세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Summary

우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

단백질 단백질 상호 작용을 탐구 하는 능력은 셀에 규제 연결을 이해 하는 열쇠. 그러나, 많은 경우에 단백질-단백질 상호 작용의 중요 한 실험 과제와 연결 됩니다. 특히, 정렬 수용 체 그들의 단백질 화물이이 단백질의 공동-immunoprecipitation을 사용할 수 없게 만드는 세제에 민감한 패션에서 자주 막 구획의 루멘에서 상호 작용 합니다. 포도 당 운송업 자 GLUT4 약한 luminal 상호 막 단백질의 한 예로 봉사 수로 정렬 수용 체 sortilin의 바인딩. 여기, 우리는 sortilin 및 GLUT4 사이의 상호 작용을 확인 하기 위해, 간단한, 빠르고 저렴 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 설계 및 GLUT4 luminal 부분에 잠재적인 sortilin 바인딩 epitope를 해당 myc 태그 펩타이드를 화학적으로 합성. Sortilin 6 히스티딘 태그로 포유류 세포에 표현 되었고 세포 lysates 코발트 비즈를 사용 하 여에서 격리. Sortilin 구슬에 움직일 수 다른 pH 값, 펩 티 드 솔루션으로 알을 품는 그리고 서쪽 blotting에 의해 eluted 자료 분석. 이 분석 결과 다른 세제에 민감한 단백질-단백질 상호 작용 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

GLUT4 지방과 골격 근육 세포 그것 후 높은가격순 혈액 포도 당 정리¹에 인슐린의 효과 중재 하는 곳에 주로 표현 되는 포도 당 운송업 자 단백질 이다. 매우 안정적인 단백질 이기 때문에, GLUT4 닢 수준에 통제 된다. 인슐린의 부재에 GLUT4 크게 원형질 막 (포도 당에 대 한 따라서 낮은 기저 침투성)에서 제외 되 고 주로 셀 내부를 작은 인슐린 응답 소포 (IRVs)에서 지역화 및 trans Golgi 네트워크 (TGN) 나타낼 수 있는 어브 기증자 구획입니다. 인슐린 관리 시는 IRVs 원형질 막으로 융합 하 고 그 작동의 사이트에 GLUT4를 제공 합니다. 그래서 adipocytes 및 골격 myocytes 혈액에서 포도 당 통풍 관 그 상승 10 ~ 40이 혈당, 원형질 막의 침투성을 증가 합니다. 인슐린 철수 후 GLUT4 초기/정렬 endosomes에 내 고 검색 TGN는 IRVs는 다시 형성 하. 두 정렬 단계 GLUT4 통로, 즉 주변 초기 endosomes에서 perinuclear TGN을 검색에는 IRVs의 대형 막 Vps10p 가족, 형식을 나타내는 sortilin에 의해 활성화 되어 TGN 기증자에 나 막 횡단 단백질 그리고 정렬 수용 체입니다. Sortilin 비 계 막 횡단 단백질으로 작동 하는 하나의 모델에 따르면: 그것은 GLUT4 endosomes의 TGN, 루멘에 바인딩하고 신병은 기증자 막 통해 의 세포질 측에 retromer 또는 clathrin 어댑터의 C-터미널^{2, 3}. 세포내 구획 사이 GLUT4 이동 기공을 사업자에 GLUT4의 배포를 용이 하 게이.

Retromer와 다양 한 접합 기 단백질 sortilin의 세포질 꼬리의 상호 작용을 잘 문서화 되었습니다. 그러나, sortilin GLUT4 (와 몇몇의 다른 단백질 ligands)의 바인딩 증명 하기 위해 도전 하고있다. 특히, 공동 immunoprecipitate sortilin 및 GLUT4 하려고가 두 단백질 사이 상호 작용의 세제에 민감한 특성상 아마 성공 되지 않았습니다. 또한 일반 운송업 자 단백질 GLUT4 12 막 횡단 도메인 및 6 luminal 루프는 조합 잠재적으로 sortilin 바인딩 사이트를 나타낼 수 있다. 동시에 효 모 2 잡종 시스템에 막 침투성 DSP와 상호 작용 cross-linking 셀에 실질적인 공동 지역화 등 간접 증거의 큰 몸 그 sortilin GLUT4 바인딩할 수 있는 것이 좋습니다. 또한, mutagenesis 스캔 알라닌과 조합에서 후자의 방식을 사용 하 여 우리는 이전 결정 sortilin의 Vps10p 도메인 주로 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 바인딩합니다. 그러나, 포유류 세포에 이러한 상호 작용의 증거는 실종 되었습니다. 여기, 우리 산 성 환경에서 유사한 transfected 3T3-L1 셀 코발트 수 지를 사용 하 여 pH 6 및 pH 8에 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 해당 하는 화학적으로 합성된 펩 티 드와 상호 작용할 수 있는 증명에서 그의 태그 sortilin 격리는 endosomal 루멘 그리고 TGN 막의 루멘에서 중립 환경. 아니 펩 티 드 바인딩 비 transfected 세포에서 준비 된 추출 물 같은 구슬에 로드 된 컨트롤 실험에서 발견 되었다.

