절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

요약

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

초록

Microglia 모든 중앙 신경 시스템 (CNS) 세포의 5-10%를 대표 하 고는 점점 더 주목 그들의 공헌으로 인해 개발, 항상성, 및 질병. 세포 연구 세부에 십 년간, microglia의 특수 기능, CNS의 주민 조직 대 식 세포, 비록 성숙 microglial를 정리 하는 능력에서 제한 때문에 부분에서 크게 신비 남아 있다 문화에서 속성입니다. 여기, 우리는 성숙한 쥐 두뇌에서 순수한 microglia의 신속한 격리에 대 한 간단한 절차를 보여 줍니다. 우리는 또한 시간이 지남에 microglial 생존 능력의 높은 수준을 지 원하는 혈 청 무료 문화 조건을 설명 합니다. 이 정의 매체 조건 하에서 경작 Microglia 전시 정교한 없는 프로세스와 동적 감시 동작. 우리는 교양된 microglia에 혈 청 노출의 일부 효과 설명 하 고 이러한 혈 청 무료 문화 microglia 시내 vivo으로 혈 청 노출 문화 모두를 비교 하는 방법에 대해.

서론

CNS 실질의 대 식 세포로 microglia 신경 회로 폐해 신호 네트워크의 광대 한 배열을 상호 작용 합니다. 그들은 개발 및 시 냅 스의 가지 치기, apoptotic 세포 클리어런스 및 신경 프로세스^1,2과도 상호 작용을 통해 뇌의 항상 성에 중요 한 역할. Microglia는 선 동적인 응답을 조정 및 제한 출혈^3,4병 변 사이트에 그들의 길고, 얇은 프로세스를 확장 하는 신경 상해에 초기 응답자. Microglial 형태 및 기능에 변화는 급성 및 만성 CNS 상해에 유비 쿼터 스와 microglia 전시 변경 형태학, 지역화, 그리고 다양 한 질병 상태¹에 염증 성 중재자의 표현. 인간 유전자 연구는 신경 퇴행 성 질환에 대 한 위험을 변경 하는 돌연변이 종종 주로 또는 독점적으로 표현 microglia microglia 질병 병 인 또는 진행^{5에 대 한 중요 한 역할을 가리키는 그대로 CNS에 의해 나타냅니다.} . 상해 및 질병에 그들의 굴지를 감안할 때, 새로운 치료 접근을 개발 하기....

프로토콜

설치류와 관련 된 모든 절차 스탠포드 대학 지침, 국가 및 국가 법률 및 정책 준수에 맞 췄 나. 모든 동물 절차는 실험실 동물 관리에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 승인 되었다.

참고: 모든 솔루션 및 버퍼 구성 재료의 테이블에에서 제공 됩니다.

1. CD11b Immunopanning (하루 0)에 대 한 페 트리 접시를 준비

참고: 모든 1-2 청소년 쥐 두뇌에 대 한 1 immunopanning 접시를 준비 합니다.

1. 15 cm 배양 접시를 50 mM Tris pH 9.5 솔루션의 25 mL를 추가 합니다.
2. 6 µ g/mL의 최종 농도 대 한 접시에 염소 반대로 마우스 IgG (체인 H + L)를 추가 합니다. 균일 하 게 배포 플레이트를 소용돌이 친다.
3. 1-3 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
4. 린스 요리 세 번 DPBS^{+ +} (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +}), 다음 1 µ g/mL OX42 항 체를 포함 하는 버퍼를 패닝의 솔....

결과

이 프로토콜 젊은 쥐에서 문화 고 순도 ramified microglia를 방법을 설명합니다. 비슷한 결과 얻어질 수 있다, 주 미 숙 하 고 성인 동물을 사용 하 여 아래 설명 된 대로. 셀 격리는 종종 미묘한 뉘앙스와 죽을 셀에 대 한 많은 기회를 포함, 우리는 다양 한 단계에서 성공을 확인 하는 데 품질 관리 검사점을 사용. 우리는 일반적으로 셀 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 격리 프로토콜 (그림 1A)의 여러 단계에서 모니터링 합니다. 성공적인 격리 2.5-5 10⁵ 셀/청소년 동물 배를 양보 한다. P7-P15에서에서 동물 반면 P30 보다 더 오래 된 동물에서 분리 된 세포 가까이 10⁵ 세포/동물 x 2.5 수익률 10⁵ 세포/동물, x 5에 가까운 수익률을 보여줍니다. 총 셀 모니터링 넘어 프로토콜을 통해 건의 그것은 microg.......

