Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

요약

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

초록

Confocal 현미경 검사 법 특성화 및 형광 프로브로 분류 하는 전 임상 에이전트의 추가 개발에 대 한 중요 한 하위 세포 상호 작용을 캡처를 액세스할 수 있는 방법론을 제공 합니다. 기반으로 하는 항 체 세포 독성 약물에 최근 전진으로 전달 시스템, 수용 체 집계 및 국제화의 영역 내에서 이러한 에이전트에 의해 유도 된 변경 이해 중요 한 중요성 이다. 이 프로토콜 활용 하 여 형광 immunocytochemistry의 잘 설립 방법론 및 오픈 소스 피지 분포 ImageJ, inbuilt 상관와 이미지 수학 함수, 공간 이미지 상관 관계를 수행 하 분광학 (IC)입니다. 이 프로토콜은 공초점 현미경의 광선 영역의 기능으로 레이블이 지정 된 수용 체의 형광 강도 quantitates. 이 세포 표면에 대상 분자 집단의 국가의 양적 측정을 제공합니다. 이 방법론은 수용 체 집합의 일시적인 수사로 확장 하는 잠재력을 가진 정적 셀의 특성에 초점. 이 프로토콜은 클러스터링 기술 및 비 전문 이미징 장치 설립 잘 활용 하 여 세포 표면에서 발생 하는 이벤트의 정량화를 제공 하는 접근 방법론을 선물 한다.

서론

치료 항 체의 개발에는 여러 종양 종류¹의 치료에서 놀라운 성공을 보이고 있다. 마약 항 체 어원이 같은 말 (ADC)의 최근 발전으로 세포 독성 화합물에 대 한 전달 메커니즘 셀에 항 체: 수용 체 상호 작용의 역동성을 이해 하기 위한 요구 사항을 확대 하고있다²표면. 성공적인 타겟팅 세포 표면 수용 체에 항 체의, 다음이 단지 리간드: 항 체 상호 작용³에서 관찰 된 그 유사 집계 패턴을 유도할 수 있다. 수용 체 집계에서 변경 셀 표면에서 막 하는 수용 체와 그것의 제거의 결과 국제화에 변화를 유도할 수 있다. 항 체 약물 켤레의 맥락에서이 프로세스 이후에 내 면된 endosomes와 이후 효과적인 셀 죽이 결과 세포질 세포 독성 페이로드를 해제 합니다.

Confocal 현미경 검사 법은 항 체와 그들의 대상 수용 체⁴의 이러한 중요 한 상호 작용을 시각화 하는 효과적인 수단을 제공 했다. 집계 대상 분자 세포 표면에서의 변화를 탐험이 프로토콜 활용 공간 이미지 상호 관계 분광학 (IC) 기술 ^{5,6,7 통해 confocal 현미경 이미지의 후 처리} .

이미지 상관 분광학의 기초 공간 형광 강도 변동 관계 레이블이 구조체의 밀도 및 집계 상태를 공유 하는 관찰 이다. 이 관계는 캡처된 이미지⁵의 공간 자기 상관 함수의 계산에 따라 설정 됩니다.

이미지 상관 분광학의 모든 이체는 이미지 상관의 계산이 필요합니다. 이것은이 기능을 양적 집계 상태 매개 변수는 이미지 내에 포함 된의 추출에 대 한 2 차원 가우스 곡선 피팅 옵니다. 간단히에서 이미지 상관의 계산 포함 됩니다 모두 이미지에 포함 된 및 가능성을 계산 가능한 픽셀 쌍을 비교 하는 둘 다 동등 하 게 서로 밝은. 이 거리의 기능과 픽셀 분리⁸방향으로 시각 이다.

이미지 상호 관계 분광학에 대 한 이론적 프레임 워크 그리고 피터슨과 Wiseman 외정의 설립 되었다. ^{5 , 6}.이 프로토콜 상관 계산 피지/ImageJ 스프레드시트 응용 프로그램에서 수행 됩니다, 강도 변동 공간 자기 상관 함수에 대 한 기준 (Eq 1)로 기술 될 수 있다:

     

여기서 F 나타냅니다 푸리에 변환을; F^{− 1} 역 푸리에 변환; F * 복소수; 공간 지연 변수 ε 그리고 η. 공간 IC에서이 프로토콜에서 설명 된 대로 자기 상관 함수 계산할 수는 2D 빠른 푸리에 변환 알고리즘^7,9를 사용 하 여. 0-지연, g₁₁(0, 0)로 그렇지 않으면 알려진 제로 공간 별거에 상관 입자 빔 현미경의 영역 당 현재 역 평균 수를 제공 합니다. 그것은 2 차원 가우스 함수 (Eq 2)공간 자기 상관 함수를 피팅 하 여 얻을 수 있습니다.

