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방법 논문

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

6.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57114

⸱

2018년 6월 17일

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

이 논문에서

요약

이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

초록

조류 배아 실험 모델로 되었습니다 정액 발견에 대 한 매우 중요 개발 생물학. 중 몇 가지 방법을, 메 추 라 기-닭고기 키메라의 형성 및 chorioallantoic 막 (CAM) 소성 조직 날짜 지난 세기에 개발을 유지 하기 위해 사용. 요즘, 최근 생체 외에서 방법론으로 이러한 고전적인 기술 조합 추가 기관 형성을 찾아보기 새로운 잠재 고객을 제공 합니다.

여기-그리고 늦은-초기 organogenesis의 공부 하는 2 단계 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 배아 지역 기관의 추정 영토를 포함 하는 (48 h) 최대 organotypic 시스템에서 메 추 라 기 태아와 성장 생체 외에서 격리 됩니다. 교양된 조직 이후 닭 배아의 캠에 융합 된다. 비켜에 개발의 10 일 후 완전히 형성된 장기 이식할된 조직에서 얻을 수 있습니다. 이 메서드는 또한 약리 에이전트의 일반 행정과 조직 체 외 고 비켜 발달 단계에 걸쳐 유전자 조작에 의해 경로 신호 변조를 수 있습니다. 또한, 조직 개발 그들의 유전자 발현 프로 파일 (를 사용 하 여 정량 PCR (정량), microarrays, 등) 및 형태 (전통적인 조직학 및 immunochemistry 평가) 분석을 어떤 시간대에 수집할 수 있습니다.

설명된 실험 절차를 따라 완벽 하 게 형성 하는 organogenesis의 초기 단계에서 기능적 장기 조류 배아 외부 기관 형성 도구로 사용할 수 있습니다.

서론

조류 배아 정액 발달 생물학 연구에서 널리 사용 되었습니다. 새 모델의 주요 장점은 오픈 계란, 태아, 그리고 micromanipulation를 수행 하는 능력에 상대적으로 쉽게 접근할 수를 포함 합니다. 세포 운명1, 배아2, 특정 성장 요인의 응용 프로그램 및 캠1,3, 소성 세포 구조의 성장 공부에 대 한 고전적인 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 구성 하는 몇 가지 예 4.

기관 대형의 다른 단계에 대 한 새로운 통찰력을 얻으려면, 우리는 최근 체 외에서 배아 조직5의 조작으로 이식 기법을 결합 하는 방법을 개발 했습니다. 2 단계 접근 차별 및 탐사의 두 초기-및-의 후기 organogenesis는 매우 역동적이 고 복잡 한 조직 상호 작용2인해 제한 수 있습니다. 또한, 적합 한 조직 관련 마커의 부족 자주 제한의 사용 유전자 변형 동물 모델6. 2 단계 접근의이 새로운 방법은 크게 이러한 한계를 극복 한다.

첫 번째 단계에서 기관 형성의 초기 단계를 공부 하 메 추리 배아 영토 잠재 기관 rudiment 구성 된 절연 이며 48 h에 대 한 생체 외에서 organotypic 시스템에서 성장. 이 기간 동안, 특정 신호 통로의 약리 변조 배양5,7약물을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 교양된 조직 생체 외에서 성장의 모든 단계에서 수집 된 수 있습니다 하 고 유전자 발현에 대 한 조사 (정량, microarrays, 등등과 같은 메서드를 사용 하 여).

두 번째 단계에서 48 h 교양 조직 다음 닭 (c) 배아 배아 날 (E) 8 (cE8)의 캠에 융합은 (햄버거와 해밀턴 (HH)-33-35 단계)8. 캠은 영양분의 혈관 공급 동작 고 가스 교류1,,34 이식할된 조직을 그것의 개발에서 비켜에서 오랜 시간에 대 한 사용을 허용 한다. 이 실험 단계는 특히 적합 organogenesis의 늦은 단계 공부로 비켜 개발5,,910,11의 10 일 후 완전히 형성된 장기를 얻을 수 있습니다. . 형태소 분석은 쉽게 적절 한 기관 형성을 확인 하기 위해 전통적인 조직학 수행 하며 세포의 기증자 기원 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, MAb 메 PeriNuclear (QCPN))를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 캠 잠복기 동안 이식 또한 수 약리학 대리인의 면 전에 서 성장 하 고 organogenesis의 진행을 평가 하는 개발의 모든 단계에서 수집 된.