토론

Microglia CNS의 센 티 넬 면역 세포 역할을, 때문에 그들은 높은 반응 환경 변화; 따라서, 주의 그들의 고립과 문화⁸동안 셀 내에서 선 동적인 응답을 최소화 하기 위해 필요 합니다. 이것은 속도 온도 통해이 프로토콜에서 수행 됩니다. 동물 차가운 관류 버퍼 끼얹는다는 가능한 크게 저하 활성화, 모든 원심 분리 단계 4 ° C에서 열릴 때마다 얼음에 또는 4 ° C에서 세포를 유지, 그리고 프로토콜 조직 사이 시간을 최소화 간소화 되었습니다. 추출 하 고 세포의 경작입니다. 갓 고립 된 세포의 유전자 표현 패턴을 평가 하는 경우 세포 lysates trypsinization 최소한 절연 유도 된 변화를 계속 하기 전에 CD11b immunopanning 요리에서 직접 수확. 주목 해야 한다도 신중 하 게 고립 된 해당 microglia 실행의 본질적으로 격리 절차와 관련 된 피해 관련 신호 인식, 아마도 따뜻한 온도에 배치 되 고 즉시 염증 반응. 프로토콜을 성공적으로 수행한.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
쥐 : Sprague-Dawley	Charles River	Cat # 400
마우스 안티 쥐 CD11b 단클론 (클론 OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	패닝 : 1 : 1,000; 염색: 1:500
염소 다결장 항-IBA1	Abcam	Cat# AB5076	염색: 1:500
토끼 다클론 항-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 항-마우스 594	Invitrogen	Cat# 11055	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 항-염소 488	Invitrogen	Cat# A-21203	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	염색: 1:500
Triton-X (ICC 염색 시 세제)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
펩톤	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
쥐 IL-34	R& D 시스템	Cat# 5195-ML/CF
양모 콜레스테롤	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
콜라겐 IV	코닝	Cat# 354233
올레산	케이맨 화학	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) 산	케이맨 화학제품	Cat# 20606
Calcein AM 염료	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
페니실린/ 스트렙토마이신	Gibco	Cat# 15140-122
글루타민	Gibco	Cat# 25030-081
N-아세틸 시스테인	Sigma	Cat# A9165
인슐린	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
나트륨 셀레나이트	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (고포도당)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
폴리-D-라이신	시그마	Cat# A-003-E
Primaria 플레이트	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
재고 시약
Apo-transferrin			재구성: PBS 에 있는 10 mg/mL 사용된 농도: 1:100 저장: -20°C; C
N-아세틸 시스테인			재구성 : H2O 에서 5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C
나트륨 셀렌 산염			재구성 : H2O 에서 2.5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 25,000 저장 : -20 °C; C
콜라겐 IV			재구성 : 200 μ PBS의 g/mL 사용된 농도: 1:100 저장: -80°C; C
TGF-b2			재구성 : PBS 에서 2 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 < / > 저장 : -20 °C; C
IL-34			재구성 : 200 μ PBS의 g/mL 사용된 농도: 1:1,000 저장: -80°C; C
양모 콜레스테롤			재구성 : 100 % 에탄올에서 1.5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 < / > 저장 : -20 °C; C
헤파란 설페이트			재구성 : H2O 에서 1 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C
올레산/곤도산			재구성: 곤도익: 0.001 mg/mL; 올레산 : 100 % 에탄올에서 0.1 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C
헤파린			재구성 : PBS 에서 50 mg / mL 사용 농도 : 1 : 100 저장 : -20 °C; C
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Solutions
관류 버퍼			레시피: 50 μ g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 코멘트: 얼음처럼 차가울 때 사용
버퍼			레시피: 200 μ L DPBS 50 mL에 0.4 % DNaseI의 >< 코멘트 : 얼음처럼 차가운
패닝 버퍼
			: 100 units / mL 페니실린, 100 &mu를 포함하는 DMEM / F12; g/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 5 &μ; g/mL N-아세틸 시스테인, 5 μ g/mL 인슐린, 100 μ g/mL 아포 트랜스페린 및 100ng/mL 아셀렌산나트륨 코멘트: 얼음처럼 차가운 MGM을 사용하여 접시에서 미세아교세포를 제거합니다.
콜라겐 IV 코팅			레시피 : MGM 함유 2 μ g/mL 콜라겐 IV
미엘린 분리 버퍼			레시피: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ 및 Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 &뮤; L 1 M MgCl2 코멘트: 첨가 후 잘 섞어주세요  CaCl2 및 MgCl2
TGF-b2/IL-34/콜레스테롤 함유 성장 매체(TIC)			조리법: 인간 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL 쥐 IL-34, 1.5 &mu를 함유한 MGM; g/mL 양모 콜레스테롤, 10 μ g/mL 헤파란 황산염, 0.1 μ g/ml 올레산, 및 0.001 μ g/ml 곤도산 코멘트: 37°C로 데워진 매체에 콜레스테롤을 추가하는 것을 확인하십시오 ° C를 선택하고 1.5 이상을 추가하지 마십시오 μ g/mL 또는 침전됩니다. 콜레스테롤 함유 매체를 여과하지 마십시오. 최적의 pH를 보장하기 위해 세포에 추가하기 전에 30분-1시간 동안 TIC 배지를 10% CO2로 평형을 이룹니다.

우유 고형물에서 나온 레시피 : DPBS ++ Microglia 성장 배지 (MGM)의 우유 고형물에서 펩톤의 2 mg / mL 레시피