절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

요약

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

초록

Microglia 모든 중앙 신경 시스템 (CNS) 세포의 5-10%를 대표 하 고는 점점 더 주목 그들의 공헌으로 인해 개발, 항상성, 및 질병. 세포 연구 세부에 십 년간, microglia의 특수 기능, CNS의 주민 조직 대 식 세포, 비록 성숙 microglial를 정리 하는 능력에서 제한 때문에 부분에서 크게 신비 남아 있다 문화에서 속성입니다. 여기, 우리는 성숙한 쥐 두뇌에서 순수한 microglia의 신속한 격리에 대 한 간단한 절차를 보여 줍니다. 우리는 또한 시간이 지남에 microglial 생존 능력의 높은 수준을 지 원하는 혈 청 무료 문화 조건을 설명 합니다. 이 정의 매체 조건 하에서 경작 Microglia 전시 정교한 없는 프로세스와 동적 감시 동작. 우리는 교양된 microglia에 혈 청 노출의 일부 효과 설명 하 고 이러한 혈 청 무료 문화 microglia 시내 vivo으로 혈 청 노출 문화 모두를 비교 하는 방법에 대해.

서론

CNS 실질의 대 식 세포로 microglia 신경 회로 폐해 신호 네트워크의 광대 한 배열을 상호 작용 합니다. 그들은 개발 및 시 냅 스의 가지 치기, apoptotic 세포 클리어런스 및 신경 프로세스^1,2과도 상호 작용을 통해 뇌의 항상 성에 중요 한 역할. Microglia는 선 동적인 응답을 조정 및 제한 출혈^3,4병 변 사이트에 그들의 길고, 얇은 프로세스를 확장 하는 신경 상해에 초기 응답자. Microglial 형태 및 기능에 변화는 급성 및 만성 CNS 상해에 유비 쿼터 스와 microglia 전시 변경 형태학, 지역화, 그리고 다양 한 질병 상태¹에 염증 성 중재자의 표현. 인간 유전자 연구는 신경 퇴행 성 질환에 대 한 위험을 변경 하는 돌연변이 종종 주로 또는 독점적으로 표현 microglia microglia 질병 병 인 또는 진행^{5에 대 한 중요 한 역할을 가리키는 그대로 CNS에 의해 나타냅니다.} . 상해 및 질병에 그들의 굴지를 감안할 때, 새로운 치료 접근을 개발 하기 위한 높은 우선 순위는 microglial 생물학의 이해 발전.

Microglial 생물학의 이해에 많은 중요 한 발전 기술과 문화 방법, 기능 정의 진 식 프로필, 등 다른 대 식 세포 인구의 학문에서 발견 하는 메커니즘을 바탕으로 발현 형태 / 상태. 대 식 세포 기능 CNS 풍경 내 놀라운 방법으로 자주 연주 일반화 microglia 스스로 매우 전문, 전시는 없는 형태 그리고 다른 조직 들을 차별 하는 독특한 유전자 식 서명 대 식 세포⁶. Microglia는 혈통은 다른 대부분의 다른 조직 대 식 세포; 그들은 원시 조의 초기 배아 파도 동안 CNS 식민지 하 고 자기 인생에 걸쳐, 최종 조⁷에서 기여의 독립 갱신. 성인 microglia의 완전히 성숙한 진 식 서명 하지 두 번째 출생 후 주⁸까지 이루어집니다. 주위 조직에서 환경 신호 특정 조직 대 식 세포 기능⁶, CNS에서 포함 하는 혈액-뇌 장벽⁹에 의해 부여 된 혈액 부담 요인에 제한 노출을 지시에 주요 역할을 한다.