Protocol

1. 펩 티 드의 처리

1. 디자인 및 펩 티 드 순서
   1. 펩 티 드, 원하는 시퀀스 선택한 myc 피토 프 (EQKLISEED)에서 그 중 N-또는 C-말단 같은 태그를 추가 합니다.
   2. 펩 티 드 가용성 계산기 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php를 사용 하 여 물에 펩 티 드의 예측된 가용성을 확인 합니다. 용 해도 낮은 경우 충전 균형을 변경 하려면 다른 수용 성 태그를 추가 하십시오.
      참고: 우리는 N 종점 (Myc-fll-GLUT4)에 펩 티 드에 해당 하는 첫 번째 luminal 루프 (fll) GLUT4 myc epitope (굵은 글꼴)와 태그의 사용: EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA 물에 있는 "좋은" 예측된 가용성을 .
   3. 75% 이상으로 주문 펩 티 드 순서 순도 분석 결과 대 한 충분 한 이며 가용성 테스트에 대 한 공급자를 요청. 펩 티 드를 녹이는 뜻하지 않은 문제가 있을 때 두 개 이상의 aliquots에 순서를 구분 합니다.
      참고: Myc fll GLUT4 두 aliquots에 명령 했다. 초순에 보고 된 그것의 가용성은 ≤ 10 mg/mL 이다.
2. 펩 티 드를 녹이는
   참고: 초순 최고의 용 매는. 펩 티 드 수용 성 수 나타나지 않을 경우 자세한 내용은 http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html를 참조 하십시오.
   1. 초순에 또는 버퍼의 선택, 100 μ g/mL의 농도에서 펩 티 드의 작업 솔루션 x 100을 준비 합니다.
   2. 50-100 µ L aliquots로 솔루션을 분리 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다

2입니다. 셀의 처리

1. 세포 배양
   1. 야생 타입 (WT) 세포를 사용 하 여 부정적인 제어 및 태그 6 히스티딘 (HisP)와 대상 단백질을 표현 하는 세포로.
      참고: 우리는 3T3 L1 사전 adipocytes 안정적으로 Sortilin-myc를 / 그의⁵페를 사용 합니다.
   2. Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 높은 설탕, 보충 10% 송아지 소 혈 청, 세포 성장 글루타민 (2mm)과 페니실린/스 (5 μ g/mL) 10% CO₂에서 37 ° C에서.
   3. 셀의 4 개의 10cm 요리, HisP와 그들의 두 transfect 앉아서 transfect 제어 플라스 미드 (WT)와 다른 두. transfection 후 48 h, 셀 80-90 %confluency 도달 한다.
2. 세포 Lysates의 준비
   1. 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% 글리세롤, 10mm 이미, 0.5% 트라이 톤 X-100 및 프로 테아 제 억제제 태그 그의 단백질, pH 7.4의 격리에 대 한 EDTA 없이 칵테일)를 준비 하 고 4 계속 ° c:
   2. 세 번 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 4 ° c.에서 x 1의 10 mL와 함께 세포를 씻어
   3. 얼음에 접시를 넣고 각 접시 500 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 세포 lysates 수확.
   4. 장소 세포 lysate 각 접시에서 다른 1.5 mL 튜브에. WT-pH6, WT pH8, HisP pH6, HisP pH8 튜브 라벨.
   5. 통과 세포 lysates 주사기 26 G 바늘 5 배 아래로, 완전 한 세포를.
   6. 4 ° c.에서 10 분 동안 16000 x g에서 세포 lysates 원심
   7. 새로운 동일 하 게 레이블이 지정 된 튜브는 supernatants 전송.
   8. BCA 단백질 분석 실험 키트 또는 다른 키트를 사용 하 여 단백질 농도 분석 합니다.
   9. 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여, 모든 4 개의 lysates의 단백질 농도 맞춰야.
   10. 각 lysate의 작은 (ca. 20 µ L) 약 수 고 가능한 제어 실험 및 문제 해결-20 ° C에서 그것을 유지 합니다.

