환경 농축 (EE) 생활, 스트레스, 질병 사이 연결의 기반이 되는 메커니즘을 공개 하는 데 사용 되는 동물 주택 환경입니다. 이 프로토콜에서는 콜론 tumorigenesis EE의 마우스 모델을 사용 하 여 특별히 microbiota 생물 다양성 동물 사망률에 영향을 줄 수 있는 변경을 정의 하는 프로시저를 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
여러 최근 연구 인간의 질병 개선에 풍부한 환경에서 생활의 유익한 효과 설명 했습니다. 마우스에서 환경 농축 (EE) tumorigenesis 마우스 면역 시스템을 활성화 하는 것을 줄여 또는 종양 microenvironment에서 향상 된 미생물 다양성을 포함 하 여 상처 복구 응답을 자극 하 여 종양 베어링 동물 생존에 영향을 줍니다. 여기에 마우스 대 장 종양 모델에서 미생물의 생물 다양성에 환경 농축의 효과 평가 하기 위해 자세한 절차입니다 제공. 동물 사육 및 동물 유전자 형 및 마우스 식민지 통합을 위한 고려 사항에 관한 주의 사항 설명, 모두는 궁극적으로 미생물 생물 다양성에 영향을. 이러한 예방 조치를 주의 더 균일 한 미생물 전송, 수 하 고 따라서 연구 결과 혼동 수 비 처리 종속 효과 완화할 것 이다. 또한,이 절차에서는 microbiota 변경 다음 장기 환경 농축 원심 결에서 수집 하는 자에서 분리 된 DNA의 16S rDNA 시퀀싱을 사용 하 여 특징입니다. 본질적인 microbiota 불균형은 염증 성 장 질환과 결 장 암, 뿐만 아니라 비만 및 다른 사람의 사이에서 당뇨병의 병 인에 연관 된다. 중요 한 것은, 다양 한 인간 질병을 정리 할 수 있는 존재 하는 강력한 마우스 모델 질병에서 미생물 병 인의 역할을 연구 하기 EE 및 미생물 분석을 위한이 프로토콜을 활용할 수 있습니다.
서론
환경 농축 (EE) 연구 활용 사회적 자극 (대형 주택 새 장, 동물의 더 큰 그룹), 인지 자극 (오두막, 터널, 중첩 물자, 플랫폼) 및 신체 활동 (실행에 영향을 미칠 복잡 한 주택 매개 변수 바퀴)입니다. EE은 질병 개시 및 barbering 유도 탈모 증, 알 츠 하이 머 병을 포함 한 마우스 모델의 다양 한 배열을 사용 하 여 진행에 증가 한 활동 및 사회 및 인지 향상 된 상호 작용의 효과 이해 하는 많은 실험실에 의해 이용 되어 레트 증후군, 그리고 여러 종양 및 소화기 질병 모델1,2,,34,,56.
여러 마우스 모델 콜론 tumorigenesis 쥐에 연구 개발 되었습니다. 아마도 가장 잘 정의 된 모델은 Apc분 마우스. Apc분 마우스 19907, 윌리엄 비둘기의 실험실에서 개발 되었다 그리고 일반적으로 인간 대 장 암 연관 된 APC 유전자에 돌연변이의 마우스 모델 사용 되었습니다. APC 돌연변이 은닉 하는 인간, 달리 Apc분 마우스는 주로 결 장 종양의 아주 드문와 작은 창 자 종양을 개발 합니다. 그러나, Tcf4에 단일 쫓 고 녹아웃 heterozygous 돌연변이와 Tcf4Het 대립 유전자는 훨씬 콜론 tumorigenesis Apc분 대립 유전자8과 결합 될 때 증가 합니다. 최근, 콜론 tumorigenesis의이 마우스 모델 콜론 tumorigenesis6EE의 효과 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 바이스 외에 공부, 남성 및 여성 4 개의 다른 마우스 라인에 EE의 생리 및 phenotypic 효과 (야생-타입 (WT), Tcf4Het / + Apc+ +, Tcf4+ + Apc분 / +, 및 Tcf4 Het / + Apc분 / +)) 정의 된. 아마도 가장 흥미로운 발견 EE 크게 둘 다 남성과 여성 결 장 종양 베어링 동물의 수명을 증가 했다. 이 시연 EE 적어도 줄일 수 있습니다 일부 증상의 콜론 tumorigenesis, 연관 및 동물 건강을 개선. 놀랍게도, 남성에서이 향상 된 수명 감소 tumorigenesis의 직접적인 결과 이며 대신 종양 상처 치유 향상 된 미생물 생물 다양성6을 포함 하는 응답의 개시에 연결 했다.
재미 있는 결과 함께 몇 가지 EE 특정 연구 출판 되었습니다. 그러나, 기술적인 관점에서 중요 한 결과 종종 없습니다 다른 실험실에 번역. 매우 복잡 한 문제, 아니라 농축 장치 및 주택 사용, 하지만 또한 침구, 음식, 환기, 번 식, 유전학, 방, 그리고 동물 프로토콜에서 활동은 다른 실험실 간의 동일한 EE 방법론을 유지 요구 사항, 다른 사람의 사이에서9,,1011. 한 예로 어디 동물 안정적으로 통합 마우스 식민지 따라서 유전 배경 및 식단 구성, 비 처리 관련된 효과 피하기 위해 정규화 동물의 통합 이다. 추가로, 많은 전자 연구 질병, 그리고 일반적인 마우스 농업 관행 본질적인 미생물10,12의 구성에 영향을 수 있습니다 방법에 미생물의 중요성의 실현 하기 전에 완료 되었습니다.