완전히 microglial 기여 CNS 항상성 및 질병을 이해 하는 데 하나의 장애물은 업과 성숙한 microglia 본 비보에 순화 된 세포의 특수 속성의 어려움 생체 외에서. 많은 방법은 격리 하기 위해 개발 되었습니다 그리고 세포 생존을 지원 하기 위해 혈 청에 의존 하는 문화 그대로 microglia, 하지만 대부분의 방식. 우리는 본질적으로 가변 시 생리 활성 분자의 광대 한 배열을 포함 하는, 특히 문제가 microglia 작업 amoeboid 형태학 촉진 하기 때문에 증가 확산, 혈 청의 그 추가 나타났습니다 그리고 microglia 혈액-뇌 장벽 파괴 후 요소를 부담 하는 혈액에 노출 되 면 증가 먹어서⁹ vivo에서 수시로 보인다. 이 통계에 의해 혈 청 노출 셀 부상이 나 질병 상태, microglia 비슷하지만 이러한 변경 감소 때 microglia CSF-1 (또는 IL-34)를 포함 하는 정의 된 성장 매체, TGF-β, 콜레스테롤, 및 selenite 교양.

이 프로토콜 조건 하에서 혈 청 무료, 최근에 출판 된 작품⁹관련 청소년 쥐 microglia 경작에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜에서 출생 후 하루 21-30 (P21-P30), 쥐를 간소화 하지만 수율과 전반적인 생존 종 및 동물의 나이 따라 달라 집니다 하지만 microglia 쥐 및 쥐의 모든 나이에서 분리를 적용할 수 있습니다. 최대한 하 고 최적의 생존 때 약간 미 숙 microglia를 사용 하 여 얻을 수 있다 (~ P9), 수율 및 점차적으로 성인 동물에 있는 저수준에 다소 가늘게 생존. Microglia 또한 마우스에서 격리 될 수 있습니다 하지만 우리는 쥐 세포 보여 상당히 높은 수익률, 생존, 그리고 없는 형태학의 복잡성 마우스 셀 세럼 무료 문화에 비교 될 때 나타났습니다. 동물 세 P50 보다 큰이 프로토콜 평가 되지 않았습니다. 이 immunopanning 격리 절차는 격리 하는 동안 microglial transcriptional 프로필에 변화를 최소화 하 고 셀의 다운스트림 생존 능력을 극대화 하기 위해 최적화 되었습니다. 이러한 기술과 미디어 공식 사용, 높은 생존 능력 주 문화는 주에 대 한 지속 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 경작 Microglia 급속 한 확장 및 프로세스의 철회와 관련 된 매우 없는 형태를 전시 하 고 상대적으로 낮은 확산의 속도. 우리는 이러한 속성에 대 한 혈 청 노출의 중요성을 강조 하 고 힘과 다른 접근에 상대적으로이 방법의 약점을 토론.

프로토콜

설치류와 관련 된 모든 절차 스탠포드 대학 지침, 국가 및 국가 법률 및 정책 준수에 맞 췄 나. 모든 동물 절차는 실험실 동물 관리에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 승인 되었다.

참고: 모든 솔루션 및 버퍼 구성 재료의 테이블에에서 제공 됩니다.

1. CD11b Immunopanning (하루 0)에 대 한 페 트리 접시를 준비

참고: 모든 1-2 청소년 쥐 두뇌에 대 한 1 immunopanning 접시를 준비 합니다.

1. 15 cm 배양 접시를 50 mM Tris pH 9.5 솔루션의 25 mL를 추가 합니다.
2. 6 µ g/mL의 최종 농도 대 한 접시에 염소 반대로 마우스 IgG (체인 H + L)를 추가 합니다. 균일 하 게 배포 플레이트를 소용돌이 친다.
3. 1-3 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
4. 린스 요리 세 번 DPBS^{+ +} (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +}), 다음 1 µ g/mL OX42 항 체를 포함 하는 버퍼를 패닝의 솔루션 바꿉니다. 평평한 표면에 실 온에서 하룻밤 요리를 둡니다.

2. 조직 컬렉션 (1 일)

참고:이 프로토콜은 3 ~ 4 h 소요 됩니다.

