여기에 우리가 큰 네이티브 단백질: 단백질 및 단백질의 단백질 구성을 분석 하는 프로토콜을 제시: oilseed 강간에서 핵 산 복합물 (B. napus) 체 관 부 exudate 블루 결합 3D polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 방식을 사용 하 여 네이티브 대량 spectrometric 식별 뒤의 변성 페이지 두 개 (10 억).
방법 논문
체 관 부 수액 샘플링 브라시카 napus 단백질 및 Ribonucleoprotein 단지의 3D-페이지에서
이 논문에서
요약
초록
더 높은 식물의 체 관 부를 샘플링은 종종 힘들고 식물 종에 크게 의존입니다. 그러나, 변성 시키기 조건에서 프로테옴 연구 다른 식물 종에 달성 될 수 있었다. 네이티브 단백질: 단백질과 단백질: 체 관 부 샘플에서 핵 산 단지 아직 부족 하 게 분석 된, 하지만 그들은 수도 있습니다 중요 한 역할을이 전문된 구획의 유지 보수 또는 장거리 신호. 큰 분자 어셈블리 블루 기본 젤 전기 이동 법 (BN-페이지)를 사용 하 여 격리 된 수 있습니다. 후속 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS-페이지)에 의해 그들의 단백질 구성 요소를 분리할 수 있습니다. 그러나, 유사한 분자 무게 단백질 공동 마이그레이션, 무슨 질량 분석에 의해 단백질 식별을 방해 수 있습니다. 두 개의 다른 변성 젤 전기 이동 법 단계, 즉 트리 스-Tricine-요소 및 SDS 페이지 BN-페이지 조합 그들의 화란/hydrophobicity에 따라 단백질의 추가 분리를 가능 하 게 하 고 따라서 해상도 성공 증가 단백질 식별. 그것은 심지어 posttranslational 수정만 다른 단백질을 구별 수 있습니다. 또한, 블루 네이티브 북부 blotting 고분자 복합물의 RNA 구성 요소를 식별 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜 단백질 및 RNA 구성 요소 네이티브 단백질: 단백질 및 체 관 부 샘플에서 발생 하는 ribonucleoprotein (RNP) 단지의 해명 하기 적합 하다는 것을 보여줍니다. 파란색을 결합 하 여 두 개의 다른 변성 페이지 단계 기본 페이지 큰 단백질 복합물의 다른 종류를 구분 하는 데 도움이 수 있습니다 그리고 또한 질량 분석에 의해 그들의 구성 요소 식별 증가 속도 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 동시에 단일 단백질 복합물 내의 잠재적으로 바인딩된 핵 산을 검출 하기 위하여 충분히 강력한입니다.
서론
체 관 부의 장거리 도관 더 높은 식물에 있는 유기 양분의 할당에 대 한 필수적입니다만 또한 성장 및 개발, 병원 체 방어 및 불리 한에 적응에 대 한 중요 한 많은 다른 프로세스를 규제에 참여 환경 조건입니다. 이온, phytohormones, 또는 스스로 대사 산물과 같은 작은 이펙터, 게다가 RNAs 단백질 같은 고분자는 잠재적인 신호도 최근 등장 했습니다.
연구는 단백질의 체 관 부 로드 크기 및 동반자 셀 (CC) 연결 기 공 plasmodesmal 단위의 크기 제외 제한 (SEL)에 의해 제어 요소 (SE)에 10의 범위에 일반적으로 있는 체 하 고 > 67 kDa1 , 2 , 그러나 3., 이러한 크기 제한이 더 큰 단백질 및 단백질에도 불구 하 고 단지 크기 제외4의 아이디어에 도전 하는 체 관 부 시스템 내에서 발견 되었습니다 그리고 se CC에서 단백질도 일반적인 손실 되었습니다 제안된5 .
큰 뿐 아니라 multiprotein ribonucleoprotein 단지6셀 구조적 무결성을 유지 하 고 생 합성에 중추적인 역할을 한다. 체 관 부-모바일 단백질-단백질 및 ribonucleoprotein 단지4,7, 존재 증거가 있다 하지만 날짜 그들의 기능에 대 한 약간은 알려진 다. 체 관 부 체 요소에서 단백질: 단백질과 RNP 단지 장거리 전송 및/또는 신호8,9연루 되었습니다. 환경 변화에서 그들의 구성 공부 translocated 단지의 기능을 해명 하거나 스트레스 조건이 필요 합니다. 이 위해 네이티브 단지 고립 되 고 그들의 구성 요소는 충분 한 해상도로 분리 될 필요가.
높은 분자 무게 단지는 체 관 부를 분리, 그것은 충분 한 품질 및 수량에 sap 샘플을 얻기 위해 첫 번째 필요. 체 관 부 샘플링에 사용할 수 있는 기술 관심의 식물 종에 따라 달라 집니다. 체 관 부 수액을 얻기 위해 세 가지 주요 방법 존재 10: 곤충 stylectomy11, EDTA 촉진 나옴12, 그리고 자발적인 있고13.
애기 thaliana (A. thaliana), 실험실, 전세계의 주요 모델 공장에서에서 체 관 부 샘플만 EDTA 용이 있고 또는 진딧물 stylectomy,1415에 의해 얻어질 수 있다. 두 방법 모두 매우 희석된 체 관 부 수액 또는 매우 낮은 샘플 금액으로 이어질. EDTA 용이 있고 또한 오염 하는 경향이 하 고 실제 체 관 부 구성16를 나타내지 않을 수 있습니다. 자연 체 관 부 나옴 어디 공장 부품을 잘라 쉽게 수집된13,,1718수 있는 체 관 부 수액의 자발적 방출에 리드, cucurbits, 르 피나 스 또는 유카, 같은 종 식물로 제한 됩니다. 19. 우리는 최근 체 관 부 분석을 위한 적합 한 모델 시스템으로 oilseed 강간 (브라 시카 napus)를 설립, 이후 A. thaliana 의 가까운 친척 및 체 관 부 수액의 여러 microliters 표시 되어 작은 절 개에서 얻을 수 있습니다. 고 순도4,,820의 수 있습니다. 또한, B. napus 게놈 시퀀스 201421에 릴리스 되었습니다.