제대로 수행 하지 경우 전자에서 번 식 전략 및 동물 배치 스트레스를 증가 시킬 수 있습니다. 이후 EE 연구 다 수의 남성과 여성의 동물과 여러 genotypes 활용, 실험적인 체제 어려울 수 있습니다 결합 될 여러 새끼에서 동물에 대 한 요구를 주어진. 따라서, 한 번 식 및 전략 이유 다른 담가에서 올바른 유전자의 이유 동물의 결합을 위한 허용 하도록 개발 되었다. 이 대 한 기본 근거 새끼 중 microbiota를 정상화 하 고 스트레스를 줄이기 위해 동물 실험 환경으로 이동 하는 때 이었다. 미생물 댐10에서 전달 되었다. 식민지에 미생물 다양성을 제공 하려면 여성 잭슨 실험실에서 구입 하 고 실험9,,1012시작 하기 전에 한 달 동안 식민지에 통합 했다. 더 정상화 미생물 생물 다양성 동물 사이, 여성 공동 사육 이전 지 내게 했다. 번 식, 양육 하는 동안 공동 주택 및 탈출 하는 능력에 따라 간호 새끼 모성 배려13,14, 미생물 정규화를 가능 하 게 발전의 스트레스 수준을 향상. 비-전자를 방지 하기 위해 관련은 미생물에 대 한 효과, 모든 실험 동물의이 공동 주택 방지 한 실험으로 다른 담가에서 여러 남성을 결합할 때 발생 한 전투 및 추가적인 스트레스. 마지막으로, 모든 genotypes의 동물의 동등한 숫자는 연습장에 포함 됐다. 이 genotypes, 전반에 걸쳐 향상 된 microbiota 생물 다양성에 대 한 기회를 제공 하 고 제거 coprophagia (동물의 경향이 자 소비) 또는 전체 연구. 에 가능한 유전자 형 관련 행동 차이의 기여
이 프로토콜은 이전 EE 연구 미생물 연구, 더 균일 한 미생물 인구 수 있도록 microbiota 정규화 microbiota 전송 및 동물 식민지 통합의 알려진된 측면을 포함 하도록 확장 하는 전략을 제공 합니다. 사이 실험 동물. 이러한 예방 조치를 주의 하는 것은 수 비 처리 관련된 microbiota 차이의 연구 결과 혼동 때문 필수적 이다. 제거 하는 비-전자 관련 microbiota 변화 특히 질병 개발 및 진행 하는 동안 microbiota 구성에 EE의 역할을 정의 하는 연구자 수 있게 된다.
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 유타 대학에 의해 승인에 따라 수행 했다.
1. 실험 설계 및 전자 제어 케이지 설치
참고: 참고로, 실험 설계에 대 한 개요를 보여 줍니다 (그림 1).
-
컨트롤 (NE)와 EE 케이지 설정 (그림 2).
- 북동 감 금 소를 설정 하려면, 농축 장치 부족 압력가 기존의 제어 연습장 (표 1)을 사용 합니다.
- 큰 감 금 소, 밧줄 고리 및 터널 (자료 테이블)에 맞게 충분히 큰 감 금 소 당 1 구멍을 드릴 다운 합니다.
- 강아지를 양육 하 고 EE 케이지를 설정 하려면, 두 개의 큰 압력가 연습장 소독된 밧줄 보안된 터널 및 2 소독된 플랫폼 바닥 공간 (표 1)을 연결 합니다. 전자 실험에 대 한 소독 바퀴, 터널, 이글루, 오두막, 크롤링 공, 실행 하 고 EE 케이지 내에서 자료를 중첩을 제공 합니다.
- 동등한 환기를 제공 하기 위해 통풍이 랙에 EE와 네브라스카 케이지를 놓습니다.
참고: 2 플랫폼 (표 1)와 함께 두 개의 큰 연습장 설치15 양육 강아지 당 12 임신 여성의 최대 허용 ( 테이블의 자료를 참조, 문서 및 표 2에 3.2 단계). - 마우스 피드 광고 libitum 반구 표준 차 및 압력가 역방향 삼 투 물.
- 살 균 침구 재료와 마우스를 제공 합니다.
참고: 모든 조작 빈 새 장과 감 금 소 동물의 오염을 방지 하기 위해 후드에서 수행 되어야 합니다. 큰 감 금 소의 케이지 조작에 대 한 접착 필름으로 감 금 소에 구멍을 커버.
- 동물 사육에 대 한 준비. 2 주 전에 짝짓기에 대 한 단일 큰 새 장 (표 1)에 집 15 2 달 오래 된 여성 그룹. 별도로 짝짓기 전에 2 주 동안 2 달 오래 된 littermate 남성 집.
참고: Breeding 위한 암컷의 수는 실험과 필요한 동물의 수에 따라 달라 집니다. 이 연구에서는 15 여성 이용 하였다 12 연결된 암컷을 얻기 위해 최대는 1.1.2 (표 2)에서 설명 하는 설치를 양육 하는 강아지에서 허용 되는 수. - 번 식, 폐하와 댐 동물, 2 여성 당 1 남자 결합. 아침에 첫 번째 검사는 동물 밤 동안 성관계는 시각적 표시 일지도 모른다 질 플러그에 대 한 되어야 합니다.