     

와 픽셀 이미지 내에서 캡처 영역 설정된에 포함 된 이러한 측정 무한대로 확장 되지 않습니다, 용어 g∞ 이미지 내에 포함 된 장거리 공간적 상관을 오프셋으로 사용 됩니다. 분자 크기의 집계, ω 현미경의 포인트 확산 함수 이며 반-최대 공간 자기 상관 함수에의 전체 폭에 의해 설명. 악기의 확산 기능에 포함 된 지역 하위 해상도 형광 구슬을 사용 하 여 측정 될 수 있다.

여기에 설명 된 이미지 상호 관계 분광학 프로토콜, 상관 및 ICS를 완료 하는 데 필요한 수학 함수는 사용 하 여 수행 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지¹⁰는 ImageJ의 분포 프로그램^11,12. 피지/ImageJ FFT 수학 함수에 사전 설치 된 빠른 푸리에 변환을 사용합니다. 이 기능은 각 차원¹³에서 2의 요인에 의해 데이터의 범위를 줄임으로써이 계산의 계산 시간을 줄일 수 있습니다. 2D 자기 상관 함수는 x, y 축에서에서 대략 대칭 상관 이미지를 통해 한 줄 프로필 플롯 원시 자기 상관 공간 지연의 기능으로 측정을 사용할 수 있습니다. 모든 0 지연 잡음 추가 계산을 하기 전에, 결과 상관 진폭 (피크 값, g(0)_T)와 식 (Eq 3)와 함께 배경에 대 한 수정 제거 됩니다.

     

어디 내가_b 셀을 제외 하는 배경 영역에서 평균 강도 이다. 클러스터 밀도, 또는 형광 개체의 밀도 (Eq 4)에 의해 정의 됩니다.

    

여기에 설명 된 프로토콜 우리 가정 접근 공간 지연 증가 함께 1.0 값을 정규화 된 자기 상관 함수 것입니다 붕괴는 관찰을 바탕으로 단순히 클러스터 밀도 (CD)의 계산을 더. 최대 공간 피로 더 이상 어떤 상관 관계가 형광의 강도 값 하 고 따라서 상관 없이이 지역에서 계산 컴퓨팅 나눈 이후에이 강도 곱한 강도 값은 그 강도, 정의 1.0의 광장. 따라서, 클러스터 정규화 된 자기 상관 함수에서 밀도 상호 (Eq 5)을복용 하기 전에 정규화 된 자기 상관 함수에서 1.0을 빼서 계산 될 수 있다:

     

악기의 포인트 확산 함수의 영역 내에 포함 된 클러스터 수를 quantitate 하 빔 영역의 추가 보정을 수행할 수 있습니다. 이 교정은 이미지 상호 관계 분광학 분석 중에 사용 하는 동일한 광학 조건을 사용 하 여 수행 되어야 합니다.

프로토콜

1. 부착 셀 라인의 이미징 실험에 대 한 시드

1. 10%를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 미디어의 300 µ L에서 잘 하룻밤 (O/N) 당 10000 A431 해 암 세포를 씨앗 소 태아 혈 청, 1% 페니실린-스와 1%는 8에서 GlutaMAX 이미징 연 발 슬라이드 고해상도 기름 침수 렌즈에 적합 (예를 들어, NuncTM 실험실-TekTM coverglass 연 발).
2. 미디어 실 온 (RT)에서 10 분에 100 ng/mL EGF ligand의 추가 A431 세포에 수용 체 집계를 자극.

2. 1 차적인 항 체 외피

1. 미디어를 제거 하 고 실내 온도 (RT) 버퍼링 하는 인산 염 (1 x PBS)의 300 µ L 셀을 두 번 씻어.
2. 실시간에서 10 분에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 200 µ L로 셀 수정
   참고: 대상 집단의 시간적 변화를 탐험,이 고정 단계 생략 해야 합니다.
3. PFA를 제거 하 고 실내 온도 PBS의 300 µ L에 포함 된 셀을 두 번 씻어.
4. 셀 4 ° c.에 적어도 2 시간에 10 µ g/mL의 농도에서 1 차적인 항 체를 포함 하는 PBS의 200 µ L 품 어
   참고: ICS 계산 유효에 대 한 모든 수용 체 세포 표면에 존재 1 차 항 체로 표시 되어야 합니다. 각 기본 항 체의 희석 시리즈와 예비 실험 필요 (1:10, 1시 50분, 1: 100, 1: 200, 1: 1:1, 500, 000 등) 수행. 최적의 기본 항 체 농도의 형광 강도 클러스터 밀도 비교 분석을 통해 결정 됩니다. 선택한 기본 농도 클러스터 밀도 일반적인 항 체 바인딩 결과로 클러스터 밀도 증가 이전 1 차 항 체 농도 증가 함께 정점 때 발생 합니다. 1 차적인 항 체 시간 코스 이미징 실험을 수행 하는 경우 혈 청 자유로운 미디어에 희석 수 있습니다.
5. 원하는 보육 시간 완료, 다음 RT PBS의 300 µ L에 포함 된 셀을 두 번 씻어.
6. 와 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 4 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 샘플을 차단
   참고: 고정된 샘플 차단 정기적으로 4 ° c.에 하룻밤 (O/N)