깊이, 여기에 설명 된 2 단계 접근 방식은 이미 Figueiredo 외 에 고용 되어 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발 탐험 5 . 따라서, 배아 영토의 고유의 특성 및 thymus의 부 갑 상선 동맥은 organogenesis에 관련 된 개발의 단계 아래에 표시 됩니다.

Thymus 및 부 갑 상선 동맥 epithelia, 하지만 기능적으로 고유에서 파생 pharyngeal 주머니의 endoderm (PP)12. 조류, 이러한 장기의 epithelia에서에서 발생 한 제 3의 그리고 제 4 PP endoderm (3/4PP)12, 포유류에서 thymic 상피는 3PP에서 파생 하 고 부 갑 상선 땀 샘의 상피 3PP 3/4PP 마우스에서와 인간에서 파생 하는 동안 각각13,은14입니다.

이러한 장기의 형성에서 초기 단계 중 개별 thymus 및 일반적인 primordium에서 부 갑 상선 도메인의 출현 이다. 치킨, E4.515에서 특정 분자 마커와 제자리에서 교 잡 하 여 이러한 도메인을 확인할 수 있습니다. 개발 진행, 이러한 장기 초보 개별화 하 고 신경 크레스트 파생 된 세포에 의해 형성 된 얇은 엽 캡슐 (E5;에서 그들을 포위 하는 동안에 인 두에서 분리 HH-stage 27). Thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (E6.5;에 의해 식민지는 나중에, HH-stage 30)12.

클래식 메 추 라 기-치킨 연구1,12에서 2 단계 접근 림프/조 혈 기관, 즉 thymus5의 형성 연구에 특히 유용 하다. 메 추 라 기는 explant, 기관 rudiment와 서 투입은 조 혈 조상 세포 식민 이전 닭 배아, 공상 thymus 메 thymic 상피 대응 침투 닭 혈액을 매개로 조상 세포로 형성 된다. 이 방법은, 따라서 조류 hemato/림프 시스템의 개발에 조 혈 모 세포의 기여를 탐험 하는 유용한 도구입니다.

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프로토콜

이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.

1. 수정된 메 추 라 기 계란의 부 화

  1. 품 어 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)와 닭고기 (갈 루스 갈 루스) 수정 된 달걀 3, 8 일, 각각.
    1. 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 향하도록 공기 챔버 (계란 무뚝뚝한 끝)와 계란 배치
    2. 약 20 메 추 라 기 계란과 40 닭 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하.
      참고:이 숫자는 처음으로이 절차를 설정할 때 배가 되어야 한다.

2. 절연 Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 메 추리 배아 영역의

참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.

  1. 에 대 한 큰 붕 규 산 유리 그릇을 준비 3/4 가득 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션.
  2. 껍질을 활용 하 여 원형 개통의 무뚝뚝한 끝의 반대 측에 곡선가 위 메 추 라 기 계란을 외피의 3 일 후 엽니다. 조심 스럽게 껍질 제거 하 고 차가운 PBS 가득 유리 그릇에 배아를 전송.
  3. E 3에서 메 추 라 기 (q) 배아를 잡고 (qE3) (메 추 라 기 단계에 해당 하는 닭의 HH 단계 21) 얇은 겸의 도움으로. 노 른 자 곡선된가 위를 사용 하 여 포함 하는 vitelline 막에 상처를 확인 합니다. 잘라 및 외부 여분의 배아 혈관의 둘레를 계속 합니다.
  4. 양도 작은에 배아 그릇 약 3/4 차가운 PBS 얇은 겸의 도움으로 가득. 나머지 연결 된 노 른 자에서 배아는 철저 하 게 세척.
  5. 스키 머를 사용 하 여 100 m m 유리 블랙 기본 페 트리 접시에 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하.
  6. 아래는 stereomicroscope 페 트리 접시를 놓습니다.
    참고:이 시점에서 앞으로, 진보적인 확대에 대 한 미세 절차는 stereomicroscope 아래를 수행 합니다. 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 조명을 사용 하는 것이 좋습니다.
  7. 얇은 곤충 핀 접시의 바닥에는 배아를 잡으십시오. 여분 미 발달 지역에 사각형 모양을 형성 하는 4 개의 핀을 배치 합니다.
  8. 얇은 겸의 도움으로 두 부 영역의 여분의 배아 세포 막을 제거 하 고 거기 5 핀을 배치.
    참고: 경우 태아는 올바르게, 다음 otic 소포, 심장 관 1성, 2nd및 3rd 인 두 아치 (Pa) 표시 되어야 합니다.
  9. Wecker 눈이 위를 사용 하 여 관심, 즉, 3층 및 4회 인 두 아치 지역 (3/4PAR)의 미 발달 지역의 해 부.
    1. 배아 축 somite/신경 튜브 영역과 파 사이 경도 평행을 절단 시작 합니다.
    2. 그것을 절단 하 여 ventrally 위치 심장 튜브를 제거 합니다. 같은 위치에 유지가 위, 컷의 방향으로 태아 위치를 페 트리 접시 회전.
    3. 2차 및 3rd 파 사이 잘리고 실바 4번째 아래
    4. 얇은 포 셉의 도움으로 3/4PAR에서 나머지 막 분리 합니다.
  10. 격리 된 조직 (3/4PAR) 및 유리 접시 3/4에 그들 가득 차가운 PBS 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 전송 발음.
    참고:이 하, 조직 성장 생체 외에서 최대 48 h 또는 수 E8에서 닭 배아의 캠에 즉시 투입 될.
  11. 생체 외에서 시험 준비 하는 동안 얼음에 격리 된 3/4PAR를 포함 하는 유리 접시를 유지.