참고: 하우스 남성 그리고 여성까지 각 여성 연결 되어 함께. 질 플러그 외부 경우에 시각적으로 확인할 수 있습니다.- 내 면된 플러그 감지, 프로브를 질에 삽입 되 고 조사 쉽게 삽입 되지 않도록 질 플러그 있으면 (16; 섹션 4.3.6 참조).
참고: 밤에 발생 한 짝짓기 이후 플러그 ½ 하루로 감지 하는 아침을 기록 합니다. - 여성 질 플러그, 일단 큰 강아지 그룹 주택 다른 성관계 여성 (농축 장치 없이 1.1.2 단계에서 설치)에 대 한 감 금 소에 그들을 전송.
- 바꾸기 여성 신규 unmated 그룹 보관 되어 암컷과 짝짓기 성관계 하 고 7 일간의 기간에 새끼의 최대 수를 얻기 위해 짝짓기를 계속.
참고: 모든 동물의 7 일 안에 배달 날짜를가지고 있어야 합니다.
- 내 면된 플러그 감지, 프로브를 질에 삽입 되 고 조사 쉽게 삽입 되지 않도록 질 플러그 있으면 (16; 섹션 4.3.6 참조).
- 임신 여성 그룹 주택 하나의 큰 강아지 감 금 소 (농축 장치 없이 1.1.2 단계에서 설치) 내에서 발생 하는 모든 새끼를 낳을 수 있습니다.
- 강아지 번호 및 생일, 그리고 나이의 7 일 유전형 새끼를 시작.
- 13,17그들을 식별 하는 숫자 코드와 나이의 7 일에 그들의 발가락에 새끼를 문신.
- 70% 에탄올과 발가락을 깨끗 하 고 부드럽게 발가락17 에 평행 하 게 피부 표면에 잉크를 포함 하는 마이크로-문신 장치 삽입 ( 재료의 표참조).
- Incising 7 일 된 신생아에서 직물의 작은 조각에 의해 꼬리 끝에서가 위로 유전형 조직을 수집 합니다.
- 조직에서 게놈 DNA를 분리 하 고 18에 설명 된 대로 기존의 인가요 메서드를 사용 하 여 PCR을 수행.
- 엄마와 함께 대형 연습장으로 14 ~ 21 일에 섹스에 의해 별도 동물.
참고: 이전 새끼, 자신의 피드 수 있습니다 젊은 새끼 그들의 자신의 먹이를 충분히 오래까지 간호사에 게 계속 확인 합니다. - 21-28 일에 배포 남성과 여성 동물 별도로 유전자 형에 의해 북동 또는 EE 환경, 케이지 (그림 2A) 당 각 유전자의 동일한 비율을 유지 하.
참고: 각 네브라스카 또는 EE 장에 허용 하는 동물의 총 수 IACUC (표 2)에 의해 허용 되는 최대 수에 따라 확인 합니다. 북동 감 금 소는 대부분 5 동물 (표 2). EE 케이지, 사회적 자극, 아니 20 하 고 공간 제한에 더 이상 41 동물 EE 케이지 (표 2)에서 허용 되어야 한다.
- 강아지 번호 및 생일, 그리고 나이의 7 일 유전형 새끼를 시작.
2. 나이의 16 주에의 자 컬렉션
- 1 ~ 2 일 이전에 희생의 자 컬렉션을 시작 하 고 별도로 살 균 도구를 사용 하 여 해 부 동안 희생의 날에 대변을 수집 합니다.
참고: 동시 컬렉션 1-2 일전에 수집의 자 없는 자는 컬렉션의 시간에 존재 하는 가능성으로 인해 샘플의 손실을 방지 하기 위해 도움이 됩니다.- 수집 대변 살아있는 동물, 신중 하 게 아저씨에서에서 동물 깨끗 한 감 금 소에. 자 살 균 microfuge 관으로 소독 집게를 사용 하 여 수집 합니다.
참고: 일반적으로 동물의 자, 움직일 때 살 균 microfuge 관으로 직접 빠른 대변 수집 수 있는 제거 하 게 됩니다. 움직일 때 동물 즉시 배변 하지 않습니다, 깨끗 한 감 금 소에 배치 하 고 (일반적으로 최대 1 h) 똥을 동물에 대 한 기다립니다. - 희생의 하루에 대변을 수집 합니다.
- 동물을 euthanizing 동물 isoflurane에 흠뻑 목화 공 작은 컨테이너를 포함 하는 벨 항아리에 장소. 호흡의 정지 (2 분) 후 일반적으로 관찰 되 면 결 장 해 부를 허용 하도록 그것의 뒤에 동물을 하다.
- 마우스 복 부에 70% 에탄올을 적용 됩니다.
- 집게와 요도 개통 앞쪽 피부를 리프트 하 고는 흉 곽에 도달할 때까지 복 부 정중 선 따라 잘라가 위를 사용 하 여 각 다리 쪽으로 첫 번째 절 개의 기지에서 잘라. 피부를 다시 접어과 위를 사용 하 여 동일한 패턴에 복 벽을 통해 잘라.
- 집게를 사용 하 여 해 부 및 원심 결 장 곧은 창 자에서 분리를 항문에 원심 결 파악. 당기면 집게, 수직으로 콜론 콜론 출시 mesentery 통해 잘라가 위를 사용 합니다.
- 바로 아래 맹 결 고 필터 종이에 누워. 집게를 사용 하 여 삽입할 열려가 위 한쪽에 있도록 루멘 여 콜론 튜브의 상단을 들어. 경도, 인접, 하 splay 원심 오픈 콜론 세로로 잘라.