1. 시작 하기 전에, 모든 솔루션은 살 균 및 냉장 얼음에 확인 합니다. 얼음에 모든 악기를 진정 하 고 에탄올을 사용 하기 전에 소독.
2. 적절 한 규제 절차에 따라 이산화탄소 질 식에 의해 청소년 실험실 쥐를 희생.
   참고: 또는, 젊은 동물 수 희생 케 타 민/xylazine (100-200 µ L 24 mg/mL의 마 취 제, 2.4 mg/mL xylazine)의 치명적인 복용량. 케 타 민/xylazine 동물 14 일 미만 경우 사용 되어야 한다. 여러 동물을 사용 하 여, 하나의 동물에서 조직을 추출 하 고 이후 동물에 진행 하기 전에 얼음에 미리 냉장된 DPBS^{+ +} 에 배치.
3. 핀치는 hindpaw 하 고 진행 하기 전에 동물에서 완전 한 응답을 확인 합니다.
4. Transcardially perfuse 버퍼 실행 취소 될 때까지 27½-G 바늘을 사용 하 여 차가운 관류 버퍼의 10-30 mL를 가진 동물.
   참고: 볼륨 관류 버퍼의 동물의 크기/나이 따라 달라 집니다.
5. 재 관류 후 즉시 동물의 머리를 제거 합니다. 해 부가 위, 양쪽에 후 두 관절 돌기를 잘라 척수에서 오는 될 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. 각 측면을 신중 하 게 절단 후 정수 리와 코 뼈를 향해 정면 뼈를 따라 한쪽을 잘라. 집게와 함께 신중 하 게 두개골의 상단을 다시 세우고, 신속 하 게 뇌 (또는 관심의 CNS 구조), 제거 고 미리 냉장된 DPBS⁺ + 얼음에 합니다.
6. 모든 나머지 동물에 대 한 반복 합니다.
   참고: 모든 진행 단계는 적절 한 무 균 조건 하에서 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.

3. 기계적 분리 (1 일)

1. 모든 두뇌가 수집 하 고, 차가운 메스 블레이드, 얼음에 페 트리 접시에 1 m m³ 덩어리로 한 뇌를 잘라 고 5-7 mL 차가운 douncing 버퍼와 얼음 dounce 균질 화기를 전송. 한 번에 하나의 뇌를 분리.
2. 느슨한-피팅 dounce 균질 화기와 10-20 부드럽고 불완전 한 스트로크를 사용 하 여 조직의 해리 알아서 하지 직접 분쇄, 균질 화기의 하단에 조직 하지만 대신 억지로 피스톤의 측면과 균질 화기 사이 공간을 통해 조직.
3. 조심 스럽게 기포의 소개를 방지 하기 위해 피스톤을 제거. 제대로 끊된 조직 덩어리, 균질 화기의 바닥에 정착 하 고 상쾌한 새로운 냉장된 50 mL 원뿔 튜브에 전송.
4. 신선한 douncing 버퍼에 제거 된 볼륨을 바꿉니다 고 3-4 라운드, 또는 모든 조직의 해리 되었습니다 때까지 총 3.2 및 3.3 단계를 반복 합니다. 각 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다.

4. 수 초 제거 (1 일)

참고: 수 초 제거 microglia P12 보다 더 오래 된 동물에서의 절연을 위해 사용 됩니다.

1. 25 mL 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을의 볼륨 측정 다음 33.5 ml 전체 볼륨을 조정 하려면 얼음 douncing 버퍼를 추가 합니다.
2. 세포 현 탁 액을 혼합 수 초 분리 버퍼 (MSB)의 10 mL 추가 철저 하 게 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여. 이 43.5 mL의 볼륨에 MSB의 23% 최종 농도 발생 합니다.
3. 셀 느린 제동 4 ° C에서 500 x g에서 15 분 동안 원심
   참고:는 원심 분리기 감속을 약 1.5-2 분 소요 됩니다. 이 myelin 및 죽은 세포 파편, 다소 어두운 상쾌한, 그리고 라이브 셀에 대 한 풍부 하 게 더 작은 펠 릿의 상위 계층을 생성 합니다.
4. 수 초/파편과는 피 펫과 상쾌한의 상위 레이어를 제거 합니다. 그것의 다량은 가능한 제거를 보장 하기 위해 상위 계층을 분리할 때 주의 합니다.
5. 버퍼를 패닝의 12 mL에서 셀 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 헤어 셀 수 있는 어떤 덩어리 셀 서 스 펜 션 triturate.

