ m 기 공 크기 세포 막을 통해 단백질 해결책을 필터링 합니다.

4. 그의6의 정화-단백질 Immobilised 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 태그

  1. 충전 하 고 equilibrate 5 mL prepacked chelating 열.
    1. 연동 펌프, 공기 연결 튜브에 갇혀 있다는 것을 보장 하는 열을 연결 합니다.
    2. DdH2오의 25-50 mL를 통해 전달 하 여 열을 씻어
    3. 0.1 m M NiCl2 의 3 mL 로드 다음 25 mL ddH2오의를 통해 전달 하 여 열을 충전
    4. (로딩 버퍼, 20 mM Tris HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 이미 20 m m)의 버퍼 F 25 mL와 열 equilibrate
  2. 1 M Tris HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl의 그리고 2 M 이미 재고 솔루션의 2.5 mL 2.5 mL을 추가 하 여 버퍼 F 구성이 3.9 단계에서 얻은 refolded 단백질 견본을 조정 합니다.
  3. (언바운드 단백질) 5 mL/min의 속도 흐름을 통해 삭제에 열에 샘플을 로드 합니다.
  4. 50-100 mL 비 특히 바인딩된 단백질을 통해 흐름 삭제 F 버퍼의 열을 씻어.
  5. 그의6elute-Tlp3-버퍼 G 25 mL (차입 버퍼, 20 mM Tris HCl 500 mM NaCl, 이미 500 m m)와 LBD 풀 흐름을 통해 분수 (Bradford 시 약을 사용 하 여 결정)로 단백질을 포함 하 고.
  6. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 풀링된 샘플의 단백질 농도 측정 합니다. SDS 페이지 분석 및 장소-20 ° c.에 aliquot 작은 걸릴

5. 그의6-태그 TEV 프로 테아 제 (옵션)를 사용 하 여 제거

  1. 준비, 그리고 4 ° c, (TEV 분열 버퍼, 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) 글리세롤, 2mm DTT) 버퍼 H의 4 L 냉각.
  2. 투 석 배관의 대략 5-7 cm 컷 (직경 2-3cm) ddH2오 200 mL에 젖어
  3. 그의6추가-태그 TEV 프로 테아 제는 그의6-1 TEV에 마지막 어 금 니 비율 4.5 단계에서 태그 단백질 준비: 8 단백질.
  4. 투 석 배관 폐쇄와 함께 튜브의 한쪽 끝을 클램프 고 단백질/TEV protease 혼합물으로 채우십시오. 다른 쪽 끝을 닫고 아무 누출 확인 합니다.
  5. 장소는 투 석 (에서 단계 5.1) 버퍼 H의 사전 냉각된 4 L로 튜브 및 연속으로 4 ° C에서 그것을 품 어 2 h. 변경 된 버퍼에 대 한 교 반 하 고 TEV 중재 분열 반응은 완료 있도록 하룻밤 투를 계속 합니다.
  6. 한편, 준비 하 고 멋진 (4 ° C) 4 L 버퍼의 난 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 m m NaCl, 1% (v/v) 글리세롤) 다음 날에 대 한 준비.
  7. 야간 투 석 후 단계 5.6에서에서 준비 하는 버퍼를 버퍼를 교환 하 고 추가 1-2 h 4 ° c.에 대 한 dialyse
  8. 투 통에서 튜브를 제거 하 고 튜브의 한쪽 끝을 unclip 50ml 팔 콘 튜브에 단백질 해결책을 전송. 달리 명시 하지 않는 한, 얼음에 계속 및 0.43 µ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
  9. 샘플의 볼륨을 측정 하 고 버퍼 F 구성이 트리 스, NaCl 및 이미 농도 조정 (예: 버퍼 J에에서 단백질 해결책의 25 ml 1 M Tris HCl pH 8.0, 5 M NaCl의 1.75 mL의 0.25 mL 및 2 M 이미 0.25 mL 추가).
  10. 4.1 단계에 설명 된 대로 5 mL HiTrap 킬레이트 화 HP 열을 준비 합니다.
  11. 열에 샘플을 로드 (흐름 율: 5 mL/min)는 흐름-이 통해, 포함 된 Tlp3 LBD (잔류물 42-291) 수집. Uncleaved 단백질, 쪼개진는 그의6-태그와 그의6-TEV는 열에 의해 유지 됩니다.
  12. 씻어 열 5 mL 버퍼 F (로딩 버퍼)을 통과 하는 eluate 수집 모든 태그가 없는 단백질을 허용.
  13. 수영장은 eluate 5.11, 5.12 단계에서 얻은 고 단백질 농도 측정 한다. 작은 aliquot 고 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 그것을 저장.