3. 이차 항 체 외피

1. 이차 항 체 (예: 알 렉 사 Fluor 488 IgG) PBS에 놓여있는지 표시의 10 µ g/mL 재고를 준비 합니다. 2 µ g/mL Hoechst 33342의 현미경에 향상 된 샘플 검색에 대 한 허용이 희석에 포함 될 수 있습니다.
   참고: 시간 경과 실험, PBS는 혈 청 자유로운 미디어에 대 한 교환할 수 있습니다.
2. 제거 5 %BSA / 셀에서 PBS 및 주변광에서 샘플을 보호 하면서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 2 차 항 체 솔루션으로 품 어.
3. 완료 되 면 이차 항 체 외피 시간, PBS (2 회)의 300 µ L로 세포 세척 하 고 주위 빛에서 보호 4 ° C에서 저장 합니다.
4. 증발을 방지 하기 위해, parafilm으로 챔버 슬라이드의 가장자리를 래핑하십시오.

4. 샘플의 confocal 현미경 검사 법

참고: confocal 분석에 사용 된 설정 장비 및 fluorophores 개별 실험에 사용 된 따라 달라 집니다. 현대 confocal 악기 악기의 기본 이미지 파일 형식에서 실험에 사용 된 모든 이미지 매개 변수를 저장 하기 위한 메커니즘을 제공 합니다. 그것은 중요 이러한 설정은 데이터 수집의 다른 기간에 걸쳐 실험 조건의 적절 한 복제에 대 한 제공에 기록 됩니다.

1. 형광 신호의 이미징, 동안-채도를 하지 마십시오. 픽셀 채도의 거짓 색상 표현을 제공 하는 테이블을 이미지 보기를 사용 하 고 검출기 이득 감소 따라 레이저 출력. 가장 confocal 악기가 수집 소프트웨어에 "범위 표시기" 설정 또는 유사한 옵션을 포함합니다.
2. 레이저 출력에 대 한 관심의 fluorophore의 노출을 최소화 합니다. Hoechst 33342 같은 DNA 라벨 얼룩의 사용 감지 하 고 수집 하기 전에 시야에서 샘플 위치는 쉬운 메커니즘을 제공 합니다.
3. 낮은 해상도에서 샘플의 초기 검사를 수행 하 고 경우 소프트웨어 빠른 스캔 속도. 이 샘플의 가능한 photobleaching를 제한 합니다.
4. 캡처 해상도 증가 하 고 느린 검색 속도 때 이미지 데이터를 수집할 준비가.
5. 경우 허용 하는 confocal 악기, 광자 계산 모드를 사용 하 여 데이터를 수집 합니다.
   참고: 광자 계산 사용할 수 없는 경우는 악기에: 회색은 선형 이미지 수집 동안 보장.
6. 1 공기 단위 (AU)를 사용 하는 각 레이저 라인에 대 한 작은 구멍을 설정 합니다.
7. 사용 선 또는 프레임을 검출기를 줄이기 위해 이미지 수집 (x4) 동안 평균 소음 관련.
   참고: ICS의이 변종에만 한 시간-포인트 캡처한 획득 시간 아니다 실험적인 요소를 제한.
8. 이미지 컬렉션 선택 높은 배율, 최대 해상도 (예로 계획-Apochromat 100 X 63 X /1.40 구형과 반음계 aberrations에 대 한 보정을 제공 하기 위해 계획 Apochromat 목표 등 높은 수 가늠 구멍 목표에 대 한 오일 목표).
9. 이미지 내에 포함 된 캡처된 픽셀의 크기 oversample 각 픽셀 50 x 50 nm 영역을 포착 하는 것이 좋습니다. 효과적인 ICS에 대 한 픽셀 크기 픽셀 당 0.1 µ m² x 0.1 미만 이어야 합니다. 이 스캔 비교적 작은 영역을 확대 하 고 상대적으로 큰 이미지 형식 (예: 1024 x 1024 또는 2048 x 2048 픽셀)을 선택의 조합에 의해 이루어집니다.
10. 지역 수 평면에 셀의 꼭대기 또는 기저 표면에 초점. 하나의 이미지와 IC 분석 하는 동안 개별적으로 처리 하는 관심 영역에 여러 개의 셀을 수집할 수 있습니다.
11. 샘플 정규화에 사용할 동일한 계측기 설정을 사용 하 여 셀 무료 배경 영역을 캡처하십시오.