- 소독 집게를 사용 하 여 살 균 microfuge 관으로 원심 결 장에서 대변을 수집 합니다.
- 수집 대변 살아있는 동물, 신중 하 게 아저씨에서에서 동물 깨끗 한 감 금 소에. 자 살 균 microfuge 관으로 소독 집게를 사용 하 여 수집 합니다.
- -80 ˚C에 microfuge 관 세균성 DNA 고립의 시간까지 대변을 저장 합니다.
참고: 자 뿐만 아니라 희생의 날에 다른 샘플 전체 혈액, 혈 청, 플라즈마, 정상 및 종양 조직 결 장 및 작은 창 자, microsomes, 지방 조직 등에서 수집 합니다. 하는 연구에서 정의 된 질문을 해결 합니다.
3. 게놈 DNA 분리의 자에서
참고: 자의 자 병원 체 탐지 프로토콜을 다음에서 미생물 DNA 분리 상업 키트를 활용. 무게 동안 직접-80 ˚C 냉장고와 드라이 아이스에 저장소에 대 한 샘플을 제거 합니다.
- 실 온 (RT)의 자 세포의 용 해 버퍼의 1.4 mL를 포함 하는 깨끗 한 microfuge 관에 대변의 220 밀리 그램까지 전송 ( 재료의 표참조).
- 철저 하 게 균질 고체 (그림 2B)를 1 분 동안 소용돌이 샘플. 5 분 (를 포함 하 여 그람 양성 박테리아) 모든 박테리아를 lyse 95 ˚C 정지 열.
- 와 동 15 s 그리고 작은 자 솔리드 1 분 20000 x g에서 원심 분리기에 대 한 샘플. 2 mL microfuge 관 상쾌한 전송. 각 샘플을 PCR 억제제, 소용돌이 태블릿 용 해 될 때까지 흡수 한 태블릿을 추가 하 고 1 분 동안 RT에서 샘플을 품 어.
- 원심 3 분 20000 x g에서 샘플 하 고는 상쾌한 새로운 microfuge 관으로 전송. 새로운 1.5 mL microfuge 관으로 20000 x (20 mg/mL 주식) 성분 K의 3 분 Aliquot 15 μ g에서 원심. 샘플의 200 μ 가수분해 K. 포함 된 튜브에 플라스틱
- 추가 guanidinium 염화 물 세포의 용 해 버퍼 튜브에, 15에 대 한 철저 하 게 소용돌이의 200 μ s ( 재료의 표참조) 관에 에탄올 (96-100%)의 10 분 추가 200 μ에 대 한 70 ˚C에서 샘플을 품 어와 vortexing에 의해 잘 혼합.
- 장소는 실리 카 2 mL 컬렉션 튜브에 스핀 열을 기반으로 하 고 열에 샘플을 적용 합니다. 뚜껑과 20000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 닫습니다.
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브는 열 전송 및 500 μ 워시 버퍼 1 열으로의 열 그리고 20000 x g. 전송 열 새로운 2 mL 컬렉션 튜브에 1 분 동안 원심 분리기 뚜껑과 500 μ 워시 버퍼 2의 열에 추가 추가 모자와 3 분 20000 x g에서 원심 분리기를 닫습니다.
- 폐쇄 하는 모자와 함께 새로운 2 mL 컬렉션 튜브에 열을 전송 하 고 잔여 워시 버퍼를 제거 하려면 20000 x g에 추가 1 분에 대 한 원심. 1.5 mL microfuge 관을 표시 하는 열을 전송 하 고 막에 EDTA를 포함 하는 차입 버퍼의 200 μ를 추가 하 여 샘플을 elute ( 재료의 표참조).
- 뚜껑을 닫고 1 분 20000 x g. 삭제 열에서 1 분 동안 원심 분리기 샘플에 대 한 RT에서 품 어.
4. DNA 농도 결정 및 PCR 위한 샘플 준비
참고: fluorometer와 각 샘플에 있는 genomic DNA 농도 결정 하는 상용 dsDNA 형광 분석 결과 활용 ( 재료의 표참조). 형광 성 염료는 특히 두 배 좌초 된 DNA를 바인딩해야 합니다.
- 각 샘플 (199 µ L dsDNA 마스터 믹스에 각 샘플의 1 µ L) 및 1시 50분의 1: 200 희석 준비 표준 희석. DsDNA 설정을 사용 하 여 fluorometer에 분석.
참고: PCR에 DNA의 높은 볼륨 억제 될 수 있다, 따라서, 사용 하는 DNA의 PCR의 최종 볼륨의 10% 이상 되지 않아야 합니다. fluorometer로 형광 염료에 바인딩된 DNA만 형광은 최종 계산 된 DNA 농도에 오염 물질의 가능한 기여 제거 샘플에서 DNA의 정확한 측정을 수 있습니다. 이 정도의 정확한 정량 다운스트림 시퀀싱 응용 프로그램에 대 한 필수적입니다. - 5 ng/μ 10 mm Tris, pH 8.5 각 샘플의 작업 서식 파일 주식 수 있도록 적절 한 양으로 희석 하는 PCR 서식 파일을 준비 합니다.
- -20 ° c.에 샘플 저장
5. 디자인 뇌관에서 16S에 원하는 V 지역
- 선택적으로 원하는 V 16S rRNA 지구를 증폭 하기 위하여 뇌관을 디자인 합니다.