6. 크기 배제 크로마토그래피 (젤 여과) Tlp3 LBD의

  1. 버퍼 A의 1 L (10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl)을 준비 하 고 0.43 µ m의 멤브레인을 사용 하 여 필터링 합니다.
  2. 4 mL/min의 유량에서 버퍼 A 26/60 크기 제외 열 equilibrate
  3. 5.13 10 kDa 컷오프 (4 ° C, 4000 x g)와 15 mL 원심 집중 장치를 사용 하 여 3-4 mL의 볼륨에 단계에서 얻은 단백질 견본을 집중 한다.
  4. 13000 x g, 어떤 침전 된 단백질 제거를 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 단백질 해결책을 명확히 합니다.
  5. 미리 equilibrated 26/60 젤 여과 열에 샘플을 로드 합니다. 모니터는 UV 트레이스 4 mL/분의 유량에서 버퍼 A에에서 크로마토그래피를 수행 합니다. Tlp3 LBD 210-220 mL의 보존 볼륨에서 elutes. 피크 분수 풀.
  6. 단백질 농도 측정 합니다. 받아 작은 SDS 페이지 분석을 위한 aliquot.

7. 단백질 정화의 다양 한 단계에서 수집 된 샘플의 SDS 페이지 분석

  1. SDS 페이지 실행 버퍼 (버퍼 J) 1 리터를 준비, 25 m m를 포함 하는 트리 스, 250mm 글리신 pH 8.3 및 0.1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 (SDS).
  2. SDS 페이지 로딩 버퍼 (버퍼 K) x 5의 10 mL를 준비, 0.25 M Tris HCl pH 6.8을 포함, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) 글리세롤, 1mm DTT, 그리고 0.05 %bromophenol 블루.
  3. 정화의 다른 단계 동안 수집 된 aliquots를 허용 (1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6 단계) 해 동.
  4. 각 샘플에 대 한 SDS 페이지 로딩 버퍼, 볼륨을 조정 ddH2오 10 µ L 5 x 2 µ L로 전체 단백질의 15 µ g에 해당 하는 볼륨을 혼합
  5. 5-10 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열, 30 s 및 전송에 대 한 10000 x g에서 회전 깨끗 한 관으로 샘플.
  6. SDS 페이지 젤, 15 %polyacrylamide 젤 분리를 사용 하 여 준비 (5 mL: 2.5 mL 30% (w/v) 두번째-아크릴, 1.2 mL에 대 한 1.5 M Tris HCl pH 8.8, 1.2 mL ddH2O, 50 µ L 10% (w/v) SDS, 50 µ L 20% (w/v) 암모늄 persulfate (AP), 3 µ L tetramethylethylenediamine (TEMED) 그리고 5 %polyacrylamide 젤 스태킹 (아크릴-2 mL: 340 µ L 30% (w/v) 두번째에 대 한 250 µ L 1 M Tris pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 µ L 10% (w/v) SDS, 20 µ L 20% (w/v) AP, 2 µ L TEMED).
  7. 전기 기구를 조립 하 고 제조자의 권고에 따라 버퍼를 실행 하는 SDS 페이지 x 1 입력.
  8. 단백질 분자량 마커 단계 7.5에서에서 준비 하는 샘플을 로드 합니다. 25의 정 전류에서 전기 영동을 수행 mA.
  9. 용기에 젤을 전송 하 고 25% (v/v) 소 프로 파 놀, 10% (v/v) 초 산 및 0.03% (w/v) 화려한 블루 R-250 포함 하는 솔루션 얼룩 Coomassie 파란의 ddH2오 추가 150 mL와 함께 그것을 씻어. 실 온에서 30 분 동안 수평 회전 플랫폼에서 컨테이너를 놓습니다.
  10. DdH2O 젤 린스 고 destaining 솔루션 5% (v/v) 메탄올과 7% (v/v) 초 산을 포함 합니다. 1 시간에 대 한 수평 회전 플랫폼을 사용 하 여 혼합 하는 동안 destain.
  11. 젤 이미지 그리고 분석.

