분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

Summary

이 종이 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 hemangioblastomas (HBs)와 HBs에서의 역할에 있는 포괄적인 절차를 제공 합니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 형태의 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

Abstract

폰 Hippel Lindau (VHL) 종양 억제기 유전자의 비활성화 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 hemangioblastomas (HBs)의 개발에 중요 한 역할을 하고있다. 그러나, cytological 근원 그리고 HBs (neovascularization 포함)의 진화 과정 남아 논란, 그리고 안티-신생 VHL-HBs, 고전적인 HB 신생에 기반에 대 한 임상 시험에서 실망 스러운 결과 생산 했습니다. 반대로 혈관 치료의 성공적인 임상 번역 한 주요 장애물이 neovascularization 혈관이 종양에의 한 철저 한 이해의 부족 이다. 이 문서에서는, 우리가 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 HBs, HBs의 역할에 있는 포괄적인 절차 제시. 이 절차와 연구원 수 정확 하 게 HB neovascularization의 복잡성을 이해 하 고이 일반적인 형태의 HBs에 신생의 함수를 식별. 이러한 프로토콜 있는 잠재력이 높은 변환 종양 치료 또는 HBs에 대 한 안티-신생 치료의 최적화에 돕고 미래에 번역에 대 한 종양을 위한 가장 유망한 항 혈관 치료를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 양식 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

Introduction

Hemangioblastomas (HBs)는 독점적으로 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 발견 되는 양성 혈관 종양. 그들은 폰 Hippel Lindau (VHL) 질병 또는 산발적 병 변 환자에서 개발. VHL HBs 빈번한 재발으로 인해 수술 치료를 통해 치료 하기 어려운 고 발생이 유전자 여러 병 변 장애¹. VHL 종양 억제기 유전자의 비활성화 VHL HBs tumorigenesis의 근본 원인을 고려 하고있다, 비록 HBs의 진화 과정과 cytological 근원 (를 포함 하 여 neovascularization) 크게 논란이²남아 있다. 따라서, HB-신생 생물 학적 메커니즘의 더 나은 이해 VHL HBs에 대 한 가장 유망한 항 혈관 전략에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

최근 연구는 건의 HB neovascularization가 vasculogenesis^3,,45와 비슷합니다. 고전적인 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)-중재 신생 혈관 내 피에서 유래 하 고 그 ....

Protocol

이 메서드는 연구 윤리 위원회의 Huashan 병원, 복 단 대학교의 승인 된 지침에 따라 수행 되었다. 해당 표준 안전 조치는 각 단계에 따라 했다. 도식 프레 젠 테이 션, 그림 1을 참조 하십시오.

1. 세포 배양 및 플라스 미드 구조

1. 정기적으로 유지 하는 Dulbecco에서 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린, 100 단위/mL와 100 µ g/mL 스 습도 5%에서의 보완 수정의 CO₂ 배양 기 37 ° c.에
2. PLKO.1 플라스 ApaI와 EcoRI shRNA 조각의 합성에 대 한 다이제스트. VHL shRNA 벡터의 oligonucleotide 시퀀스 CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴인지 확인 합니다.
3. 다음, 20 µΜ 시스템 올리고, 역방향 올리고의 5 µ L, 코 버퍼 x 10의 5 µ L ddH₂O 함께 (총 볼륨은 50 µ L)의 35 µ L의 앞으로 5 µ L 믹스. 몇 시간에서 4 분, 그리고 ....

Results

거꾸로 가벼운 현미경에 의해 원래 이미지를 가져옵니다. VHL 그룹과 컨트롤 그룹의 전형적인 이미지는 그림 2에 표시 됩니다-A1 및 그림 2-A2. 컨트롤 그룹의 돋 아 길이 VHL 그룹 보다 짧습니다.

이미지를 업로드 후 온라인 플랫폼 직접 분석 결과 제공 합니다. 출력 두 부분으로 구성: 처리 된 이미지와 해당 분석 결과. 처리 된 이미지는 컨트롤 그룹과 VHL 유전자 침묵 그룹의 서로 다른 색상으로 표시 됩니다 (그림 2-A3 및 그림 2-A.......

Discussion

최근, 혈관 생물학 연구의 여러 분야는 신생 endothelium¹⁵의 연구에 의해 자극 되었다. 이 문서에서는, 우리는 내 피 회전 타원 체의 소설 후보 분자 식별 하 조작 내 피 세포에서 기능의 VHL 유전자의 손실에서 유래 혈관 형성을 연구 하는 실험 모델 기법을 돋 아 개발에 신생 캐스케이드입니다. 우리의 지식 최선을이 endogenic 수정 된 내 피 세포의 신생 효과 검사 하는 첫 번째 보고서 이다.

(를 포함 하 여 종양 조직) 조직을 neovascularization 통해 신생 및 vasculogenic 메커니즘 두 생리 및 병 적인 조건^12,15 에서 뿐만 아니라 개발 하는 동안 발생 하는 복잡 한 과정은 ^{, 16}. 회전 타원 체 분석 결과.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인간 제대 정맥 내피 세포	푸단 IBS 세포 센터	FDCC-HXN180
dulbecco' s 변형된 독수리' S 미디엄	Gibco	11995040
소 태아 혈청	Gibco
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
패킹 플라스미드 psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-웰 플레이트	Ibidi	81501	젤 내의 기포는 &mu를 평형화함으로써 감소될 수 있습니다; – 사용 전 인큐베이터 내부에서 하룻밤 동안 혈관 형성 슬라이드 혈관 형성
보조제	Sciencell	#1052
10cm 배양 접시	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco 25200056
자동 세포 계수 시스템	생명공학
이미지 분석 소프트웨어	윈마시스		http://mywim.wimasis.com