5입니다. 이미지 상관 분광학의 계산

참고: 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지, ImageJ 프로그램의 배포 상관 및 IC에 필수적인 수학 함수를 수행 해야 합니다. ImageJ의이 배급으로 수많은 사전 설치 된 플러그 인 및 여러 이미징 실험에 걸쳐 작업을 수행할 수 있는 쉽게 업데이트 아키텍처를 포함 것이 좋습니다.

1. 피지 프로그램 (http://fiji.sc/Downloads)를 설치 합니다.
2. 인수 데이터 집합을 로드 합니다.
3. 관심과 복제 2ⁿ (256 x 256, 128 × 128, 64 × 64)의 픽셀 크기를의 꼭대기 또는 기저 세포 표면 막 영역을 식별 합니다. "메뉴: 이미지 > 중복..."
4. 관심의 자른 영역의 평균 강도 계산 "메뉴: 분석 > 측정."
5. 배경 영역을 식별 하 고 캡처 세포 표면 막의 같은 픽셀 크기를 중복 (2ⁿ: 256 x 256, 128 × 128, 64 × 64). "메뉴: 이미지 > 중복..."
6. 관심의 영역을 자른 배경의 평균 농도 계산 합니다. "메뉴: 분석 > 측정."
7. 관심 영역을 포함 하는 이미지에서 백그라운드의 평균 강도를 뺍니다. "과정 > 계산기 이미지 > 빼기."
8. 상관 계산을 수행 합니다. 이 계산 메뉴 구조 내에 포함 된: "과정 > FTT > FD 수학."
   1. FD 수학 대화 상자 선택: 이미지 1: 자른 이미지 이름, 상관 관계, 이미지 2 작업: 자른 이미지 이름, 역 변환에.
9. 픽셀의 총 수로 나누어 결과 이미지를 정상화. "메뉴: 프로세스 > 수학 > 분할..." (예: 64 x 64 픽셀 = 4096)
10. 정상화 다시는 정규화의 평균 휘도로 나누어 자른 영역 제곱. "메뉴: 프로세스 > 수학 > 분할..."
    참고:이 두 번 평균 강도 값으로 이미지를 분할 하 여 얻을 수 있습니다.
11. 포인트 확산 기능을 통해 선을 그립니다.
12. 피크 값을 계산 하려면이 줄의 프로필을 플롯 합니다. "메뉴: 분석 > 프로필 그림."
13. 스프레드시트에 피크 값 (5.12의 결과)를 전송 하 여 빔 지역 당 클러스터를 계산 하 고 다음 계산 (Eq 6)를 수행:
    

6. 일괄 처리 IC 데이터 집합의

참고: 피지/ImageJ 매크로의 설립 위의 프로토콜에 설명 하는 절차를 복제 하는 것이 좋습니다. 여러 이미지 파일의 일관 되 고 신속한 분석을 위한 이미지 상호 관계 분광학 분석 하는 동안 수 있습니다.

1. ICS 프로토콜에서 각 메뉴 명령을 기록 하 여 매크로 IC 워크플로 설정
   "메뉴: 플러그인 > 매크로 > 기록...".
2. "만들기" 매크로 생성을 선택 합니다.
3. 선택 "언어 > IJ1 매크로."
4. 매크로 저장 합니다.
5. 각 함수의 운영자에 게 알림을 제공 하는 매크로의 다양 한 단계를 대화 상자를 추가 합니다. 대화 상자는 또한 적절 한 선택 이전에 추가 처리 (즉, 영역 자르기) 만들 수 있도록 분석 프로세스를 일시 중지 하는 방법으로 봉사
   1. 대화 상자에 매크로 코드
      제목 = "대화 상자 제목";
      msg = "대화 상자/프로토콜 단계 메시지";
      waitForUser (제목, msg);
      참고: 추가 효율성 피지 업데이트 (지침 https://imagej.net/BAR) 내에서 바 업데이트 사이트에 가입 하 여 설정할 수 있습니다. 이 "광범위 하 게 적용 가능한 루틴의 컬렉션" ¹⁴피지를 제공 한다. 이러한 루틴을 하나 찾기 봉우리 이다. 메뉴 구조: "바 > 데이터 분석 > 찾기 봉우리." 이 스크립트는 빠른 포인트의 프로필에 피크 값 확산 함수 계산의 의미를 제공 합니다.