3. HisPur 코발트 구슬에 그의 태그 단백질 바인딩

1. 상업적으로 이용 가능한 워시 버퍼를 사용 하 여 또는 하나 (50 m m 나₂HPO₄/NaH₂포₄, 300 mM NaCl, 20 mM 이미, pH 8)을 준비 하 고 4 ° c.에 그것을 유지합니다
2. 씻어 준비 버퍼 ph 6 tittering 워시 버퍼 pH 8에 의해 HCl.와 그것은 4 ° c.에
3. 부드럽게 동종 정지 있도록 코발트 구슬의 병을 소용돌이 친다.
4. 4 개의 1.5 mL 튜브 위에서 표시 (단계 2.2.4) 코발트 구슬 서 스 펜 션의 40 µ L을 분배.
5. 각 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 5 s. Aspirate는 상쾌한에 대 한 1000 x g에서 튜브를 원심 침전된 구슬에 40 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가.
6. 해당 튜브에 세포 lysates를 추가 합니다.
7. 튜브 회전 20 rpm에 4 ° C에서 90 분 동안 튜브를 품 어.
8. 1000에 튜브를 원심 5 s를 수집은 상쾌한 g x. 4 ° c.에는 상쾌한을 유지
9. 해당 관에 pH 8 또는 pH 6 워시 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 다시 부드럽게 구슬 일시 중단.
10. 1000 x g 5 s 및 폐기에 튜브 원심은 supernatants.
11. 4 시간 동안 3.9-3.10 단계를 반복 합니다.

4. 구슬에 움직일 그의 태그 단백질을 펩 티 드의 바인딩

1. 펩 티 드 (1.2.1 단계)의 100 배 작업 솔루션을 사용 하 여 준비 작업 솔루션 pH 6 또는 pH 8 워시 버퍼 (각 2 개의 100 µ L aliquots, 1 µ g/mL) x 1.
2. 해당 ph 씻어 구슬에 1 x 펩 티 드 솔루션의 100 μ를 추가 합니다.
3. 20 rpm에서 튜브 회전에 4 ° C에서 30 분 동안 구슬을 품 어.
4. 1000 x g 5에서 튜브 원심 s는 상쾌한 수집 및-20 ° c.에 그것을 유지
5. 4 시간 동안 3.9-3.10 단계를 반복 합니다.
   참고: 가능한 배경 감소, 다음 단계는 4.4 ~ 4.5 단계 대체할 수 있다.
6. 4 마이크로 열 30 μ m 모 공, 단계 2.2.4에서 그들을 라벨 고 열 수집 튜브에 배치.
7. 후 단계 4.3의 완료 열에 인큐베이션 혼합물을 전송, 중력에 의해 통과 솔루션을 수 있습니다. -20 ° c.에를 통해 흐름을 유지
8. 중력에 의해 워시 버퍼 pH 6 또는 해당 열 통해 pH 8의 500 µ L를 전달 합니다. 삭제를 통해 흐름.
9. 반복 단계 4.8 4 시간.
10. 마지막 세척 후 원심 1000 x g 15에서 열 s.

5입니다. 코발트 구슬에서 차입

1. 사용 상업 Tricine 샘플 버퍼 (200 mM Tris HCl, 40% 글리세롤, 2 %SDS, 0.04 %Coomassie 파란, pH 6.8) 2%의 최종 농도에 β-mercaptoethanol을 추가.
2. 씻어 구슬과 소용돌이 샘플을 Tricine 샘플 버퍼 (β-mercaptoethanol)의 40 µ L를 추가 합니다.
3. 100 ° C에서 10 분에 대 한 샘플 열 소용돌이 다시, 샘플 1000 x g 5에서 튜브 원심 및 s.
   참고: 감소는 차입에서 가능한 일반적인 바인딩, 다음 단계는 단계 5.1-5.3 대체할 수 있다.
4. 추가할 차입 이미 버퍼 (50 m m 나₂HPO₄/NaH₂포₄, 300 m NaCl, 이미 0.25 M m)의 40 μ는 씻어 비즈, 소용돌이 및 20 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어.
5. 3000 x g 30에 튜브 원심 s, 상쾌한 (eluted 샘플)를 수집 하 고 새로운 분류 관에 그것을 전송.
6. 각 튜브를 Tricine 샘플 버퍼의 40 μ를 추가, 100 ° C, 소용돌이 원심 분리기에서 10 분에 대 한 샘플 열 5 1000 x g에서 튜브 s.
   참고: 마이크로 열 사용 되는 경우, 세척된 구슬, 차입 버퍼 추가 20 분 동안 품 어 고 2 분 동안 8000 x g에서 원심 분리 하 여는 차입을 수집 합니다.
   참고: 샘플까지 전기 이동 법 수행-20 ° C에서 보관할 수 있습니다.

6. 전기 및 서 부 럽

참고: 샘플은 SDS 페이지와 후속 부 럽 분리에 대 한 준비. 젤 전기 이동 법 (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) 다음 수정 프로토콜을 따릅니다.