3. 생체 외에서 Organotypic 분석 결과: Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역의 문화

  1. 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다.
    참고: 약리 성 시 약은 매체 (예를 들어 LY-411.575 (정) 및 디-benzazepine 또는 cyclopamine 그리고 vismodegib, 노치 및 Hedgehog (Hh) 신호 경로 각각 하에 추가할 수 있습니다. 이 분석 결과 대 한 광의 50-200 nM 또는 디 benzazepine의 5-15 µ M를 사용 하 여 노치 3에 신호 억제/4PAR. 3/4PAR5에서 Hh 신호를 억제 하기 위해 cyclopamine의 20 µ M 또는 vismodegib의 10 µ M를 사용.
  2. 6 잘 플레이트에서 3/4PP explant의 생체 외에서 문화를 준비 합니다.
    1. 6 잘 플레이트에서 한 잘 문화 매체의 5 mL을 채우십시오. 24 m m 폴 리 카보 네이트 막 삽입 장소 ( 테이블의 자료를 참조)에 얇은 겸의 도움으로 잘.
    2. Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 막 표면에 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드럽게 밀어 넣어 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 막 삽입 당 최대 7 explants 추가 합니다. 3.4 단계로 진행 합니다.
  3. 또는, 문화 explants 부동 멤브레인 필터에.
    1. 35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL을 준비 합니다. 얇은 포 셉, 멤브레인 필터 ( 재료의 표참조) 시키고 공기와 접촉 건조 표면 부동의 도움으로.
    2. Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 멤브레인 필터를 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩으로 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 멤브레인 필터 당 최대 8 explants 추가 합니다.
  4. 조심 스럽게 explants 3.2 및 3.3 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 단계에 놓습니다.
  5. 48 h 잠복기 후 인큐베이터에서 6 잘 플레이트와 35 mm 페 트리 접시를 제거 합니다.
    1. 6 잘 플레이트의 막 삽입에서 교양된 explants를 수집 합니다.
      1. 실 온 (RT)에서 막 삽입 PBS를 추가 합니다.
      2. 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 활발 한 홍 조 explants는 막에서 분리 합니다.
      3. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 실시간에 PBS를 가진 채워진 유리 접시 3/4에 교양된 explants 전송
    2. 마찬가지로, 35 mm 페 트리 접시에에서 떠 있는 멤브레인 필터에서 교양된 explants를 수집 합니다.
      1. 실시간에 PBS를 가진 채워진 새로운 35mm 페 트리 접시에 얇은 집게와 멤브레인 필터를 전송
      2. 활기찬 pipetting 사용 하 여 2 mL의 멸 균 플라스틱 피펫은 explants 멤브레인 필터에서 분리 합니다.
      3. 얇은 포 셉의 도움으로, 그것에 연결 된 아무 explants 남아 확인 후 explant 무료 멤브레인 필터를 방전.
      4. 주걱과 얇은 집게, 전송 explants 유리 접시에 담긴 실시간에서 PBS
  6. 총 RNA 격리에 대 한 시 약의 1 mL를 주걱으로 교양된 explants 전송 및 유전자 발현 연구에 대 한 사용.
    주의: 이 시 약에 노출 ( 재료의 표참조) 심각한 건강 위험 수 있습니다. 적절 한 보호 안경, 의류, 장갑 착용. 처리 지시 하 고 제조업체에서 제공 하는 안전 데이터 시트를 읽어.
  7. 또는, E8에서 닭 배아의 캠에 교양된 조직 이식. 4 단계를 따릅니다.