진딧물 stylectomy 제외한 모든 체 관 부 수집 방법 설명 샘플링, 사이트에서 조직 주변의 손상 포함 하 고 체 관 부 수액의 구성은 부상에 대 한 응답에서 변경 될 수 있습니다. 따라서 샘플링 방법 적용에 체 관 부 샘플의 품질을 확인 하려면 필수적입니다. 예: RNase 활동22,23, Rubisco8,24에 대 한 뇌관으로 RT-PCR 또는 설탕의 분석의 결정에 의해 수집 된 체 관 부 수액의 품질 관리를 위한 다른 방법이 있다 컴포지션8.
크기 배제 크로마토그래피, 자당 밀도 ultracentrifugation, 또는 명백한 분자량 커트로 세포 막을 통해 여과 샘플을 포함 하 여 격리 하 고 분리 단백질 단지 다른 방법을 적용할 수 있습니다 오프. 그러나, 이러한 접근은 높은 해상도 허용 하지 않습니다. 라는 블루 기본 페이지 (비-), Schägger 외에의해 처음으로 설명 하는 기법. 25, 해상도 측면에서 우량 하다. 그것은 성공적으로 다양 한 세포 또는 세포 lysates 및 그들의 상대 나타났는데26,27큰 네이티브 단백질 복합물의 분자 무게를 결정 하기 위해 사용 되었다.
더 명료 단백질 복합물의 복잡 한 구성, 그것은 복잡 한 부품의 완전 한 해체로 이어지는 조건을 변성 시키기에서 개별 구성 요소를 분리 하는 데 필요한. 이 더 높은 해상도, 전자 초점 (IEF)의 두 번째 차원으로 SDS 페이지30 의 third dimension와의 후속 식별을 달성 하기 위해, 또는 SDS 페이지 28,29 의 두 번째 차원에 의해 달성 될 수 있다 단백질 질량 분석을 사용 하 여입니다.
이 프로토콜에서 순수 체 관 부 수액 B. napus 식물에서의 샘플링 및 트리 스-Tricine-우 레 아-페이지와 SDS 페이지 BN-페이지를 결합 하는 3D 전기 이동 방식을 사용 하 여 이러한 체 관 부 샘플에서 단백질 복합물의 분석을 설명 합니다. 분리 된 단백질 복잡 한 구성 요소는 이후 질량 분석을 사용 하 여 식별 됩니다. 또한, 소개 블루 네이티브 북부 blotting 큰 RNP 단지4, RNAs의 탐지를 허용 하는 방법으로는 접근의 적용을 확장 합니다.
프로토콜
1. 샘플링 및 B. napus 에서 체 관 부 수액의 준비 식물 4,,820
- 체 관 부 수액 샘플링, 사용 잘 물을 8 주 된 B. napus 식물 꽃가루 오염을 방지 하기 위해 그 표시만 초기 개화.
- 피하 주사를 사용 하 여 (Ø 0.8 m m)는 화 서는 punctate 여러 번 줄기와. 다른 몇 가지 화 서 줄기에 및 충분 한 체 관 부 수액 (그림 2a)를 다른 식물에 반복 합니다.
참고: 복잡 한 분석을 위해이 좋습니다 체 관 부 수액의 적어도 600 µ L로 시작 하. 4 ~ 5 식물의 체 관 부 수액 200, 700 µ L 사이 얻을 것입니다. - 필터 종이 부상된 사이트에서 첫 번째 드롭 다운을 닦아내십시오. 이러한 방울 주로 손상된 조직 주위에서 높은 오염된 물질을 포함 하 고 버려질 필요가 있다.
- Pipetting으로 다음 방울을 수집 하 고 수집된 exudate 얼음 냉각 시스템을 사용 하는-20 ° C에서 미리 냉장된 원뿔 1.5 mL 반응 관에 저장.
- 계속 해 서 수집 전혀 더 드롭 형성은 관찰, 하지만 1 시간 보다는 더 이상 때까지. 수집 된 체 관 부 수액의 상당한 손실 없이 2 일 후에이 절차를 반복할 수 있습니다.
주: 수집 된 체 관 부 수액 즉시 사용 하거나 미래의 분석-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. -80 ° C 보관, 충격-동결 반응 관에 액체 질소. - 체 관 부 샘플 약 1/6번째 분자량 (MWCO) 10000 Daltons (Da)의 차단으로 원심 집중 장치를 사용 하 여 초기 볼륨을 집중 한다. 4 ° C와 먼지 입자를 제거 하는 적어도 15 분 동안 20000 x g에서 집중된 샘플 원심
참고: 체 관 부 수액 농도 단백질의 상당한 손실에 연결 되지 않습니다. - 이후 복잡 한 분석, 단계 3.1 진행.
2. 체 관 부 수액 순도 제어 역전사 PCR (RT-PCR) 4,,820 를 사용 하 여
- 체 관 부 수액 액체 재료에 대 한 표준 RNA 추출 메서드를 사용 하 여에서 총 RNA 격리 (예: TRIzol 또는 페 놀-클로 프롬 적 출 소 프로 파 놀 강수량 수성 단계에 따라 단계를 세척 하는 에탄올에서 뒤는 제조 업체의 프로토콜)입니다.
주의: 페 놀-클로 프롬 독성이 있다. 적절 한 개인 보호 장비와 후드 작동 합니다. 최대 6 개월까지-80 ° C에서의 에탄올에 추출 된 RNA는 저장할 수 있습니다. - DNase 소화 하 여 DNA의 오염 제거 나 (1 u / µ g) 37 ° C에서 45 분 동안 5mm의 최종 농도에 EDTA를 추가 하 여 효소를 비활성화 하 고 10 분 동안 75 ° C에 샘플을 품 어.
- 순수한 RNA를 정화 하 고 다른 정화 단계 (예: 제조업체의 지침에 따라 RNA 정리 키트를 사용 하 여)에 의해 샘플을 집중 합니다.
- 150를 사용 하 여 cDNA 합성 키트 역전사 PCR (RT-PCR) cDNA의 합성에 대 한 수행 ng 순수한 RNA의 제조 업체에 의해 설명 된 대로 프로토콜의.
참고:는 cDNA 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 사용까지. - 구획 별 성적표를 증폭 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 확인 하는 제조 업체에 의해 지정 된 표준 PCR 반응에 대 한 템플릿으로 cDNA의 5 µ L 사용 합니다. 예를 들어 rubisco 작은 소 단위, thioredoxin h, 그리고 꽃가루 외 투 단백질 (그림 1b, 표 1)에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 체 관 부 샘플의 순도 확인 합니다.
3. 블루 기본 페이지 4,25,,2631
- 사용 중 자기 부 기본 그라데이션 젤 설명 대로 다른27 또는 상업 두번째-트리 스 그라데이션 젤.
