Zebrafish 최근 연구 개발 하는 동안 DNA 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 사용 되었다. 여기 상세한 프로필 복제 타이밍에 zebrafish 태아를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 프로토콜 돌연변이, 개별 세포 유형, 질병 모델, 그리고 다른 종에서 복제 타이밍을 공부 하기 쉽게 적응 될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
DNA 복제 타이밍은 중요 한 세포 특성, 전시 chromatin 구조, 전사, 및 DNA 돌연변이 속도와 중요 한 관계 이다. 복제 타이밍에 변화가 개발 과정 및 암, 하지만 역할 복제 타이밍 개발에서 활약 하 고 질병 알려져 있지 않다. Zebrafish 최근 연구 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 설립 되었다. 여기 상세한 DNA 복제 타이밍을 결정 하는 제 브라를 사용 하기 위한 프로토콜. 성인 zebrafish 태아에서 셀 정렬 후 다음 세대 시퀀싱 데이터의 분석을 통해 DNA 복사본 수에 변화를 확인 하 여 고해상도 게놈 전체 DNA 복제 타이밍 패턴을 생성할 수 있습니다. Zebrafish 모델 시스템은 개별 세포 유형, 질병 모델, 또는 돌연변이 라인에 변화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 개발, 걸쳐 vivo에서 발생 하는 복제 타이밍 변경의 평가 대 한 수 있습니다. 이러한 방법을 개발 하는 동안 메커니즘 및 복제 타이밍 설립 및 유지 보수의 결정 요인 조사 연구 하면, 역할 복제 타이밍 돌연변이 tumorigenesis, 및 perturbing의 효과 개발 및 질병에 복제 타이밍입니다.
서론
셀 분할 성공적으로, 그들은 먼저 정확 하 고 충실 하 게 복제 해야 그들의 전체 게놈입니다. 게놈 복제 재현할 패턴, DNA 복제 타이밍 프로그램1에서 발생 합니다. DNA 복제 타이밍 chromatin 조직, 후 성적인 부호 및 유전자 식2,3와 상관 된다. 복제 타이밍에 변화 개발, 걸쳐 발생 되며 크게 transcriptional 관련된 프로그램 및 변경 chromatin 마크와 조직4,5. 또한, 복제 타이밍 mutational 주파수와 상관 및 타이밍에서 변경 다양 한 유형의 암6,7,8에서 관찰 된다. 이러한 관측에도 불구 하 고 메커니즘 및 복제 타이밍 설립 및 규정의 결정 요인 여전히 크게 알려지지 않은, 하 고 개발에서 재생 역할 질병 결정 됩니다. 또한, 최근 게놈 넓은 복제까지 타이밍 척추 개발에 걸쳐 발생 하는 변화 했다만 되어 검사 셀 문화 모델에.
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프로토콜
모든 동물은 오클라호마 의료 연구 재단 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 처리 합니다.
1. 성인 zebrafish 번 식에 대 한 설정
- 단일 스트레인의 성인 남성과 여성의 zebrafish의 대형 코 호트를 사용 하 여 번 식. 심지어 단일 스트레인의 zebrafish의 유전 메이크업에 있는 작은 차이, 큰 코 호트를 사용 하 여 결과 인구의 유전 가변성의 인구의 작은 부분 집합에 제한 되지 않도록.
- 배아는 수집 전에 밤 사육 탱크에 수십 번 식 성인, 수 컷과 암컷의 약 동일한 번호를 사용 하 여. 실험에 따라 다음 번 식 전략 중 하나를 사용 합니다.
- 번 식 전략 1: 개별 사육 탱크에 몇 남성과 여성의 zebrafish, 분배기와 여성에서 남성을 분리. 이 접근을 사용 하는 경우 많은 다른 사육 탱크를 설치 하 고 생물 다양성은 인구의 대표 되도록 각 배아 수영장.
- 번 식 전략 2: 큰 사육 탱크에 남성과 여성의 zebrafish의 수십을 결합. 이 전략을 사용 하 여 배아의 충분히 큰 수 있다, 그것은 그들의 창시자 인구의 따라서 유전자 대표 다양 한에서 온 가정 하는 합리적.
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결과
게시 된 복제 타이밍 데이터를 사용 하 여 대표 복제 타이밍 프로필 및 품질 관리 측정은15을 제공 됩니다. 처리의 초기 단계는 게놈, 읽기 길이 및 게놈 검사 통계, 계산 및 낮은 품질, 짝이 없는, 필터링 및 PCR 중복 읽기를 시퀀싱 데이터 정렬 포함. 전형적인 zebrafish 연속 샘플에 대 한 읽기 통계는 그림 2에 표시 됩니다. 필터링 후 읽기 카운트 변수 크기의 창과 데이터에서 결정 됩니다 부드럽게 하 고 정상화. 생물 복제에 대 한 대표적인 zebrafish 염색체의 일반적인 부드럽게/정규화 복제 타이밍 프로필 그림 3A에 표시 됩니다. 생물학 및 실험 복제에 대 한 프로필 시각적으로 매우 유사한 ( 그림 3A참조) 하 고 또한 염색체 (
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토론
Zebrafish는 새롭고 독특한 vivo에서 모델 시스템 공부 DNA 복제 타이밍을 제공 합니다. 타임된 matings로 수행 되는 때이 실험 프로토콜에 자세히, 배아의 수천을 수집할 수 있습니다에 실험에 대 한 하루. 이러한 배아 동기적으로 정확 하 게 초과 하 고 분명히 특징이 개발의 단계를 통해 개발. 제 브라 수 있습니다 쉽고 정확 하 게 준비 zebrafish 태아 외부에서 개발 하 고 광학 투명 한 stereomicroscope를 사용 하 여 형태학에 의해. 이 프로토콜 척추 개발에 걸쳐 복제 타이밍 공부 zebrafish 태아의 사용을 자세히 설명 합니다.
문제가 발생할 수 있습니다 프로토콜의 지역 동기 개발 zebrafish 태아의 준비, FACS 정렬 및 라이브러리 준비 하는 동안 세포의 손실을 보장 포함 됩니다. Zebrafish 개발의 타이밍은 온도 의존, 따라서 사용 zebrafish 명암 주기를 적응 및 실험을 위한 28.5 ° C에서 지.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 일반 의료 과학을 통해 국립 보건원의 5P20GM103636-02 (포함 Flow Cytometry 코어 지원) 및 1R01GM121703, 부여로 오클라호마 센터에서 성인 줄기 세포에 대 한 수상 연구입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| 프로나제 | 시그마 | , 10165921001 | 프로테아제 용액 |
| , 인산염 완충 식염수(PBS), | 시그마 | D1408 | |
| 에탄올(EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 시그마 | A9647-100G | |
| 프로피듐 요오드화물(PI), | 인비트로겐 | P3566 | |
| Tris-HCl | , Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | 시그마 | E9844 | |
| SDS | 산타 크루즈 | sc-24950 | |
| 단백질 분해 효소 K | NEB | P8107S | |
| 페놀 : 클로로포름 | 시그마 | P3803-100ML | |
| 아세트산 나트륨 | J.T.Baker | 3470 | |
| 글리코겐 | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
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| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | 버전 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | 버전 3.5.5 |
참고문헌
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al.
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재인쇄 및 허가