- 다양 한 문의 대 한 대략적인 적중률 확인 하19Ribosomal 데이터베이스 프로젝트 프로브 일치, 뇌관을 분석 합니다.
참고: V1-V3 지역, 사용 하는 현재의 연구 출판 뇌관 Bosshard 앞으로20, V1 지역 위치 8에서 현재 533 역21, 533 v 3 지역 내에서 위치에 바인딩하는 바인딩. 프라이 머는 인덱싱 오버행 어댑터 시퀀스를 포함 해야 합니다. - 뇌관을 디자인할 때는 16S metagenomics 라이브러리 준비22 (표 3)을 시퀀싱에 대 한 권장 각 뇌관의 5' 끝에 어댑터 시퀀스를 포함 합니다.
- 이러한 큰 뇌관 카트리지 정화와 음성 합성. Desiccated 뇌관을 다시 구성 하 고 10 mM Tris, pH 8.5에서에서 1 μ M 재고 일 PCR을 희석.
6. Amplicon PCR 증폭 오버행 어댑터 시퀀스 V 지구 22 연결
- amplicon PCR 반응 혼합 표 4에 설명 된 대로 설정 합니다.
- 접시에 접착제 분명 PCR 플레이트 인감을 놓고 amplicon 표 5에 매개 변수를 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.
- (선택 사항) Amplicon amplicon 크기의 정량적 측정을 가능 하 게 높은 감도 DNA 분석 결과 agarose 젤에 PCR 제품을 실행 ( 재료의 표참조).
참고: 이 연구에서 amplicon 크기는 550 bp (그림 3A).
7. 22 비즈 PCR 정리를 사용 하 여 자기
- 1000 x g 결로 수집을 1 분 동안에 빠르게 amplicon PCR 격판덮개 원심
참고: PCR 튜브 스트립 오염을 최소화 하기 위해 PCR 번호판 대신 사용할 수 있습니다. 관 뚜껑을 폐기 하 고 결코 다시 사용. - 잘, 각 amplicon PCR 균등 하 게 분산, 자석의 20 μ 추가 하 자석 구슬 비즈 소용돌이 다음 플라스틱 전체 볼륨 아래로 천천히 10 번.
- 품 어 RT에서 5 분 장소 PCR 접시 2 분 마그네틱 스탠드에 대 한 때까지 자석 구슬 수집과 상쾌한 분명 하다. 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
- 워시 200 μ 신선한 80% 에탄올 PCR 접시는 자석에 서 구슬과 30 품 어 마그네틱 스탠드에 RT에서 s. 조심 스럽게 제거는 상쾌한.
- 두 번째 시간에 대 한 세척을 반복 합니다. 이제, 미세 피 펫 팁을 사용 하 여 우물에서 어떤 잔여 에탄올을 제거 하 고 10 분 동안 건조 공기를 허용 하.
- 마그네틱 스탠드에서 PCR 플레이트를 제거 하 고 추가 10 mM Tris pH 8.5의 52.5 μ 각 잘. 최대 플라스틱 하 고 아래로 10 번 구슬을 일시 중단 하 고 2 분 동안 실 온에서 품 어.
- PCR 플레이트 마그네틱 스탠드 자석 구슬 수집 하 고 깨끗 한 PCR 접시에는 상쾌한의 50 μ를 전송를 전송. 접시에 접착제 분명 PCR 플레이트 인감을 놓고 1 주일-20 ˚C에 저장 합니다.
8. 인덱스 PCR 접시 체계의 준비
참고: V1-V3 라이브러리를 생성 하려면 두 번째 PCR 인덱스 수행 키트 ( 재료의 표참조). 기본 인덱싱 구성표 (그림 3B 와 23) 각 샘플에 대 한 독특한 듀얼 인덱스 조합을 매핑하는 데 사용 되었다.
- 각 샘플 2 인덱스 뇌관의 독특한 조합을 있는지 확인 하십시오 (즉, 듀얼 색인).
9. 인덱스 설명된 22 로 어댑터 시퀀스에 바코드를 부착 하는 PCR을 수행 합니다.
- 인덱싱에 도움 인덱스 플레이트 설비에 새로운 96 잘 접시를 PCR amplicons (깨끗 한 amplicons)의 2.5 μ를 전송 합니다.
- 인덱스 1을 주선 하 고 준비 된 접시 그래픽 (그림 3B)의 예와 2 뇌관을 색인.
참고: 시각적 신호 뇌관 에러를 피하기 위해 제공 됩니다: 인덱스 2 뇌관 튜브 있어야 흰색 모자와 명확한 솔루션, 인덱스 1 뇌관 튜브 오렌지 모자와 노란색 솔루션 있어야 하는 동안. - 표 6에 설명 된 대로 인덱스 PCR 혼합 반응을 조립 한다. 10 번 위아래로 pipetting으로 혼합. 접착제 분명 PCR 판 도장 커버 하 고 1 분 동안 실 온에서 1000 x g에서 수집 원심.
- 색인 표 7에 매개 변수를 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.
10. 최종 PCR 라이브러리 정화
참고: 이 PCR 대 청소는, 위의 단계 7 사용 하 자석 구슬 PCR22인덱스의 PCR 청소를 수행.
- 1000 x g 결로 수집을 1 분 동안에 빠르게 10 단계에서 PCR 격판덮개 원심
- 잘, 각 amplicon PCR 균등 하 게 분산, 다음 20 μ의 자석 추가 자석 구슬 비즈 소용돌이 다음 위아래를 섞어 천천히 10 번 전체 볼륨 플라스틱.