5입니다. Immunopanning (1 일)

1. 70 µ m 셀 거르는 큰 파편 또는 셀 덩어리 제거를 통해 세포 현 탁 액을 전달 합니다.
2. 세 번 DPBS^{+ +}와 OX42 코팅 패닝 접시를 헹 구 십시오. 접시를 허용 하지 않습니다 완전히 건조 세척 사이.
3. 마지막 DPBS^{+ +} 세척을 부 어와 패닝 접시에 필터링 된 셀 서 스 펜 션 적용. 부드럽게 셀, 배포 접시 소용돌이 다음 준수를 셀 수 있도록 20 분 동안 실 온에서 평평한 표면에 접시를 품 어. 20 분 이상 품 어 하지 마십시오 또는 셀 매우 어려운 요리에서 복구 될 것 이다.
4. 비 부착 한 세포를 제거 하 DPBS^{+ +} 와 함께 패닝 접시 10 번을 씻어. Microglia 됩니다 그래서 다른 비 부착 한 세포의 제거를 보장 하기 위해 각 린스 접시 소용돌이 플레이트에 단단히 고정 되어.
5. 마지막 DPBS^{+ +} 세척을 부 어와 15 mL DPBS^{+ +} 와 200 μ 트립 신 (1.25% 재고 솔루션)을 바꿉니다.
6. 10% CO₂ trypsinize를 37 ° C에서 ≤ 10 분 요리를 품 어.
   참고: 10 분 이상 계속 하지 마십시오 또는 microglia 제거 하기 어려운 될 것 이다.
7. Trypsinization의 10 분 후 microglia 여전히 접시에 붙어 있을 것입니다. 트립 신/DPBS^{+ +} 를 부 어와 부드럽게 씻어 트립 신을 제거, 얼음 처럼 차가운 microglia 성장 매체 (MGM)의 12 mL 바꿉니다 DPBS^{+ +} 2 x.
8. 셀/기판 상호 작용을 약하게 하 고 접시를 확인 데 접시 2 분 동안 얼음에 이동 하는 장소는 패닝 접시의 영역 밖으로 건조 하지 않도록 플랫.
9. 10 mL 피 펫 및 피펫으로 컨트롤러와 고속 패닝 접시에서 세포를 회복 하기 위해 적극적으로 플라스틱. 시도 하 고 모든 셀을 제거 피 펫에서 액체의 흐름으로 16 × 16 그리드를 그립니다.
10. 세포는 접시에서 분리 되도록 20 배 확대에 현미경으로 세포를 확인 합니다. 어디 셀 여전히 붙어 접시 위에 마크 명소 그리고 그 지역에 pipetting 반복.
11. 셀 서 스 펜션과 15 mL 원뿔 튜브 당 상쾌한의 aliquot 3-4 mL를 수집 합니다. 천천히 브레이크와 4 ° C에서 500 x g에서 15 분 회전 합니다.
    참고: 회전 하는 작은 볼륨을 통해 microglia 셀의 최대 복구 할 수 있습니다.
12. 셀 펠 릿으로 MGM의 0.5 mL를 떠나 상쾌한 발음
13. 나머지 MGM에서 각 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 튜브에서 셀 수영장.
14. Hemocytometer 셀을 계산 합니다.
15. 6 단계-응용 프로그램에 따라 7에에서 설명 된 대로 세포를 플레이트.
16. 10% CO₂와 37 ° C에 문화 세포.
    참고: 셀 일반 미디어 변경 최대 3-4 주 또는 미디어 변경 없이 1 주일에 대 한 문화를 수 있습니다.

