세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Summary

우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

단백질 단백질 상호 작용을 탐구 하는 능력은 셀에 규제 연결을 이해 하는 열쇠. 그러나, 많은 경우에 단백질-단백질 상호 작용의 중요 한 실험 과제와 연결 됩니다. 특히, 정렬 수용 체 그들의 단백질 화물이이 단백질의 공동-immunoprecipitation을 사용할 수 없게 만드는 세제에 민감한 패션에서 자주 막 구획의 루멘에서 상호 작용 합니다. 포도 당 운송업 자 GLUT4 약한 luminal 상호 막 단백질의 한 예로 봉사 수로 정렬 수용 체 sortilin의 바인딩. 여기, 우리는 sortilin 및 GLUT4 사이의 상호 작용을 확인 하기 위해, 간단한, 빠르고 저렴 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 설계 및 GLUT4 luminal 부분에 잠재적인 sortilin 바인딩 epitope를 해당 myc 태그 펩타이드를 화학적으로 합성. Sortilin 6 히스티딘 태그로 포유류 세포에 표현 되었고 세포 lysates 코발트 비즈를 사용 하 여에서 격리. Sortilin 구슬에 움직일 수 다른 pH 값, 펩 티 드 솔루션으로 알을 품는 그리고 서쪽 blotting에 의해 eluted 자료 분석. 이 분석 결과 다른 세제에 민감한 단백질-단백질 상호 작용 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

GLUT4 지방과 골격 근육 세포 그것 후 높은가격순 혈액 포도 당 정리¹에 인슐린의 효과 중재 하는 곳에 주로 표현 되는 포도 당 운송업 자 단백질 이다. 매우 안정적인 단백질 이기 때문에, GLUT4 닢 수준에 통제 된다. 인슐린의 부재에 GLUT4 크게 원형질 막 (포도 당에 대 한 따라서 낮은 기저 침투성)에서 제외 되 고 주로 셀 내부를 작은 인슐린 응답 소포 (IRVs)에서 지역화 및 trans Golgi 네트워크 (TGN) 나타낼 수 있는 어브 기증자 구획입니다. 인슐린 관리 시는 IRVs 원형질 막으로 융합 하 고 그 작동의 사이트에 GLUT4를 제공 합니다. 그래서 adipocytes 및 골격 myocytes 혈액에서 포도 당 통풍 관 그 상승 10 ~ 40이 혈당, 원형질 막의 침투성을 증가 합니다. 인슐린 철수 후 GLUT4 초기/정렬 endosomes에 내 고 검색 TGN는 IRVs는 다시 형성 하. 두 정렬 단계 GLUT4 통로, 즉 주변 초기 endosomes에서 perinuclear TGN을 검색에는 IRVs의 대형 막 Vps10p 가족, 형식을 나타내는 sortilin에 의해 활성화 되어 TGN 기증자에 나 막 횡단 단백질 그리고 정렬 수용 체입니다. Sortilin 비 계 막 횡단 단백질으로 작동 하는 ....

Protocol

1. 펩 티 드의 처리

1. 디자인 및 펩 티 드 순서
   1. 펩 티 드, 원하는 시퀀스 선택한 myc 피토 프 (EQKLISEED)에서 그 중 N-또는 C-말단 같은 태그를 추가 합니다.
   2. 펩 티 드 가용성 계산기 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php를 사용 하 여 물에 펩 티 드의 예측된 가용성을 확인 합니다. 용 해도 낮은 경우 충전 균형을 변경 하려면 다른 수용 성 태그를 추가 하십시오.
      참고: 우리는 N 종점 (Myc-fll-GLUT4)에 펩 티 드에 해당 하는 첫 번째 luminal 루프 (fll) GLUT4 myc epitope (굵은 글꼴)와 태그의 사용: EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA 물에 있는 "좋은" 예측된 가용성을 .
   3. 75% 이상으로 주문 펩 티 드 순서 순도 분석 결과 대 한 충분 한 이며 가용성 테스트에 대 한 공급자를 요청. 펩 티 드를 녹이는 뜻하지 않은 문제가 있을 때 두 개 이상의 aliquots에 순서를 구분 합니다.
      참고: Myc fll GLUT4 두 aliquots에 명령 했다. 초순에 보고 된 그것의 가용성은 ≤ 10 mg/mL 이다.
   ....

Results

Lysates L1 셀 Sortilin-myc를 / 그의⁵ 와 WT 3T3 L1 셀, 부정적인 컨트롤 사용에서 안정적으로 페 3T3에서 준비 되었다. 두 lysates pH 6 또는 pH 8에 코발트 구슬과 incubated 되었고 철저 하 게 씻어. 고정 단백질 구슬 Myc fll Glut4 솔루션에서 incubated 다음 했다. 주의 세척 후 단백질 구슬에 바인딩된 했다 eluted 0.25 M 이미와 함께. SDS-페이지 10-20% Tricine sortilin-myc를 / 그의 둘 다의 검출에 대 한 허용 반대로 Myc 항 체로 서 부 럽 그라데이션 젤 뒤에 원래 lysates 함께 샘플 복종 되었다 (110 kD) 및 Myc fll GLUT4 (5 kD) (그림 1) .

Discussion

Sortilin는 진화 보존된 멀티 ligand 단백질 수용 체 세포내 정렬 이벤트^6,7와 원형질 막에 두 신호에 관련 된 이다. 그러나, 정통 sortilin의 ligands (일부는 luminal 또는 완전 한 막 단백질)에 대 한 검색은 복잡 하다 바인딩 파트너의 일부와 함께 sortilin의 상호 작용 세제에 민감한 것 같다. 따라서, 쉽게 그리고 단백질 단백질 상호 작용, 공부에 대 한 광범위 한 접근 공동-immunoprecipitation, 쉽게 적용 될 수 없습니다. 일부 연구 그룹 sortilin와 그것의 잠재적인 ligands^8,9사이의 상호 작용을 보여 공동-immunoprecipitation 사용 해 왔다. 그러나, 이러한 실험 0.1%에 밖으로 진행 되었습니다 트리톤 또는 가용 화 막의 완전성에 의.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma	P8849	는 히스티딘 태그 단백질
인산염 완충 식염수 정제에 사용됩니다	Corning	21-040-CV	PBS
1mL 인슐린 주사기 U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA 단백질 분석 키트	Pierce	23228
세척 버퍼	Boston BioProducts	BP-234	His-tag 단백질 정제용
HisPur 코발트 수지	Thermo Scientific	89964
Tricine 샘플 버퍼	Bio-Rad	161-0739	SDS와 함께, bMercaptaethanol은
용리를 첨가해야 합니다.	250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine 프리캐스트 젤 10-20%	Bio-Rad	456-3115	펩타이드와 작은 단백질
Tris/Tricine/SDS 러닝 버퍼의 분리를 위해	Bio-Rad	161-0744
전송 버퍼	Boston BioProducts	BP-190	20% 메탄올
니트로셀룰로오스 멤브레인 추가  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
소 혈청 알부민	시그마	A9647	BSA
안티 Myc 항체	세포 신호	2272	토끼
펩타이드	Genscipt
주문 맞춤화 Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374