- 부하에서 젤으로 잘 당 집중된 단백질 샘플의 20 ~ 30 µ g 이상 triplicates.
- 4 ° C에서 150 V 젤 실행 샘플 젤 (ca. 20 ~ 30 분, 그림 3a)의 1/3rd 때까지 어두운 파란색 음극 버퍼 B와 양극 버퍼 (표 2)를 사용 하 여.
참고: 북부 blotting에 대 한 단일 젤 레인은 3D 페이지와 덜 풍부한 단백질을 집중 하 여 최대 10 개 젤 차선에서 같은 밴드를 결합 하는 것이 좋습니다 하는 질량 분석에 의해 단백질 구성의 분석에 대 한 동안, 충분 한. - 실행을 일시 중지 한 exchange 어두운 파란색 음극 버퍼 B 밝은 파란색 음극 B/10 (표 2)를 버퍼링 하 고 실행을 계속. 젤 블루 앞 elute 젤 (ca. 120 ~ 180 분, 그림 3a)를 시작할 때 실행을 마칩니다.
참고: 완료 블루 기본 젤 저장할 수 있습니다 4 ° C에 적어도 1 주일에 대 한. 장기간된 보관 밴드 확산으로 이어질 수 있습니다 하 고 피해 야 한다. 다크 블루 버퍼 B 다시 사용할 수 있습니다.
4. 선택 사항: RNA 블루 네이티브 북부 더 럽 히 4 를 사용 하 여 검출
- 독특한 밴드 밖으로 또는 블루 기본 젤에서 전체 젤 레인을 사용 하 여 및 세미 드라이 60 분 3.5 mA/cm2 blotting에 의해 나일론 막에 그들을 전송 잘라내어 멤브레인 (그림 4a)에 연필로 위와 더 낮은 젤 테두리를 표시.
- 럽, 후 DEPC 처리 물 막 세척 하 고 건조 한 두 필터 논문 사이.
- UV-가교 120000 µ / cm2 blotted 막의 수행 (85 s 자료의 테이블에에서는 Crosslinker를 사용 하는 경우).
- 사전에 교 잡 오븐 (그림 4a)에서 68 ° C에서 60 분에 대 한 교 잡 버퍼 (상업적 또는 성가)의 6 mL와 함께 막 교배.
- 3'-biotinylated 프로브 4 µ L를 포함 하는 교 잡 버퍼의 추가 1 mL을 추가 (100 nM).
- 품 어 막의 프로브, 37 ° c 68 ° C에서 오븐을 냉각 하는 동안
- 2 x SSC와 0.1 %SDS, 프로브 unspecifically 바인딩 제거를 위해 상 온에서 5 분을 포함 하는 버퍼 막 씻어.
주의: SDS 자극을 일으킬 수 있습니다. SDS와 솔루션을 포함 하는 SDS를 작업할 때 장갑과 실험실 코트를 착용. - 민감한 chemiluminescent 반응 (그림 4a) 인 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 기판으로는 막 예 luminol와 Streptavidin HRP 공액에의 3'-biotinylated 프로브 탐지를 수행 합니다.
5. 두 번째 치수: 트리 스-Tricine-요소 페이지 4,28
- 단일 밴드 블루 기본 젤에서 삭제하시오 더 복잡 한 단백질 (그림 5)의 농도 달성 하기 위해 병렬 차선에서 실행 하는 샘플에서 밴드를 결합 합니다.
참고: 삭제 밴드에에서 저장할 수 있습니다 단일 반응 튜브 4 ° c.에서 사용까지 - 12% 트리 스-Tricine-요소 젤을 붓고 (두께 1 m m, 6.8 c m x 8.6 cm (폭 x 길이)). 분리 젤 (표 2), 젤 솔루션의 10 mL를 준비 두 유리 접시 소 프로 파 놀과 오버레이 간의 부. 중 합 완료 후는 소 프로 파 놀을 제거 하 고 젤 삽입 10 잘 빗에 겹쳐 쌓이는 젤에 대 한 젤 솔루션 B (표 2)의 4 mL를 전송.
주의: Unpolymerized 아크릴 신경 수 이며 TEMED 흡입 하는 경우에 유해한. 항상 개인 보호 장비를 착용 하 고는 후드 작동. - 1.5 mL 반응 관에 삭제 젤 밴드를 전송 하 고 젤 조각 (그림 5, 표 2)의 평형에 대 한 SDS 샘플 버퍼 x 2의 1 mL를 추가 합니다.
- 실내 온도에, 또는 전자 레인지에가 열 블록 (95 ° C)에 끓는 전에 10 분 동안 샘플을 품 어 고 추가 15 분 동안 실내 온도에 다시 샘플을 품 어.
- 여러 equilibrated 젤 조각 같은 복잡 한을 대표 하는 하나의 단일 젤 주머니에 스택.
- 전기 이동 법 양극과 음극 150 V 45 ~ 60 분에 버퍼를 실행을 사용 하 여 수행 하 고 전체 젤 레인을 삭제할.
- 산 성 버퍼 (100 mM Tris, 100 mM 아세트산)에서 20 분 컷된 레인을 품 어 고 125 mM Tris HCl, pH 6.8 또 다른 20 분 (그림 5)에서 equilibrate.
6. 3 차원: SDS-페이지 4,32
- 분리 젤 Laemmli32 에 따라 15 %SDS 붓고 (두께: 1.5 m m, 6.8 c m x 8.6 cm (폭 x 길이)) (표 2) 스태킹 젤 위의 4%의 얇은 레이어를 추가 하 고.
주의: SDS, 아크릴 아 미드와 TEMED는 유독 하 고 유해 합니다. 후드 밑 작업과 개인 보호 장비를 착용. - SDS 젤에 equilibrated 젤 레인 전송 및 버퍼 bromophenol 블루 (그림 5)의 흔적으로 보충을 실행 1 x SDS에 0.5% (w/w) agarose 젤 커버.
- 전자 레인지에 agarose 젤에 로드 이전 버퍼 실행 SDS를 끓인 다.
- 단일 부품의 분자 무게를 추정 하는 단백질 마커를 실행, 삽입 젤의 한쪽 끝에 필터 종이 agarose 경화 될 때까지 또는 일반적으로 IPG 젤 사용 특별 한 빗을 사용 하 여.