4입니다. 카메라의 준비

  1. 인큐베이터에서 배아 발달의 8 일 닭 계란을 제거 합니다.
    참고: 계란 습도 인큐베이터에서 38 ° C에서 위쪽으로 직면 하는 공기 챔버와 인 큐베이 팅 했다.
  2. 공기 챔버에 떨어지는 포탄의 조각을 방지 하기 위해 투명 한 플라스틱 테이프와 계란의 무뚝뚝한 끝을 커버. 셸을 누르고 곡선가 위 계란에 원형 개통을 잘라. 공기 챔버 표시 되어야 합니다.
  3. 제거 주의 공기 챔버의 흰색 막 얇은 집게와. 캠은 다음 볼 수 및 소성 조직 이식에 대 한 접근.
    참고: 이후 PBS 슬라이딩과 방치는 explants의 촉진이 이식, 전후 캠, 수 화를 PBS를 사용 하지 마십시오. 막 밖으로 건조, 계란을 폐기.

5. 교양된 Explants는 캠에의 접목

  1. 에 홀더 microscalpel와 카메라의 작은 혈관에서 작은 혈관 병 변/상처를 만듭니다.
    참고: 주입구 과잉 출혈의 경우에 의해 혈액을 제거 하는 파스퇴르 피 펫의 끝을 사용 합니다.
  2. 주걱과 얇은 집게를 사용 하 여 카메라의 부상 영역 교양된 explant 전송.
  3. 필터 종이 explant 보다 약간 잘라내어는 explant 위에 그것을 배치.
    참고: 필터 종이 캠에 개발 후 explant 위치를 추적 도움이 됩니다. 또한, 그것은 매일 약 하 배달을 허용는 explant 비켜에서 개발 하는 동안 필요한 경우 (5.6 단계에서 설명).
  4. 투명 한 플라스틱 테이프와 계란 창 인감 및 목탄 연필을 사용 하 여 식별 합니다.
    참고: 플라스틱 테이프는 잠복기 동안 탈수에서 태아를 보호 한다.
  5. 38 ° c.에 습도 인큐베이터에서 10 일 동안 조작된 달걀을 품 어 6 단계를 따릅니다.
  6. 선택적 단계: 잠복기 동안 매일 약물 행정.
    1. 필터에 액세스 하려면 부분적으로 플라스틱 테이프를 들어올립니다. 마약 솔루션, 드롭 들러, 종이 위에 100 µ L를 추가 합니다. 다시 창 및 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 다시 계란을 배치
      참고:이 분석 결과 대 한 cyclopamine의 20 µ M의 복용량은 억제 비켜 개발5동안 Hh 신호.

6. 소성 기관 형성 카메라에 비켜에서 개발의 10 일 후

  1. 10 일 후 부 화, 인큐베이터에서 달걀을 제거 하 고 플라스틱 테이프를 신중 하 게 철회.
  2. 캠 곡선된가 위 및 작은 유리 필터 종이 캠 파생 explant 약 3/4 차가운 PBS 가득 그릇을 사용 하 여 필터 영역에 주위 잘라.
  3. 얇은 겸의 도움으로 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 캠 파생 explant 100 mm 페 트리 접시에 전송. 부드럽게 필터 종이 Wecker 눈이 위를 사용 하 여 집게를 얇은 막의 과잉을 제거 합니다.
  4. 캠-explant 통 솔루션에 전송 (3.7 %PBS PFA) 스키 머와 함께. 큰가 위의 도움으로 태아의 목 지역에 정확한 컷 하 여 난 자에서 그들을 제거 하지 않고 닭 배아를 안락사.
  5. 전통적인 조직학 및 immunohistochemistry 캠 파생 explants의 파라핀 섹션에서 기관 형성을 평가 합니다.

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결과

위의 설명 프로토콜 세부 사항을 조사의 두 초기-및-의 후기 종종 복잡 한 세포 및 분자 상호 작용에 의해 제한 organogenesis 허용 하는 방법.

이 방법은 이전 Figueiredo 외 에 고용 되었다 노치와 Hh 신호 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발에서의 역할을 해명 하기 5 .