6. 현장 조직 문화 접시/Coverslips (주 1) 코팅

1. 24 잘 음이온/양이온 코팅된 조직 문화 접시의 중앙에 직접 콜라겐 IV 코팅의 15 µ L 플레이트 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조) 및 10% CO₂와 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.
2. 후에 MGM에 10⁵/mL x 2.3 hemocytometer 희석 셀과 셀을 카운트. 콜라겐 4 자리를 하 고 즉시이 자리;에 세포 현 탁 액의 접시 15 µ L 발음 이 3.5 x 10³ 셀/자리를 줄 것 이다. 품 어 준수,의 CO_2-500 µ L equilibrated TGF-β2/IL-34/콜레스테롤 포함 성장 매체 (TIC) 추가 셀 수 있도록 10% CO₂ 와 37 ° C에서 5-10 분 동안 부드럽게 잘 하.
3. Coverslips, 10 µ g/mL 계략-D-라이 신 (PDL) H₂O에서 RT, 1 시간에 대 한 첫 번째 코트 불 임 유리 coverslips에 도금 하는 경우 H₂O, 3 번 세척 하 고 후드 UV 빛의 밑에 건조 하자. Coverslips는 건조, 일단은 coverslips에 자리 도금 단계 6.2에서 설명 된 대로 진행.

7. RNA/단백질 격리 도금

1. 하루에 1, 코트는 24-잘 음이온/양이온의 전체 영역 콜라겐 IV 코팅 조직 배양 플레이트를 코팅에 대 일 분-1 시간 10% CO₂, 37 ° c를 품 어 다음 제거 하 고 즉시 접시 3-5 x 10⁴ 셀/CO₂ 잘 equilibrated TIC 미디어입니다.
2. 2 일에 수행 50% 미디어 변화를 각각에 대 한 준비 후 잘 날. 우물의 센터에서 클러스터, 그래서 미디어 거기에서 죽은 세포에 의하여 경향이 있다.
3. 문화를 유지 하기 위해 50% 미디어 변화 2-3 일 마다 수행 합니다. 미디어 변경 문화에 대 한 원치 않는 변수, 소개 셀 미디어 변경, 정기적인 유지 보수와 함께 3 주 이상 반대 없이 대략 1 주 동안 살아남을 수 있습니다.

결과

이 프로토콜 젊은 쥐에서 문화 고 순도 ramified microglia를 방법을 설명합니다. 비슷한 결과 얻어질 수 있다, 주 미 숙 하 고 성인 동물을 사용 하 여 아래 설명 된 대로. 셀 격리는 종종 미묘한 뉘앙스와 죽을 셀에 대 한 많은 기회를 포함, 우리는 다양 한 단계에서 성공을 확인 하는 데 품질 관리 검사점을 사용. 우리는 일반적으로 셀 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 격리 프로토콜 (그림 1A)의 여러 단계에서 모니터링 합니다. 성공적인 격리 2.5-5 10⁵ 셀/청소년 동물 배를 양보 한다. P7-P15에서에서 동물 반면 P30 보다 더 오래 된 동물에서 분리 된 세포 가까이 10⁵ 세포/동물 x 2.5 수익률 10⁵ 세포/동물, x 5에 가까운 수익률을 보여줍니다. 총 셀 모니터링 넘어 프로토콜을 통해 건의 그것은 microg...