- 150 V 60 분 및 얼룩에 젤을 실행 콜 로이드 Coomassie, 실버 얼룩 또는 어떤 다른 젤 얼룩 메서드 이후 대량 spectrometric 분석에 적합.
- 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 같은 대량 spectrometric 방법을 사용 하 여 보이는 단백질 반점 분석 시간의 비행 (TOF MALDI) 또는 LC-MS/MS 질량 분석.
참고: 우리는 콜 로이드 Coomassie 설명된33이미로 얼룩을 사용 하 여 것이 좋습니다. 우리의 손에 덜 풍부한 단백질 충분히 얼룩이 질 수 있다 고 합리적인 데이터 품질에 대 한 대량 spectrometric 분석을 수 있습니다.
결과
여기에 우리가 단백질: 단백질의 분석을 허용 하는 프로토콜을 현재 브라 시카 napus에서 체 관 부 샘플에서 단백질: RNA 복합물 뿐만 아니라. 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 다른 모델 유기 체 이상 B. napus 의 주요 장점 중 하나는 화 서 줄기에 작은 구멍에서 상대적으로 쉽게 체 관 부 샘플 컬렉션의 가능성입니다. 이 대 등 하 게 많은 양의 순수한 체 관 부 샘플을 얻을 수 있습니다. 체 관 부를 샘플링 때 그것은 항상 RT-PCR8예, 오염에 대 한 확인 하는 것이 좋습니다. 순수 체 관 부 샘플에서 얻은 대표적인 결과 그림 2에 묘사 된다. 비 오염 체 관 부 샘플 rubisco와 꽃가루 외 투 단백질에 대 한 신호가 나타납니다 반면 thioredoxin h에 대 한 보이는 밴드를 표시 합니다. Rubisco 작은 소 단위 잎, 샘플에서 컨트롤로 사용할 수 있습니다 화 서 줄기 또는 꽃가루. 꽃가루 외 투 단백질 대 본만 꽃 새싹 샘플에 표시 되어야 하는 동안 그것의 mRNA의 다른 종, 체 관 부에 발견 되었습니다 이후 Thioredoxin h 모든 샘플에서 감지 해야 합니다. 오염 체 관 부 샘플링 완전히 꽃 식물 (화분 외 투 단백질) 또는 체 관 부 샘플링 구멍에서에서 첫 번째 방울 제대로 삭제 하지 때 수행 하는 경우 발생할 수 있습니다 (rubisco).
BN 페이지 이전 체 관 부 수액 집중 필수입니다. 잘 당 단백질의 20 ~ 30 µ g를 사용 하 여, 적어도 4 개의 주요 단백질 복잡 한 악대 표시 되 고 비 엔-페이지의 B. napus 체 관 부 수액, 너무 낮은 후 또는 너무 높은 농도 단지 (그림 3)의 명확한 분리를 허용 하지 않습니다. 2 차원 젤 다운스트림 처리 및 후속 대량 spectrometric 식별에 대 한 각 단일 복잡 한에서 단백질을 더 집중에 한 단일 주머니에 같은 복잡 한을 대표 하는 여러 젤 밴드를 로드 하는 것이 좋습니다.
체 관 부 고분자 복합물의 개별 구성 요소를 식별 하려면 우리 초기 BN-페이지 2 차원 트리 스-Tricine-요소와 함께 결합 하 고 3 차원 단일 단백질의 분리를 달성 하기 위해 SDS 페이지. 여기, 때문에 다른 단백질 마이그레이션 동작 요소에 SDS 페이지 젤 높은 해상도와 분리를 관찰할 수 있습니다. 일반적으로, 단일 복잡 한에 속하는 단백질 젤에서 대각선으로 볼 수 있을 것입니다. 반면 단백질 선 아래 대표 더 많은 친수성 사람28 (그림 5, 그림 6)이이 선 위에 단백질 증가 hydrophobicity, 있다.
RNP 단지의 특성화, BN 페이지 젤 부분의 BN 북부 blotting 수행을 사용 했습니다. UV 방사선에 의해 나일론 막과 가교에 전체 레인의 blotting 후 RNA RNA 관련 프로브를 사용 하 여 그림 4에서 볼 수 있듯이 구상 수 있다. 여기 특정 tRNA는 한 특정 단지에만 표시 됩니다. 이 tRNA 바인딩 복합물의 단백질 구성 요소는 위에서 설명한 3D 젤 방식을 사용 하 여 추가 조사 수 있습니다. 대량 spectrometric 분석이 복잡이 한 무엇 BN 북부 blotting에 의해 발견 하는 tRNA 바인딩 활동 확인 주로 tRNA ligases 포함 했다.