- 5 분에 대 한 RT에서 품 어.
- 장소 PCR 접시 2 분까지 자석 구슬 수집 하 고 표면에 뜨는 마그네틱 스탠드에 분명 하다. 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
- 워시 200 μ 신선한 80% 에탄올 PCR 접시는 자석에 서 구슬과 30 품 어 마그네틱 스탠드에 실 온에서 s. 조심 스럽게 제거는 상쾌한.
- 두 번째 시간에 대 한 세척을 반복 합니다.
- 두 번째 세척에 따라 우물에서 어떤 잔여 에탄올을 제거 하 고 10 분 동안 건조 공기를 허용 하는 미세 피 펫 팁을 사용 합니다.
- 마그네틱 스탠드에서 PCR 플레이트를 제거 하 고 추가 10 mM Tris pH 8.5의 52.5 μ 각 잘. 최대 플라스틱 하 고 아래로 10 번 구슬을 일시 중단 하 고 2 분 동안 실 온에서 품 어.
- PCR 플레이트 마그네틱 스탠드 자석 구슬 수집 하 고 깨끗 한 PCR 접시에는 상쾌한의 50 μ를 전송를 전송. 접시에 접착제 분명 PCR 플레이트 인감을 놓고 1 주일-20 ˚C에 저장 합니다.
- (선택 사항) Agarose 젤 또는 amplicon 크기의 정량적 측정을 가능 하 게 높은 감도 DNA 분석 결과에서 실행 하는 인덱스 PCR 제품 ( 재료의 표참조).
참고: 이 연구에서 마지막 인덱싱된 라이브러리 크기는 668 bp (그림 3C-D).
11. 계량, 정상화, 및 시퀀싱에 대 한 인덱싱된 라이브러리 수영장
- 각 샘플의 DNA 농도 fluorometer와 dsDNA 형광 분석 결과 키트 결정 (재료의 표 참조).
- 각 인덱싱된 샘플 (190 µ L dsDNA 마스터 믹스 및 표준의 10 µ L) 표준 샘플 (199 µ L dsDNA 마스터 믹스, 버퍼 및 시 약을 포함 하는 각 샘플의 1 µ L)의 1: 200 희석을 준비 합니다. DsDNA 설정을 사용 하 여 fluorometer에 분석.
- DNA 농도 계산에 따라 평균 라이브러리 크기를 계산 하 여 라이브러리를 정상화. 어댑터 길이, 인덱스 길이 및 뇌관에서 V amplicon 크기를 요약 하 여이 작업을 수행 하 고 특정 실제 크기는 비슷합니다 (그림 3C, 22참조) 계산 된 크기를 agarose 젤 제품 보기.
- 또는, DNA 무결성, amplicon 크기 및 농도 (테이블의 자료, 그림 3D)의 정량적 측정을 가능 하 게 높은 감도 DNA 분석 결과 사용 합니다.
참고: 이 연구에서는 평균 라이브러리 크기 요약 어댑터 길이, 인덱스 길이 및 뇌관에서 V1-V3 amplicon 크기에 따라 계산 했다. 평균 크기는 668 혈압. - 샘플의 농도 표 8에 수식을 사용 하 여 정규화 됩니다.
- 또는, DNA 무결성, amplicon 크기 및 농도 (테이블의 자료, 그림 3D)의 정량적 측정을 가능 하 게 높은 감도 DNA 분석 결과 사용 합니다.
- 4 nM 및 수영장 5 샘플을 희석 시퀀싱에 대 한 단일 관으로 각 4 nM 샘플에서 μ.
12. 순서는 차세대 시퀀싱 시스템을 사용 하 여 라이브러리 및 데이터 구문 분석
- 시퀀스는 라이브러리입니다.
참고: 이 연구를 위해 대학의 유타 높은 처리량 유전체학 코어 라이브러리 변성 및 샘플 시퀀싱 ( 6,22에 설명) 하는 대로 수행 합니다. - 데이터를 구문 분석 합니다.
참고: 풀링된 샘플에서 데이터를 분리, 인덱스 읽기 확인 되었고 ( 22에서 같이)를 분리. - FASTQ 파일을 생성 하 고이 이후의 데이터 분석을 위해 활용.
13. 16S Amplicon 라이브러리에서 시퀀스 데이터 분석
참고: 이 단계는 바이스 외에 설명 된 대로 수행. 2017,6.
- (참조 자료의 테이블; 자유롭게 사용할 수 있는 데이터 분석 도구 설치 24).
- (25,26에서 같이) 시퀀스 데이터에서 역다중화 fastq 파일을 조립. 모든 unassembled 시퀀스를 삭제 합니다.
- 드 노 보 오픈 분류학 단위 (OTU) 따기 ( 27에서 설명)와 프로토콜을 다음과 같은 분석을 수행 합니다.
- 28에 설명 된 대로 sampleID에 의해 단일 fastq 파일에 시퀀스 및 그룹 시퀀스 97% 또는 OTUs에 큰 유사성을 빈. 150과 75% 정체성29,30의 최소 시퀀스 길이 설정 코어의 대표적인 시퀀스를 정렬 합니다. 설명된28로 분류를 지정 합니다.
참고: 샘플 범주화 될 수 있습니다 및31, 분류학 할당 및 OTU 표 건설32분석. - 설명 하는 이름 및 링크 샘플 식별 하 고 유효성을 검사할 매핑 파일33,34샘플의 특성을 식별 하는 매핑 파일을 만듭니다.