1. 상업적으로 사용할 수 있는 10-20 %Tricine 그라데이션 젤을 사용 합니다.
2. 젤에 eluted 샘플 20 µ L lysates (단계 2.2.10)의 20 µ L을 로드 합니다. 문제 해결에 대 한 것이 좋습니다 언바운드 재료 (3.8 단계)의 20 µ L을 로드 하 고 10; 펩 티 드의 ng 로드 하기 전에 이러한 샘플을 Tricine 샘플 버퍼의 동일한 금액을 추가 합니다.
3. 전기 이동 법 상용 트리 스/Tricine/SDS 실행 버퍼 (100 mM Tris, 100 mM Tricine, 및 0.1 %SDS, pH 8.3)에서 실시 합니다.
4. 전송 버퍼 (25mm Tris 기지, 192 m m 글리신, pH 8.4) 20% 메탄올을 가진 보충을 사용 하 여 0.45 μ m 니트로 막에 젤에서 자료를 전송 합니다.
5. 3%를 막 차단 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온에서 1 h. 가이드로 미리 스테인드 분자량 마커를 사용 하 여, 막 가로로 잘라, HisP에 대 한 항 체와 상단 부분 얼룩과 myc 태그 펩 티 드를 식별 하기 위해 myc epitope에 대 한 항 체와 함께 하단 부분 얼룩 있습니다.
   참고: 특정 경우에 막의 절단 필요 하지 않습니다 이후 HisP, Myc fll GLUT4 안티 myc 항 체를 검출 될 수 있다.

7입니다. 결과의 분석

1. 이미지 역 또는 ImageJ 프로그램을 사용 하 여 모든 서쪽 오 점 신호 강도 수량화 합니다.
2. Myc 태그 모두 pH 값에서 HisP에서 신호에 대 한 펩 티 드에서 신호를 정상화.

Results

Lysates L1 셀 Sortilin-myc를 / 그의⁵ 와 WT 3T3 L1 셀, 부정적인 컨트롤 사용에서 안정적으로 페 3T3에서 준비 되었다. 두 lysates pH 6 또는 pH 8에 코발트 구슬과 incubated 되었고 철저 하 게 씻어. 고정 단백질 구슬 Myc fll Glut4 솔루션에서 incubated 다음 했다. 주의 세척 후 단백질 구슬에 바인딩된 했다 eluted 0.25 M 이미와 함께. SDS-페이지 10-20% Tricine sortilin-myc를 / 그의 둘 다의 검출에 대 한 허용 반대로 Myc 항 체로 서 부 럽 그라데이션 젤 뒤에 원래 lysates 함께 샘플 복종 되었다 (110 kD) 및 Myc fll GLUT4 (5 kD) (그림 1) .

Discussion

Sortilin는 진화 보존된 멀티 ligand 단백질 수용 체 세포내 정렬 이벤트^6,7와 원형질 막에 두 신호에 관련 된 이다. 그러나, 정통 sortilin의 ligands (일부는 luminal 또는 완전 한 막 단백질)에 대 한 검색은 복잡 하다 바인딩 파트너의 일부와 함께 sortilin의 상호 작용 세제에 민감한 것 같다. 따라서, 쉽게 그리고 단백질 단백질 상호 작용, 공부에 대 한 광범위 한 접근 공동-immunoprecipitation, 쉽게 적용 될 수 없습니다. 일부 연구 그룹 sortilin와 그것의 잠재적인 ligands^8,9사이의 상호 작용을 보여 공동-immunoprecipitation 사용 해 왔다. 그러나, 이러한 실험 0.1%에 밖으로 진행 되었습니다 트리톤 또는 가용 화 막의 완전성에 의...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma	P8849	는 히스티딘 태그 단백질
인산염 완충 식염수 정제에 사용됩니다	Corning	21-040-CV	PBS
1mL 인슐린 주사기 U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA 단백질 분석 키트	Pierce	23228
세척 버퍼	Boston BioProducts	BP-234	His-tag 단백질 정제용
HisPur 코발트 수지	Thermo Scientific	89964
Tricine 샘플 버퍼	Bio-Rad	161-0739	SDS와 함께, bMercaptaethanol은
용리를 첨가해야 합니다.	250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine 프리캐스트 젤 10-20%	Bio-Rad	456-3115	펩타이드와 작은 단백질
Tris/Tricine/SDS 러닝 버퍼의 분리를 위해	Bio-Rad	161-0744
전송 버퍼	Boston BioProducts	BP-190	20% 메탄올
니트로셀룰로오스 멤브레인 추가  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
소 혈청 알부민	시그마	A9647	BSA
안티 Myc 항체	세포 신호	2272	토끼
펩타이드	Genscipt
주문 맞춤화 Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374