그림 1: oilseed 강간의 체 관 부 수액에서 ribonucleoprotein 복합물의 분석의 흐름을 일. 샘플링 및 체 관 부 샘플의 준비, 후 BN 페이지 네이티브 단지를 별도로 수행 됩니다. 이러한 비 엔 페이지 젤 수 BN 북부 blotting에 의해 핵 산의 병렬 분석 및 질량 분석에 의해 복합물의 단백질 구성 요소 식별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 체 관 부 수액 B. napus의 샘플링 및 순도 제어. 메 마른 피하 주사와 8 10 주 오래 된 oilseed 강간 식물의 꽃이 핌 줄기를 puncturing 후 exudate는 피 펫으로 수집 되 고는 얼음 처럼 차가운 반응 관 (a) RT-PCR 수행 체 관 부 샘플의 순도 확인로 전송 증폭 thioredoxin h, rubisco 작은 소 단위, 및 조직 관련 샘플 (b) RT-PCR 역전사 없이에서 꽃가루 외 투 단백질의 사본 제어 (-)으로 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: BN 페이지. 집중된 체 관 부 샘플 블루 기본 페이지의 도식 표현 B. napus. (a) 후 집중된 체 관 부 수액의 15-20 µ L로 그라데이션 단백질 젤 로드, BN 페이지 1 x 다크 블루 음극 버퍼 B 150 V 추운 방에 20-30 분 수행 됩니다. 그리고 버퍼 1 x 라이트 블루 음극 버퍼 B/10에 대 한 교환 페이지는 젤 전면 실행을 실행 하는 진한 파란색까지 150 V 120-180 분에 완료 되. BN 페이지 젤 4 가지 밴드를 대표 하는 4 개의 다른 높은 분자 무게 단지 표시. (b) 너무 작은 (c) 또는 (d) 체 관 부 단백질 너무 많이 로드 개별 단지의 가시성을 줄일 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: BN 북부 더럽혀. 북부 방법 blotting BN의 도식 적인 표현입니다. (BN-페이지의 a)는 레인 blotting 세미 드라이 하 여 나일론 막에 전송 됩니다. 자외선 가교 및 사전 교 잡, 후 막 RNA 특정 프로브 (여기는 메티오닌 tRNA 관련 조사), 밤 동안 3'-끝에 교 잡 오븐에서 biotinylated는 인 큐베이 팅. 무료 프로브 단계 세척 하 여 제거 되 고 RNA의 검출 streptavidin HRP 켤레와 luminol에 의해 수행 됩니다. 이 방법을 사용 하 여, 복잡 한 4 억 페이지에서 메티오닌을 포함 관찰 tRNA. (b) Coomassie 스테인드 젤과 tRNA 오 닮은 마이그레이션 차이 피하기 위해 병렬로 실행 하는 두 개의 다른 젤 레인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 3D 페이지. 3D 페이지 접근의 도식 적인 표현입니다. 같은 단지에서 여러 밴드 BN 페이지 젤에서 excised, 버퍼 로드 incubated 되며 2 차원 트리 스-Tricine-우 레 아-페이지의 한 우물으로 전송. 전기 이동 법, 후 전체 젤 레인 잘라, 산 성 산 성 버퍼에서 세척, equilibrated, 있으며 15 %SDS 페이지 젤에 배치. 3 차원 페이지 후 분리 된 단백질 Coomassie 스테인드 및 질량 분석에 의해 분석 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 대표 결과 3D 페이지 후. 첫 번째 차원 BN 페이지 내에서 여러 단지 나타났다. 그들의 단백질 구성 요소 결과 대각선 자리 패턴에 두 후속 변성 페이지에 추가 구분 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 프로브 | 시퀀스 |
| Thioredoxin h |
앞으로: CTCAAGGCAGCCAAAGAATC 역: ATGGCCTGAACATCGAACTC |
| Rubisco 작은 사슬 |
앞으로: TTCACCGGCTTGAAGTCATC 역: CCGGGTACTCCTTCTTGCAT |
| 화분 외 투 단백질 BRU77666 |
앞으로: TCAGAACTGGAGCTTCAACG 역: TTCCTTAATGGCCTCAGTGG |
표 1: 체 관 부 샘플 순도 제어에 사용 되는 뇌관. 체 관 부 샘플 순도 확인 rubisco 작은 사슬, thioredoxin h 및 꽃가루 외 투 단백질을 위한 특정 뇌관 cDNA 증폭에 사용할 수 있습니다.
| 버퍼 및 솔루션 | 콘텐츠 | 댓글 | |
| 다크 블루 음극 버퍼 B | 15mm 두번째-트리 스 pH 7.0 50 mM Tricine 0.02% (w/v) Coomassie 파란 G250 | 제조 법은 Fiala 외. 17 에서 적응 7.0에 pH는 조정 한다 10 배 재고 버퍼를 만들 수 있습니다. | |
| 라이트 블루 음극 버퍼 B/10 | 15mm 두번째-트리 스 pH 7.0 50 mM Tricine 0.002% (w/v) Coomassie 파란 G250 | 버퍼는 음극 버퍼 B Coomassie 없이 음극 버퍼를 diluting 하 여 준비 될 수 있다 | |
| 양극 버퍼 |
50mm 두번째-트리 스 pH 7.0 | 버퍼 재고 솔루션 x 10으로 준비 될 수 있다 | |
| SDS 샘플 버퍼 x 2 |
125 mM Tris HCl pH 6.8 4% SDS 20% 글리세롤 0.2 M DTT 0.02% (w/v) bromophenol 블루 | ||
| 전송 버퍼 1 버퍼 x TBE |
89 mM Tris pH 7.6 89 m m 붕 2 mM EDTA | TBE 버퍼 만든 고 5 배 또는 10 x 주식으로 저장 될 수 있습니다. 사용 RNase 자유 이온된 물에 중요 하다. | |
| SSC 버퍼 x 2 |
300 mM NaCl 30 m m 나3시트르산 pH 7.0 | ||
| 젤 버퍼 x 3 |
3 M 트리 1 M HCl 0.3% SDS pH 8.45 | Schägger 19 에서 적응 하는 레시피 | |
| 트리 스 Tricine 젤 솔루션 A |
10 ml: 30% 아크릴-bisacrylamide (29: 1) 3.34 mL 6 M 요소 3 배 젤 버퍼 3.34 mL 70% 글리세롤 1.4 mL ddH2O 10 mL을 추가 10% APS 40 Μ L TEMED 4 Μ L | 무게 6 M 요소와 3 배 젤 버퍼, 아크릴 bisacrylamide 솔루션 및 70 %gycerol 추가 합니다. 하는 요소를 solubilize 물 욕조에 60 ° C에가 열. DdH2O 10 mL, 10% 추가 APS와 TEMED 중 합에 대 한 마지막으로. | |
| 트리 스 Tricine 젤 솔루션 B |
6 ml: 30% 아크릴-bisacrylamide (29: 1) 0.8 mL 6 M 요소 3 배 젤 버퍼 1.5 mL ddH2O 6 mL을 추가 10% APS 45 Μ L 4.5 TEMED Μ L | 6 M 요소 무게 고 젤 버퍼와 아크릴 bisacrylamide 솔루션 x 3를 추가 합니다. 하는 요소를 solubilize 물 욕조에 60 ° C에가 열. DdH2O 10 mL, 10% 추가 APS와 TEMED 중 합에 대 한 마지막으로. | |
| 트리 스 Tricine 실행 버퍼 (양극) x 1 |
100 mM Tris 22.5 m m HCl pH 8.9 | Schägger 19 에서 적응 하는 레시피 | |
| 트리 스 Tricine 실행 버퍼 (음극) x 1 |
100 mM Tris 100 mM Tricine 1% SDS pH 8.25 | Schägger 19 에서 적응 하는 레시피 | |
| 산 성 버퍼 |
100 mM Tris 100 mM 아세트산 | ||
| 4 %SDS 겹쳐 쌓이는 젤 |
2 ml. ddH2O 1.4 mL 30% 아크릴-bisacrylamide (37.5:1) 0.33 mL 1 M Tris pH 6.8 0.25 mL 10% SDS 20 Μ L 10% APS 20 Μ L TEMED 2 Μ L | ||
| 15 %SDS 젤을 분리 |
10 ml: ddH2O 2.3 mL 30% 아크릴-bisacrylamide (37.5:1) 5 mL 1.5 M Tris pH 8.8 2.5 mL 10% SDS 100 Μ L 10% APS 100 Μ L TEMED 4 Μ L | ||
| SDS 실행 버퍼 x 1 |
25mm Tris 192 m m 글리신 0.1% SDS | ||
| Coomassie 솔루션 얼룩 |
5% (w/v) 황산 알루미늄-(14-18)-하이드 레이트 10% (v/v) 에탄올 (96%) 2% (v/v) 직접 산 (85%) 0.02% (w/v) Coomassie 화려한 블루 G-250 | ||
| ULTRAhyb 磁 교 잡 버퍼 | Ambion, 생활 기술 | ||
표 2: 솔루션 및 버퍼 조리법. 모든 버퍼 및 3D 페이지 분석에 필요한 솔루션의 목록입니다.