토론

Microglia CNS의 센 티 넬 면역 세포 역할을, 때문에 그들은 높은 반응 환경 변화; 따라서, 주의 그들의 고립과 문화⁸동안 셀 내에서 선 동적인 응답을 최소화 하기 위해 필요 합니다. 이것은 속도 온도 통해이 프로토콜에서 수행 됩니다. 동물 차가운 관류 버퍼 끼얹는다는 가능한 크게 저하 활성화, 모든 원심 분리 단계 4 ° C에서 열릴 때마다 얼음에 또는 4 ° C에서 세포를 유지, 그리고 프로토콜 조직 사이 시간을 최소화 간소화 되었습니다. 추출 하 고 세포의 경작입니다. 갓 고립 된 세포의 유전자 표현 패턴을 평가 하는 경우 세포 lysates trypsinization 최소한 절연 유도 된 변화를 계속 하기 전에 CD11b immunopanning 요리에서 직접 수확. 주목 해야 한다도 신중 하 게 고립 된 해당 microglia 실행의 본질적으로 격리 절차와 관련 된 피해 관련 신호 인식, 아마도 따뜻한 온도에 배치 되 고 즉시 염증 반응. 프로토콜을 성공적으로 수행한...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
쥐 : Sprague-Dawley	Charles River	Cat # 400
마우스 안티 쥐 CD11b 단클론 (클론 OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	패닝 : 1 : 1,000; 염색: 1:500
염소 다결장 항-IBA1	Abcam	Cat# AB5076	염색: 1:500
토끼 다클론 항-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 항-마우스 594	Invitrogen	Cat# 11055	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 항-염소 488	Invitrogen	Cat# A-21203	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	염색: 1:500
Triton-X (ICC 염색 시 세제)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
펩톤	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
쥐 IL-34	R& D 시스템	Cat# 5195-ML/CF
양모 콜레스테롤	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
콜라겐 IV	코닝	Cat# 354233
올레산	케이맨 화학	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) 산	케이맨 화학제품	Cat# 20606
Calcein AM 염료	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
페니실린/ 스트렙토마이신	Gibco	Cat# 15140-122
글루타민	Gibco	Cat# 25030-081
N-아세틸 시스테인	Sigma	Cat# A9165
인슐린	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
나트륨 셀레나이트	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (고포도당)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
폴리-D-라이신	시그마	Cat# A-003-E
Primaria 플레이트	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
재고 시약
Apo-transferrin			재구성: PBS 에 있는 10 mg/mL 사용된 농도: 1:100 저장: -20°C; C
N-아세틸 시스테인			재구성 : H2O 에서 5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C
나트륨 셀렌 산염			재구성 : H2O 에서 2.5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 25,000 저장 : -20 °C; C
콜라겐 IV			재구성 : 200 μ PBS의 g/mL 사용된 농도: 1:100 저장: -80°C; C
TGF-b2			재구성 : PBS 에서 2 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 < / > 저장 : -20 °C; C
IL-34			재구성 : 200 μ PBS의 g/mL 사용된 농도: 1:1,000 저장: -80°C; C
양모 콜레스테롤			재구성 : 100 % 에탄올에서 1.5 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 < / > 저장 : -20 °C; C
헤파란 설페이트			재구성 : H2O 에서 1 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C
올레산/곤도산			재구성: 곤도익: 0.001 mg/mL; 올레산 : 100 % 에탄올에서 0.1 mg / mL 사용 농도 : 1 : 1,000 저장 : -20 °C; C
헤파린			재구성 : PBS 에서 50 mg / mL 사용 농도 : 1 : 100 저장 : -20 °C; C
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Solutions
관류 버퍼			레시피: 50 μ g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 코멘트: 얼음처럼 차가울 때 사용
버퍼			레시피: 200 μ L DPBS 50 mL에 0.4 % DNaseI의 >< 코멘트 : 얼음처럼 차가운
패닝 버퍼
			: 100 units / mL 페니실린, 100 &mu를 포함하는 DMEM / F12; g/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 5 &μ; g/mL N-아세틸 시스테인, 5 μ g/mL 인슐린, 100 μ g/mL 아포 트랜스페린 및 100ng/mL 아셀렌산나트륨 코멘트: 얼음처럼 차가운 MGM을 사용하여 접시에서 미세아교세포를 제거합니다.
콜라겐 IV 코팅			레시피 : MGM 함유 2 μ g/mL 콜라겐 IV
미엘린 분리 버퍼			레시피: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ 및 Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 &뮤; L 1 M MgCl2 코멘트: 첨가 후 잘 섞어주세요  CaCl2 및 MgCl2
TGF-b2/IL-34/콜레스테롤 함유 성장 매체(TIC)			조리법: 인간 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL 쥐 IL-34, 1.5 &mu를 함유한 MGM; g/mL 양모 콜레스테롤, 10 μ g/mL 헤파란 황산염, 0.1 μ g/ml 올레산, 및 0.001 μ g/ml 곤도산 코멘트: 37°C로 데워진 매체에 콜레스테롤을 추가하는 것을 확인하십시오 ° C를 선택하고 1.5 이상을 추가하지 마십시오 μ g/mL 또는 침전됩니다. 콜레스테롤 함유 매체를 여과하지 마십시오. 최적의 pH를 보장하기 위해 세포에 추가하기 전에 30분-1시간 동안 TIC 배지를 10% CO2로 평형을 이룹니다.

우유 고형물에서 나온 레시피 : DPBS ++ Microglia 성장 배지 (MGM)의 우유 고형물에서 펩톤의 2 mg / mL 레시피