- OTU 네트워크 OTUs 매핑 파일35를 사용 하 여 샘플 설명에 링크를 확인 합니다.
- 플롯36통해 taxa를 요약 하 여 관계 되는 풍부의 점에서 분류 요약을 계산 합니다.
- 균일 한 시퀀싱 깊이 샘플에 적절 한 샘플의 알파 다양성을 탐구 한다. 알파 다양성에 대 한 적절 한 깊이 정의 하려면 37에 설명 된 대로 biome 요약 테이블 명령을 사용 하 여 각 샘플에서 관찰 된 총 수를 요약 합니다.
- 28에 설명 된 대로 sampleID에 의해 단일 fastq 파일에 시퀀스 및 그룹 시퀀스 97% 또는 OTUs에 큰 유사성을 빈. 150과 75% 정체성29,30의 최소 시퀀스 길이 설정 코어의 대표적인 시퀀스를 정렬 합니다. 설명된28로 분류를 지정 합니다.
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결과
여러 연구 결과 정신 신체 의학의 실천 건강 결과 개량 한다 설명 했다. 마찬가지로, 마우스, 환경 농축 향상 된 수명 등 종양 상처 복구6결과 향상 시킵니다. 따라서, 전자 절차는 첫 번째 실험 (그림 1)의 개시 전에 미생물을 정상화 하는 동안이 표현 형에 microbiota의 역할을 정의 하는 것을 목적으로 개발 되었다. 중요 한 것은, 모든 사육 동물의 번 식, 시작 전 적어도 한 달 동안 마우스 식민지에 통합 되어 있으며 신생아 강아지 공동 실험 전에 microbiota 전송 정상화를 하나의 큰 감 금 소에 어머니와 함께 지 내게. 동물 21, 28 일 사이, 각 유전자 형의 동등한 숫자는 투약를 중단 시킨 그들의 각각 주택, EE 또는 북동 환경 (그림 2A)으로. 16 주에 수집 ...
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토론
이 절차는 microbiota의 자 정상 또는 종양 동물 베어링의 환경 풍부를 다음에서 분리 된의 분석에 대 한 수 있습니다. 다른 남녀의 genotypes 많은 동물을 얻기 위해 사육을 포함 하는 큰 실험 이기 때문에, 필수적 이다 동물 실험의 시작 전 사이 미생물 정상화 EE 비를 피하기 위해 관련 미생물에 대 한 효과 생물의 다양성입니다.
네브라스카 및 전자 상태 사이의 일관성을 위해 번 식 과정은 모든 마우스 처음 같은 미생물에 노출 해야 하 고, 따라서, 비슷한 미생물 내용 것으로 예상 된다 위해 수행 됩니다. 그것은 가능한, 그리고 그 마우스 유전자, 미생물 구성에 영향을 줍니다. 이러한 이유로, 유전자 형 당 마우스 숫자는 대변을 소비 하는 어떤 동물 든 지는 미생물의 유사한 다양성을 발생할 것입니다 특정 조건은 NE와 EE 사이 유지 됩니다.
실험 EE를 디자인할 때 몇 가지 어려움은 명백한 있습니다. 첫째, 동물 ...
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공개 사항
저자는 그들은 충돌의 관심을가지고 선언.
감사의 글
B. 달리는 통계 조언과 국립 암 연구소 수상 P30 CA042014에 의해 지원 되는 이러한 기술 코어에 대 한 액세스에 대 한 유타 대학 생물 통계학 핵심 라이브러리 시퀀싱 및 K. 바우처에 대 한 유타 대학 게놈 코어에는 감사 합니다. 설명 하는 프로젝트는 국립 암 연구소 보조금 P01 CA073992 K01 CA128891와 사냥꾼 암 재단에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | 표준 방사선 조사 차우는 Mario Capecchi 박사와 Harlan Labs가 공동으로 제조했습니다. |
| Cell-Sorb Plus 침구 | Fangman Specialties | 82010 | 사용 전 오토클레이브. |
| 신생아를 위한 AIMS 문신 시스템 | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Aramis Micro Tattoo Kit를 포함하여 다른 동물 등급 문신 시스템 및 잉크를 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone 마우스 마이크로 아이솔레이터 시스템 케이지, AllerZone 필터 탑 및 모듈식 다이어트 전달 시스템이 완비된 | Lab Products | 82120ZF | 각 EE 케이지는 각 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF 및 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 수명 강화 장치 | 실험실 제품 | 82109ZF | 각 EE 케이지에는 각 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF 및 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" 길이 X 19-1/16" 너비 X 7-3/4" 깊이 | 실험실 제품 | 82100ZF | 각 EE 케이지는 각 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF, 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator 필터 탑 | Lab Products | 82101ZF | 각 EE 케이지는 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF 및 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 또는 K3332 | 케이지를 함께 연결하고 농축 |
| 그로밋에 사용 터널을 케이지에 연결 | 타 대학교 기계 공장에서 제작 | 해당 | 없음 재료가 씹는 및 오토클레이브에 내성이 있는지 확인하십시오 |
| 패스트 트랙 휠 | Bio-Serv | K3250 또는 K3251 | 마우스 이글루 및 바닥용 |
| 마우스 이글루 | Bio-Serv | K3328, K3570 또는 K3327 | 패스트 트랙 휠 및 바닥용 |
| 마우스 이글루 바닥 | Bio-Serv | K3244 | 마우스 이글루 및 패스트 트랙 |
| 마우스 오두막 | Bio-Serv | K3272, K3102 또는 K3271 | |
| 크롤 볼 | Bio-Serv | K3330 또는 K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | 목재 펄프 오두막 보호 및 중첩에 사용 |
| 접착 필름 | VWR | 60941-072 | 마우스가 탈출하는 것을 방지하기 위해 대형 케이지의 드릴 구멍을 임시로 덮는 데 사용 |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | 본 연구에서 사용한 캐비닛은 현재 공급되지 않습니다. Bio-C36은 매우 유사합니다. |
| 1.5 mL 마이크로분리 튜브- RNAse 및 DNAse 무함유 | 모든 공급업체 | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | 이 키트는 50개의 DNA 전처리를 위한 시약을 공급합니다. 대변 용해 완충액=ASL; 구아니디늄 클로라이드 용해 완충액= AL; 구아니디늄 클로라이드를 사용한 세척 버퍼 1 = AW1; 세척 버퍼 2= AW2; EDTA=AE Waterbath를 사용한 용리 완충 |