| 자리 아니입니다. | MW obs. [kDa] | 식별 | 유기 체 | 아니오를 취득. | MW [kDa] | 마스코트 점수 | |
| CIV_1 | 130 | 상 상속 질병 저항 단백질 At4g19050 | B. napus | CDX78917 | 131.1 | 110 | |
| CIV_2 | 130 | 상 상속 질병 저항 단백질 At4g19050 | B. napus | CDX78917 | 131.1 | 89 | |
| CIV_3 | 100 | 열 충격 70 kDa 단백질 14 처럼 | B. napus | XP_013748865 | 89.9 | 113 | |
| CIV_4 | 90 | 진 핵 신장 요인 2 세포 분열 조절 단백질 48 체 A | B. napus B. napus | CDX90241 CDY41316.1 | 89.5 89.5 | 111 197 | |
| CIV_5 | 85 | 열 충격 단백질 90-2-같은 | B. rapa | XP_009132342 | 79.8 | 172 | |
| CIV_6 | 80 | 트레오닌-tRNA 리가 글리신-tRNA 리가 | B. 올레라케아 B. napus | XP_013599115 CDY43195 | 81.5 80.8 | 110 88 | |
| CIV_7 | 70 | 열 충격 단백질 70 kDa 리 신-tRNA 리가 같은 | B. 올레라케아 B. napus | XP_013685267 XP_013747530 | 67.8 69.9 | 230 150 | |
| CIV_8 | 65 | Myrosinase Aspartate-tRNA 리가 2 아스파라긴-tRNA 리가 1 | B. napus B. napus B. napus | ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126 | 60.6 61.6 63.5 | 183 141 153 | |
| CIV_9 | 60 | Myrosinase | B. napus | ABQ42337 | 60.6 | 164 | |
| CIV_10 | 55 | Adenosylhomocysteinase 2-같은 | B. rapa | XP_009135865 | 53.1 | 139 | |
| CIV_11 | 55 | 신장 요인 1 알파 1-같은 | B. 올레라케아 | XP_013586115 | 51.9 | 161 | |
| CIV_12 | 50 | 시스 틴 lyase CORI3 처럼 | B. napus | XP_013653143 | 48.1 | 237 | |
| CIV_13 | 44 | 시스 틴 lyase CORI3 처럼 | B. rapa | XP_009108611 | 48.3 | 213 | |
| CIV_14 | 38 | 과 당-bisphosphate aldolase | B. rapa | XP_009115993 | 38.4 | 226 | |
| CIV_15 | 45 | 시스 틴 lyase CORI3 처럼 | B. rapa | XP_009108611 | 48.3 | 219 | |
| CIV_16 | 45 | 시스 틴 lyase CORI3 | B. rapa | CDY69765 | 46.9 | 209 | |
| CIV_17 | 38 | 과 당-bisphosphate aldolase | B. rapa | XP_009115993 | 38.4 | 124 | |
| CIV_18 | 18 | Peptidyl-prolyl cis 트랜스 isomerase CYP18-3-처럼 | B. napus | XP_009101932 | 18.3 | 128 | |
| CIV_19 | 45 | 시스 틴 lyase CORI3 처럼 | B. rapa | XP_009108611 | 48.3 | 177 | |
표 3: 복잡 한 IV에서 단백질 구성 요소 식별. 여러 tRNA ligases와 추가 단백질 tRNA 바인딩 단지 내 발견 되었습니다 후 3D 페이지 spectrometric 분석을 대량 MALDI TOF를 사용 하 여.
토론
체 관 부는 높은 관심의 구획 때문에 photoassimilates에 대 한 주요 수송 경로 구성 하 고 또한 다른 식물 부속9,20,34, 사이 장거리 신호를 위해 근본적 이다 35. 작은 분자 뿐만 아니라 RNAs 단백질 같은 고분자와 체 관 부 유지 보수 신호4,7,8연루 되었습니다. 체 관 부 구성의 분석 대부분의 식물 종에서 체 관 부 샘플에 제한 접근에 의해 제한 됩니다. 곤충 stylet 기술을 광범위 하 게 적용 하지만 실험적 요구 이며 체 관 부 샘플11의 매우 작은 양의 결과. 1 개의 쉬운 기술은 체 관 부 샘플링에 사용 되는 EDTA 촉진 나옴12입니다. EDTA 칼슘 같은 divalent 이온 chelates을 따라서 P 단백질 및 callose로 체 번호판의 폐쇄. 그것은 사용 하기 쉬운, 그러나 손상 된 세포에 의해 오염 하는 경향이 고 샘플 희석. EDTA에 의해 divalent 이온을 없애고 기존 단지의 분석 또한 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 다양 한 모델 공장 A. thaliana15를 포함 하 여 종에서에서 샘플링이 있습니다. 체 관 부 수액의 자발적인 나옴만 종의 식물의 작은 수에서 발생합니다. 식물 조직10의 중요 한 상해를 포함 하는 침략 적 방법입니다. 우리는 최근 장거리 전송4,8,20공부 모델 종족으로 B. napus 를 설립. 여기, 체 관 부 수액 샘플링할 수 있다 수 작은 절 개에서 부상 효과 오염의 소스를 감소 시키는.