8. 원형이 색 성 (CD) 분광학 분석의 이차 구조 refolded 순수 단백질의

  1. 0.5-1mg 6.6 분리 튜브에 단계에서 얻은 refolded 단백질의 전송 및 5의 L 버퍼 L (50 m m 인산 나트륨 pH 7.4), 4 ° c precooled를 포함 하는 투 석 양동이 연속 교 반으로 4 ° C에서 샘플 dialyse 및 적어도 3-4 버퍼 변경 샘플 dialyse 하룻밤을 떠나기 전에 2-4 h 이상.
  2. 0.06 밀리 그램 mL-1 10 kDa 컷오프 원심 집중 장치를 사용 하 여 dialysed 단백질 해결책 집중.
  3. 13000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 솔루션을 명확히 합니다.
  4. 25 ° C와 20 nm 분-1의 스캔 속도 spectropolarimeter를 사용 하 여 200-260 nm의 파장 범위에서 샘플의 멀리 UV CD 스펙트럼을 기록 합니다. 투 석 버퍼를 사용 하 여 빈 컨트롤. 3 중에 녹음을 반복 하 고 평균된 스펙트럼을 생성.
  5. 계산 하는 이차 구조 콘텐츠 CD를 deconvoluting 하 여 스펙트럼은 DichroWeb에서 CDSSTR 프로그램을 사용 하 여 서버25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그의6의 재조합 표현-Tlp3-포함 시체 증 착 단백질 귀착되 었 다 대장균 에 LBD. 세균성 문화 단계 2.13에서에서 계산의 1 l 식 수율은 약 100mg의 그의6-Tlp3-LBD 포함 시체에 있는 예금. 여기서 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 단백질 격리 절차 포함, 단백질을 refolding 몸과 정화 친화성 크로마토그래피, 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피의 solubilisation의 구성 10-20 밀리 그램의 세균성 문화 1 L 당 순수 하 고, 태그 Tlp3 LBD의 수익률.

단백질 220 mL (그림 2A)의 보존 볼륨에 해당 하나, 대칭 피크로 젤 여과 열에서 eluted....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식 및 세균성 chemoreceptor Tlp3의 periplasmic LBD의 포함 시체에서 refolding 간단한 절차 제공 됩니다. 순수 단백질의 준비- 대장균, 정화 및 포함 시체, solubilisation 애완 동물 플라스 미드 인코딩 유전자 표현 포함 연속 선호도 의해 변성된 단백질의 정화의 refolding 및 크기 배제 크로마토그래피 단계입니다. 촉진 하는 요소 변성 및 refolding 희석/투 석-중재 최적화는 종종 포함 시체26에 입금 하는 단백질의 적절 한 renaturation 보장 하는 데 필요한 프로토콜에서 중요 한 단계입니다.

먼저 요소를 포함 하는 버퍼에 변성된 샘플을 희석 한 다음 여 그것 없는 버퍼에 대 한 샘플을 dialysing Tlp3 LBD의 refolding 2 단계 방식으로 달성 되었다. 이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 refolded 단백질 기능 및 crystallisab...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 그의 초기 작품 Tlp3 LBD 생산에 대 한 유 C. Liu를 감사합니다. Mayra A. Machuca 딸 Admistrativo 데 많은, 기술과 전자 Innovación COLCIENCIAS 박사 장학금에 대 한 빚을입니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
트리스 베이스AMRESCO497
염화나트륨(NaCl)MERK 밀리포어1064041000
암피실린G-BIOSCIENCESA051-B
페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)MERCK52332
트리톤 x-100AMRESCO694
이소프로필 &베타;-D-티오갈락토시드(IPTG)ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
요소AMRESCOVWRC0568
디티오트레이톨ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDC-1029
L-아르기닌 일염산염SIGMA-ALDRICHA5131
환원 L-글루타티온SIGMA-ALDRICHG4251
산화 L-글루타티온SIGMA-ALDRICHG4376
인산 나트륨 이염기성 (Na2HPO4)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
인산나트륨 일염기(NaH2PO4)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염 탈수물(EDTA)AMRESCOVWRC20302.260
이미다졸SIGMA-ALDRICHI2399
글리세롤ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
염화니켈(NiCl2)SIGMA-ALDRICH339350
글리신AMRESCOVWRC0167
도데실황산나트륨(SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
염색되지 않은 단백질 사다리, 브로드 범위 (10-250 kDa)NEW ENGLAND BIOLABSP7703
Amicon Ultracel 원심 농축기 (Millipore)MERCKUFC901096
50 mL 팔콘 튜브FALCONBDAA352070
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AST0487 BIOGB0232 28989336

References

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