Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

요약

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

초록

Confocal 현미경 검사 법 특성화 및 형광 프로브로 분류 하는 전 임상 에이전트의 추가 개발에 대 한 중요 한 하위 세포 상호 작용을 캡처를 액세스할 수 있는 방법론을 제공 합니다. 기반으로 하는 항 체 세포 독성 약물에 최근 전진으로 전달 시스템, 수용 체 집계 및 국제화의 영역 내에서 이러한 에이전트에 의해 유도 된 변경 이해 중요 한 중요성 이다. 이 프로토콜 활용 하 여 형광 immunocytochemistry의 잘 설립 방법론 및 오픈 소스 피지 분포 ImageJ, inbuilt 상관와 이미지 수학 함수, 공간 이미지 상관 관계를 수행 하 분광학 (IC)입니다. 이 프로토콜은 공초점 현미경의 광선 영역의 기능으로 레이블이 지정 된 수용 체의 형광 강도 quantitates. 이 세포 표면에 대상 분자 집단의 국가의 양적 측정을 제공합니다. 이 방법론은 수용 체 집합의 일시적인 수사로 확장 하는 잠재력을 가진 정적 셀의 특성에 초점. 이 프로토콜은 클러스터링 기술 및 비 전문 이미징 장치 설립 잘 활용 하 여 세포 표면에서 발생 하는 이벤트의 정량화를 제공 하는 접근 방법론을 선물 한다.

서론

치료 항 체의 개발에는 여러 종양 종류¹의 치료에서 놀라운 성공을 보이고 있다. 마약 항 체 어원이 같은 말 (ADC)의 최근 발전으로 세포 독성 화합물에 대 한 전달 메커니즘 셀에 항 체: 수용 체 상호 작용의 역동성을 이해 하기 위한 요구 사항을 확대 하고있다²표면. 성공적인 타겟팅 세포 표면 수용 체에 항 체의, 다음이 단지 리간드: 항 체 상호 작용³에서 관찰 된 그 유사 집계 패턴을 유도할 수 있다. 수용 체 집계에서 변경 셀 표면에서 막 하는 수용 체와 그것의 제거의 결과 국제화에 변화를 유도할 수 있다. 항 체 약물 켤레의 맥락에서이 프로세스 이후에 내 면된 endosomes와 이후 효과적인 셀 죽이 결과 세포질 세포 독성 페이로드를 해제 합니다.

Confocal 현미경 검사 법은 항 체와 그들의 대상 수용 체⁴의 이러한 중요 한 상호 작용을 시각화 하는 효과적인 수단을 제공 했다. 집계 대상 분자 세포 표면에서의 변화를 탐험이 프로토콜 활용 공간 이미지 상호 관계 분광학 (IC) 기술 ^5,

프로토콜

1. 부착 셀 라인의 이미징 실험에 대 한 시드

1. 10%를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 미디어의 300 µ L에서 잘 하룻밤 (O/N) 당 10000 A431 해 암 세포를 씨앗 소 태아 혈 청, 1% 페니실린-스와 1%는 8에서 GlutaMAX 이미징 연 발 슬라이드 고해상도 기름 침수 렌즈에 적합 (예를 들어, NuncTM 실험실-TekTM coverglass 연 발).
2. 미디어 실 온 (RT)에서 10 분에 100 ng/mL EGF ligand의 추가 A431 세포에 수용 체 집계를 자극.

2. 1 차적인 항 체 외피

1. 미디어를 제거 하 고 실내 온도 (RT) 버퍼링 하는 인산 염 (1 x PBS)의 300 µ L 셀을 두 번 씻어.
2. 실시간에서 10 분에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 200 µ L로 셀 수정
   참고: 대상 집단의 시간적 변화를 탐험,이 고정 단계 생략 해야 합니다.
3. PFA를 제거 하 고 실내 온도 PBS의 300 µ L에 포함 된 셀을 두 번 씻어.
4. 셀 4 ° c.에 적어도 2 시간에 10 µ g/mL의 농도에....

결과

성공적인 이미지 상호 관계 분광학 실험 치료 컨트롤의 적절 한 응용 프로그램에 따라 달라 집니다. 이러한 치료 그룹 없이 1 차적인 항 체 및 이차 항 체 치료 그룹이 없는 형광의 검사를 포함합니다. 실험에 대 한 최적의 confocal 레이저 설정 설정 되 면 이미지 샘플 내에서 일반적인 형광의 부족을 확인 하이 컨트롤 그룹의 캡처할 수 해야 합니다. 많은 부착 암 세포 라인에 대 한 ICS에 대 한 적합 한 영역의 식별 평면의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 단일 confocal 이미지에 여러 개의 암 세포의 큰 시야를 잡으려고 기능에 의해 보상 된다. 이 치료 그룹 간의 통계적 비교를 수행 하기 위해 필요한 샘플링을 생성 하는 기능을 제공 합니다.

이 대표적인 실험 A431 EGFR 긍정적인 해 암 세포, EGFR 클러스터링을 유도 하기 위해 실 온에서 10 .......

토론

우리가이 프로토콜에서 설명 하는 이미지 상호 관계 분광학 (IC)의 기술 특수 감지기에 대 한 필요 없이 표준 confocal 현미경을 사용 합니다. ICS 기술 설명 잘 설립 immunocytochemistry 메서드 증가 통계 분석에 대 한 여러 치료 조건의 빠른 샘플링을 사용 합니다. 이 방법론 confocal 볼륨, 형광 등을 통해 확산 모바일 분자의 형광 동요의 상관 관계에 따라 대체 단일 분자 기법에 비해 절대 정밀도에 약간의 감소와 함께 저러 상호 관계 분광학 (FCS)¹⁵. 보다 전문적인된 FCS 접근에는 눈사태 포토 다이오드 (APD) 같은 감지기 또는 표준 confocal 악기에 일상적으로 사용할 수 있는 전용된 전문된 소프트웨어와 함께 GaAsP 경보기를 계산 하는 높은 감도 광자를 필요 합니다. IC의 정밀도 대 한 포괄적인 분석 결정이 기술을 정확 하 게 클러스터의 수를 측정할 수 있는 > 1 입자 빔 초점 레이저 스캔 현미경⁷

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nunc Lab-Tek II 챔버 커버 글라스 - 8	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	ThermoFisher Scientific	14190144
소 태아 혈청	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드 없음	ThermoFisher Scientific	12604021
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX 보충제	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck 형광 마이크로스피어 표준 0.1µ m	ThermoFisher Scientific	T7279
세툭시맙	머크 세로노	3023715501
파라필름 M 38mx100mm	머크 밀리포	BRND701605
16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액	ProSciTech	C004
재조합 인간 EGF	R& D 시스템	236-EG

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