다른 샘플링 기법을 사용 하 여, 다양 한 식물 종에서 체 관 부 샘플의 프로테옴에 최근 몇 년 동안7,8,17,,3637, 조사는 38,39. 이러한 프로테옴 연구에 대 한 단백질 추출 되었고 조건을 변성 시키기에서 시 켰 던 따라서 단백질: 단백질 및 단백질에 대 한 결론을 허용 하지 않습니다: 핵 산 상호 작용 기본 조건 제시. 공동-immunoprecipitation (CoIP) 및 오버레이 분석 표시 주요 ribonucleoprotein 복잡 한 호박40, 체 관 부 수액에 있을 수 있지만 어떤 고분자 복합물 내의 기본 조건에서 존재 증명 되지 이었다는 체 관 부 시스템입니다.
Schägger 그 외 여러분 에 의해 도입 된 블루 기본 페이지 26, 후속 고해상도 젤 전기 이동 법 단계와 함께에서 큰 단백질 복합물의 개별 구성 요소 분리 가능 네이티브 B. napus 의 3D 페이지 분석을 사용 하 여 체 관 부 exudate, 우리 수 최근 보여 여러 높은 분자 무게 단백질: 단백질과 RNP 단지 체 관 부 샘플에 존재 하며 효소 활성화4. 크기 배제 크로마토그래피 같은 단백질 복합물 뿐만 아니라 RNPs를 분리 하는 다른 방법 존재, 하지만 억 페이지에 비해 해상도 관점에서 실패 수 있습니다. 또한, 복잡 한 분리의 합리적인 품질, 크기 배제 열 매트릭스 조사 되 고 전반적으로 복잡 한 분자 무게에 따라 적용할 수 있다. 다른 크기의 단지 분석 따라서 다른 유형의 비용을 집중 하 고 억 페이지로 초점 고성능으로 허용 하지 않는 열을 요구할 것 이다.
B. napus 에서 단지 분석 하 중요 한 단계는 시작 물자로 사용 하는 체 관 부 sap의 총 금액을 포함 합니다. 체 관 부 샘플의 적어도 600 µ L 필요 하 고 5 개의 잘 물결 무늬가 있는 식물에서 얻을 수 있습니다. 3D 페이지 및 BN 북부 blotting에 대 한 체 관 부 샘플의 충분 한 양의 초기 비 엔 젤을 시작할 필요가 있다. 이를 위해, 체 관 부 샘플은 집중 잘하고 적어도 20 ~ 30 µ g 단백질의 각에 로드할 수 있습니다 때까지 동일한 샘플의 triplicates을 동시에 실행 됩니다. 너무 낮거나 너무 높은 농도 단지 (그림 3)의 탐지를 줄일 수 있습니다. 체 관 부 샘플 필요 얼음에 반응 튜브에 수집 되며 단백질 저하와 회전율을 피하기 위해 나중에 사용 하기 위해 냉동 저장 한다. 프로 테아 제 저 해제 분석 하 고, 모든 체 관 부 proteomes에서 발견 되었습니다 하지만 또한 완전히 활성 프로테아좀 B. napus4의 체 관 부에 설명 했다. 또한, 볼륨 및 체 관 부 샘플의 구성 샘플링 시간-포인트와10환경 조건 따라 다릅니다. 따라서 유사한 조건 하에서 하루 중 같은 시간에 수집을 배려를가지고 한다. 스트레스 치료 (예: 가뭄) 수집 수 체 관 부의 양을 줄일 수 있습니다. 식별 하려면 단일 단백질 질량 분석에 의해, 제한 가능한 각 질 오염 입고 장갑 항상 필수입니다. 각 질과 질량 spec 분석 중 추가 신호 리드 저해 단백질 식별. 더 높은 전압 또는 온도에 10 억 페이지를 실행 깨지기 쉬운 단지의 분해 될 수 있는 젤의 열 발생할 수 있습니다.
여기에 제시 된 프로토콜은 단백질: 단백질 복합물의 분석에 적합 합니다. 우리는 또한 동시에 단지에 포함 된 특정 RNAs를 감지 하 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 최근 북부 blotting410 억에 대 한 프로토콜 도입. RNAs는 RNAse 오염에 의해 저하 하는 경향이 있다. 이러한 성능 저하를 제한 하려면 DEPC 처리, 물 사용 되어야 한다.
제시 방법의 주요 제한 포함 마이그레이션 동작 따라 크기, 모양에 그리고도 단지31의 posttranslational 수정 이후 억 페이지를 구분 하는 단백질 복합물의 분자량의 추정 41. RNP 복합물의 크기 추정은 마이그레이션 동작에 핵 산의 영향으로 훨씬 더 복잡 합니다. 그것은 또한 하지 막을 수 있습니다 단지 같은 크기의 공동 한 하나의 밴드에서 마이그레이션할. 이 복잡 한 구성의 잘못 된 예측 발생할 수 있습니다. 따라서 상호 보완적인 기술로 관찰 된 상호 작용을 확인, 예를 들어 기능 분석 실험4, 필요할 수 있습니다. 또한 단백질만 약하게 또는 뚜렷이 고분자 복합체에 관련 된 사용 BN 버퍼에서 손실 될 수 있습니다. 이 방지 하려면 샘플 가교 화, 부작용으로 이어질 수 있습니다 무엇 또는 단백질 식별을 방지할 수 있습니다 또는 버퍼 상태를 최적화할 수 있습니다.
클래식 2D-페이지, 달리의 요소 및 SDS 페이지 hydrophobicity 및 전자 점 (pI) 및 분자량 28, 대신 분자량에 따라 분리 수 있습니다 조합과 단백질의 분리를 제한 하지 않는 한 특정 pI 범위입니다. 클래식 비슷한 2D 페이지, 분리 단백질 단일 관광 명소를 볼 수 있지만 대각선에 선 4,28 (, 그림 5 그림 6). 반면에 친수성 단백질 더 선28아래 찾을 수 있습니다 더 많은 소수 성 단백질이이 대각선 위의 관광 명소에 나타납니다. 이 프로토콜에 사용 된 polyacrylamide 농도 사이 25 ~ 80 kDa 단백질 잘 별도 것입니다. 작은 또는 큰 단백질의 분리는 polyacrylamide 있도록 농도 변화 될 수 있다 또는 그라데이션 젤 3 차원에서 사용할 수 있습니다. 3D-페이지 (그림 6)으로 구분 된 복잡 한 IV (그림 3)의 구성 요소, 트립 신, 소화 및 질량 분석에 의해 분석 밖으로 절단. 이 결과 여러 tRNA ligases의 식별. 다른 단지의 구성 요소 되었습니다 4최근 출판. 우리의 3D 페이지는 다른 ligases, 즉 aspartate, 아스파라긴, 트레오닌, 라이 신, 글리신 ligases, 유사한 분자 무게 (표 3)와 분리를 사용할 수 있습니다. 우리 복잡 한 4 내에서 잠재적으로 바인딩된 tRNA를 감지할 수 메티오닌 tRNA 전용 프로브를 사용 하 여, 하지만 전체 길이 tRNA 또는 tRNA 조각 복잡 한에 있는 경우 사용 하는 프로브와 차별 수 없습니다. 핵 산 단지 내에 정말 바인딩된와 공동 마이그레이션 있다면, 프로 테아 제 소화 체 관 부 수액 확인을 샘플 수 있습니다 적합 한 마이그레이션 컨트롤 역할을 합니다.