여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2 organogenesis의 동일한 모델을 사용 하 여 표시 됩니다. 그림 1A ...

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토론

이 방법의 성공에 대 한 중요 한 측면은 품질 닭고기와 메 추 라 기의 달걀. 고려는 긴 부 화 기간, 특히 에 비켜 분석 결과, 계란의 좋은 품질 향상 생존 프로시저의 끝으로 (최대 90%까지) 요금. 이를 위해, 다른 공급 업체에서 계란을 테스트 합니다. 오랜 기간 동안 unmanipulated 알을 품 어 (최대 16-17 일) 그들의 발달을 체크 하 고. 좋은 품질의 일괄 처리로 간주, 배아의 80% 이상이 정상적인 발전을 제시 해야 합니다. 그것은 또한 각 인큐베이션 단계 끝에 진정한 대표 성과 신뢰성 보장을 재현할 수 동기 발달 단계를 제공 합니다 확인 하는 것이 중요. 달걀 껍질 다공성으로 인해 모든 계란 부 화 단계에 대 한 인큐베이터에서 습도 분위기를 유지 합니다. 환경 오염을 방지 하려면 항생제 절차 (선택 사항)에서 PBS 솔루션에 추가할 수 있습니다.

이 메서드는 메 추 라 기 기관 초보를 절연 하 고 48 h에 대 한 organotypic ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 원고, Padma Akkapeddi 비디오 나레이션 대 하의 중요 한 독서에 대 한 안토니오 Cidadão, 이사벨 Alcobia, 레오노르 Parreira를 감사 고 Instituto de Histologia 전자의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 우리는 친절 하 게 제공 stereoscope Interaves 비디오 시스템을 장착 하기 위한 Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
닭 수정란 (Gallus gallus)Pintobar, Portugal가금류 농장 
메추라기 수정란 (Coturnix coturnix)Interaves, PortugalBird farm 
15 mL PP 원심분리기 튜브Corning430052
50 mL PP 원심분리기 튜브Corning430290
60 x 20 mm 파이렉스 접시Duran 그룹21 755 41
100 x 20 mm 파이렉스 접시Duran 그룹21 755 48
폴리카보네이트 멤브레인 인서트 Corning341224mm 트랜스웰과 0.4mm 포어 폴리카보네이트 멤브레인 인서트 
멤브레인 필터MilliporeDTTP013000.6 mm Isopore 멤브레인 필터
6-웰 배양 플레이트Nunc, Thermo Fisher Scientific140675
Petri dish, 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112 
파이렉스 그릇 
트랜스퍼 피Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 mL 플라스틱 피펫
유리 파스퇴르 피펫normax5426015
Whatman  슈퍼마켓WHA1001090필터 종이
투명 플라스틱 테이프 
사이토케라틴(팬, 산성 및 염기성, 유형 I 및 II 사이토케라틴), 클론 Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
사이클로파민 수화물시그마-알드리치C4116Hh 신호의 약리학적 억제제
소 태아 혈청Invitrogen, Thermo Fisher ScientificStandart FBS
파라포름알데히드시그마-알드리치P6148
페니실린-스트렙토마이신인비트로젠, Thermo Fisher Scientific15140-122
인산염 완충 식염수 (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN 항체발달 연구 하이브리도마 은행QCPN
RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제 GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B 실리콘 엘라스토머 1.1Kg 키트ELKEM/SilmidRH141001KG페트리 접시
Stemolecule LY411575Stemgent04-0054Pharmacological inhibitor of Notch signalling
TRIzol ReagentInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15596026Reagent for total RNA isolation
Dumont #5 펜치파인 사이언스 도구11251-30 얇은 집게
매우 세밀한 Bonn 가위, 곡선Fine Science Tools14085-08곡선형 가위
곤충 핀 파인 사이언스 도구26001-30
마이크로 스패튤라 Fine Science Tools10087-12이식 스푼
Minutien 핀Fine Science Tools26002-20Microscalpel
Moria Nickel Plated Pin 홀더Fine Science Tools26016-12홀더
Moria Perforated SpoonFine Science Tools10370-17Skimmer
Wecker Eye ScissorFine Science Tools15010-11
카메라라이카 마이크로시스템즈 MC170 HD
스테레오스코프라이카 마이크로시스템즈 라이카 M80
현미경라이카 마이크로시스템즈 DM2500
슈퍼마켓에서 파는 펫 에서 판매하는 품질 형 시리즈

참고문헌

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