7. 현미경의 광선 영역 프로토콜 확장: 계산

참고: 현미경의 광학 전달 함수 개체도 분자 크기의 약의 반경 가진 이미지로 나타납니다 보장 x y 평면에서 200-300 nm. ICS 프로토콜 하위 해상도 형광 구슬에 4-5 단계를 수행 하 여 포인트 확산 함수의 결정을 수 있습니다. 특히:

1. 하위 해상도 탑재 (예: < 100 nm 직경) 8에 형광 구슬 챔버 이미징 슬라이드.
2. ICS 실험에 대 한 활용 하는 confocal 현미경을 사용 하 여 설명된 프로토콜에 따라 이미지 구슬.
3. 프로토콜 단계 5.1-5.13에 따라 결과 이미지에서 ICS 함수를 계산 합니다.
4. 그려진된 프로필에서 ICS 기능의 절반 최대 값에서 전체 폭으로 빔 반지름 (r)을 계산 합니다.
5. 계산 하는 빔 영역 (BA) (Eq 7):

8. 프로토콜 확장: 단위 면적 당 클러스터의 계산

1. (Eq 8)로 지역의 단위 당 클러스터 밀도 (CD)를 계산:
   
   
2. 빔 (7.5의 결과)의 영역으로 빔 지역 (5.13의 결과) 당 클러스터를 나눕니다.

결과

성공적인 이미지 상호 관계 분광학 실험 치료 컨트롤의 적절 한 응용 프로그램에 따라 달라 집니다. 이러한 치료 그룹 없이 1 차적인 항 체 및 이차 항 체 치료 그룹이 없는 형광의 검사를 포함합니다. 실험에 대 한 최적의 confocal 레이저 설정 설정 되 면 이미지 샘플 내에서 일반적인 형광의 부족을 확인 하이 컨트롤 그룹의 캡처할 수 해야 합니다. 많은 부착 암 세포 라인에 대 한 ICS에 대 한 적합 한 영역의 식별 평면의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 단일 confocal 이미지에 여러 개의 암 세포의 큰 시야를 잡으려고 기능에 의해 보상 된다. 이 치료 그룹 간의 통계적 비교를 수행 하기 위해 필요한 샘플링을 생성 하는 기능을 제공 합니다.

이 대표적인 실험 A431 EGFR 긍정적인 해 암 세포, EGFR 클러스터링을 유도 하기 위해 실 온에서 10 ...

토론

우리가이 프로토콜에서 설명 하는 이미지 상호 관계 분광학 (IC)의 기술 특수 감지기에 대 한 필요 없이 표준 confocal 현미경을 사용 합니다. ICS 기술 설명 잘 설립 immunocytochemistry 메서드 증가 통계 분석에 대 한 여러 치료 조건의 빠른 샘플링을 사용 합니다. 이 방법론 confocal 볼륨, 형광 등을 통해 확산 모바일 분자의 형광 동요의 상관 관계에 따라 대체 단일 분자 기법에 비해 절대 정밀도에 약간의 감소와 함께 저러 상호 관계 분광학 (FCS)¹⁵. 보다 전문적인된 FCS 접근에는 눈사태 포토 다이오드 (APD) 같은 감지기 또는 표준 confocal 악기에 일상적으로 사용할 수 있는 전용된 전문된 소프트웨어와 함께 GaAsP 경보기를 계산 하는 높은 감도 광자를 필요 합니다. IC의 정밀도 대 한 포괄적인 분석 결정이 기술을 정확 하 게 클러스터의 수를 측정할 수 있는 > 1 입자 빔 초점 레이저 스캔 현미경⁷

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nunc Lab-Tek II 챔버 커버 글라스 - 8	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	ThermoFisher Scientific	14190144
소 태아 혈청	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드 없음	ThermoFisher Scientific	12604021
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX 보충제	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck 형광 마이크로스피어 표준 0.1µ m	ThermoFisher Scientific	T7279
세툭시맙	머크 세로노	3023715501
파라필름 M 38mx100mm	머크 밀리포	BRND701605
16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액	ProSciTech	C004
재조합 인간 EGF	R& D 시스템	236-EG