그것은 거의 대부분의 구성 요소는 전체 리보솜으로 신장 요인의 체 관 부 샘플4,7에서 발견 되었습니다 이후 단백질 번역 체 관 부 체 튜브 내에서 발생할 수 있습니다 이전 추측 하고있다. TRNA와 tRNA ligases의 우리의 발견이이 아이디어를 지 원하는 것으로 보인다. 그러나, tRNA 조각 호박에서 체 관 부 샘플에 존재는 번역42 의 강력한 억제제로 표시 되었습니다 그리고 기능적인 리보솜4, 번역 자리를 차지할 수 없는 제안에 결 석 것 같다.
함께 찍은, 여기에 제시 된 프로토콜 기본 단백질: 단백질 및 체 관 부 샘플 및 분리에서 심지어 RNP 복합물의 분리 및 높은 해상도 가진 그들의 개별 부품의 식별 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램 소설 단백질 및 체 관 부 샘플에서 RNP 단지 검색 하 고 따라서이 고도로 전문화 된 공장에 새로운 기능을 명료 하 게 수 있습니다.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리가 그들의 과학적 지원을 위해 제니퍼 딕 및 Urszula Zarzenska 감사합니다. 이 작품 경력 통합 교부 금에 의해 (CIG, PCIG14-가-2013-63 0734) 7 프레임 워크 프로그램, 그랜트 LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung 함부르크), DFG 그랜트 (DFG 애 856_6-1) 내에서 유럽 위원회에 의해 재정적으로 지원 되었다 JK에 게 수 여.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 반응 튜브 | Eppendorf | 30120086 | |
| SDS PAGE용 10 웰 빗, 두께 1 mm | BioRad | 1653359 | |
| 2-프로판올 | AppliChem | 131090 | |
| 30 % 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액(29:1) 용액 | BioRad | 1610156 | |
| 30 % 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액(37.5:1) 용액 | BioRad | ||
| 96 % 에탄올 | Carl Roth | P075 | |
| 아세트산 | Carl Roth | 6755 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| 알루미늄 설페이트 - (14-18) -수화물 | AppliChem | 141101 | |
| 암모늄 퍼 옥소 이황산염 (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
| Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
| Boric acid | AppliChem | A2940 | |
| Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
| 원심 농축기 예: Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
| 화학발광 핵산 검출 모듈 키트 | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
| 크로마토그래피 논문 예: 3mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
| CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
| Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
| DNase I | AppliChem | A3778 | |
| 에탄올 abs. | AppliChem | A3693 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | AppliChem | A1103 | |
| 겔 이미징 시스템예: Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
| GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
| 글리세롤 | AppliChem | 141339 | |
| 글리신 | AppliChem | 131340 | |
| 가열 블록 TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
| 혼성화 오븐 eg. GFL 혼성화 인큐베이터 7601 | GFL | 7601 | |
| 피하 주사 바늘 (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
| IPG 젤 빗, 두께 1 mm | BioRad | 1653367 | |
| RNA 라벨링 예: Biotin 3'최종 DNA 라벨링 키트 | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
| 네이티브 그래디언트 젤 e.g. Novex NativePAGE 4– 16% Bis-Tris 단백질 겔 | Invitrogen | BN1002BOX | |
| 나일론 멤브레인 예: Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
| Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| 겔 전기영동용 전원 공급 장치 EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | GE Healthcare |
| RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| Semi dry blot e.g에서 구할 수 있습니다. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
| 도데실황산나트륨 (SDS) | AppliChem | 142363 | |
| cDNA 합성 예: RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) | AppliChem | A1148 | |
| 트리신 | AppliChem | A3954 | |
| Tris | AppliChem | A1086 | |
| 트라이소듐시트레이트 이수화물 | AppliChem | A3901 | |
| TRIzol 시약 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| ULTRAhyb 초고감도 혼성화 버퍼 | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
| Urea | AppliChem | A1360 | |
| UV Crosslinker 예: Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | Fisher Scientific |
| 수직 전기영동 장치 예: XCell SureLock 미니 셀 또는 미니 Protean III 시스템 | Thermo Fisher Scientific 또는 BioRad | EI0001 또는 1658004 | |
| 와이퍼예: KIMWIPES Delicate 작업용 와이퍼 | Kimberly-Clark | 34120 |
참고문헌
- Kempers, R., van Bel, A. J. E. Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa. Planta. 201 (2), 195-201 (1997).
- Stadler, R., et al. Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots. Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).
- Ostendorp, A., et al. Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes. New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).
- Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts. Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).
- Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).
- Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function. Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).
- Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. Towards the proteome of Brassica napus phloem sap. Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).
- Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. RNA as a long-distance information macromolecule in plants. Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).
- Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. Plant Mineral Nutrients. 953, 185-194 (2013).
- Kennedy, J. S., Mittler, T. E. A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids. Nature. 171 (4351), 528(1953).
- King, R. W., Zeevaart, J. A. Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents. Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).
- Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase. Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).
- Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding. Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).
- Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method. J Vis Exp. (80), e51111(2013).
- Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum). J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).
- Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L). BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).
- Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.). Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).
- Yoo, B., et al. A Systemic Small RNA Signaling System in Plants. Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).
- Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus. Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).
- Chalhoub, B., et al. Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome. Science. 345 (6199), 950-953 (2014).
- Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. Detection of several mRNA species in rice phloem sap. Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).
- Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements. J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).
- Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants. Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).
- Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), e2164(2011).
- Rais, I., Karas, M., Schägger, H. Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification. Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).
- Schägger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions. Plant Methods. 1 (1), 11(2005).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules. New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).
- Hall, S. M., Baker, D. A. The chemical composition of Ricinus phloem exudate. Planta. 106 (2), 131-140 (1972).
- Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).
- Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins. Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).
- Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes. Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).
- Kehr, J. Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects. J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).
- Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex. Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).
- Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).
- Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation. Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).
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