| 액(95도까지 가열 가능) | 모든 공급업체 | 대변 샘플을 세포로 94도 배양합니다. | |
| 수조 (70도까지 가열 가능) | 어떤 공급업체 | 대변 샘플의 70도 인큐베이션을 위해 | |
| 에탄올(200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| 형광측정기: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA 광범위 어세이 키트 | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB 버퍼 또는 10mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| 실험 특이적 프라이머 | 모든 공급업체 | ||
| PCR 등급 물 | 어떤 공급 업체 | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart 준비 믹스 | Kapa Biosystems | KK2601 | (1.25mL는 100rxns 허용). |
| 진단 젤 실행을 위한 Agarose | 모든 공급업체 | ||
| TapeStation, 고감도, D1000, 스크린 테이프, 트레이스 | 애질런트 | 5067-5583 | TapeStation 또는 Bioanalyzer 기기는 라이브러리 품질을 분석하기 위해 기관 유전체학 코어에서 일반적입니다. 또는 Bioanalyzer DNA1000 Chip(Agilent, 5067-1504)을 사용할 수 있습니다. |
| Agencourt AMPure XP 마그네틱 비드 | Beckman Coulter | A63880 | 마젠틱 비드 PCR 세척 - 5mL는 250개의 PCR 반응을 세척합니다. |
| 마그네틱 스탠드 | Life Technologies | AM10027 | |
| 라이브러리 준비 가이드 | Illumina | Illumina. 16S 메타게놈 시퀀싱 라이브러리 준비: Illumina MiSeq 시스템을 위한 16S 리보솜 RNA 유전자 앰플리콘 준비. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager 소프트웨어 | 무료 제공: |
| https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | 앰플리콘에 바코드를 추가하는 데 사용 |
| MicroAmp Optical 96-well 반응 플레이트 | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq 인덱스 플레이트 고정 장치 | Illumina | FC-130-1005 | |
| 접착식 투명 플레이트 씰 | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp 접착 필름 |
| v3 시약 및 이중 300 bp 판독을 사용한 MiSeq에 의한 시퀀싱 | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | 단백질 분해 효소 K의 20mg/ml에 해당. QiaAmp 키트와 함께 제공 |
| 데이터 분석 도구 | Qiime QIIME | 소프트웨어 도구 | 설치 시스템에 따라 다를 수 있으며 QIIME 웹 사이트에는 몇 가지 옵션(http://qiime.org/install/install.html)이 설명되어 있습니다. 본 연구를 위해 MacQIIME 소프트웨어 패키지 1.9.1(Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| 13.2 | Qiime | FastQ 조인 방법 | ( http://code.google.com/p/ea-utils ). 이 연구를 위해 다중 조인 쌍 끝이 http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html 사용되었습니다. Aronesty, E. ea-utils: 생물학적 염기서열 분석 데이터를 처리하기 위한 명령줄 도구. 표현 분석, 더럼, 노스캐롤라이나. (2011). |
| 단계 13.3. | Qiime | De-Novo OTU 피킹 프로토콜 | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| 단계 13.3.1. | 사용하는 OTU(Open Taxonomic Unit). | 생물정보학. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| 단계 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: 시퀀스를 템플릿 정렬에 정렬하기 위한 유연한 도구. 생물정보학. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| 단계 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, ARB와 호환되는 키메라 검사 16S rRNA 유전자 데이터베이스 및 워크벤치. Appl Environ 미생물. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). 본 연구에서는 Greengenes 버전 13_8 |
| 13.3.1이 사용되었다. 참고: | Qiime | 다중 분할 라이브러리 | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. 참고: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| 단계 13.2.2. | Qiime | 매핑 파일 http://qiime.org/documentation/file_formats.html 만듭니다 | . |
| 단계 13.2.2. | Qiime | 매핑 파일의 | 유효성을 http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html |
| 단계 13.3.3. | Qiime | OTU를 매핑 파일 http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html 에 대한 샘플 설명에 연결합니다 | . |
| 단계 13.3.4. | Qiime | 플롯 http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html 통해 분류군을 요약합니다 | . |
| 단계 13.3.5. | Qiime | Biome 요약 표 | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html 이 연구에서는 모든 샘플을 20,000 OTU로 희소화한 후 QIIME에서 알파 희박 스크립트를 사용하여 분석했습니다. |
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- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849(2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193(2014).
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