방법 논문

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

DOI:

10.3791/57188

⸱

2018년 5월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

초록

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수지상 세포 (DC)는 이종 세포 인구에 그들의 세포 막 마커, 마이그레이션 패턴 및 유통, 그리고 그들의 프레 젠 테이 션 항 원에 T 세포 활성화 능력을 다른. 실험적 종양 모델의 대부분 예방 접종 필요 DC의 수백만, 그들은 널리 골 수 나 비장 으로부터 격리 됩니다. 그러나, 이러한 DC 크게 다 혈액과 종양 DC에 그들의 응답에서 면역성이 있는 복합물 (IC), 그리고 아마도 다른 lectin Syk 결합 수용 체. 중요 한 것은, 위험 관련 분자에 DC의 감도 감안할 때, 독 또는 crosslink 활성화 수용 체는 격리 중 하나는 항 체의 존재 수 DC의 못쓰게 되며 따라서 매개 변수를 영향을 하거나 적어도 복용량, 그들을 활성화 하는 데 필요한 따라서, 여기 우리가 그들의 조기 활성화를 피하고 있는 동안 혈액과 종양에서 MoDC를 고립 시키기를 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 프로토콜 종양 IC와 함께 MoDC 활성화 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.

서론

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그들의 발견부터 수지상 세포 (DC) T 세포 감 별 법1왜곡 그들의 독특한 능력으로 인해 광범위 한 연구의 초점을 했습니다. 지난 몇 년간 광범위 한 연구 노력 종양 진행과 면역 2동안 다양 한 DC 하위 집합 및 그들의 기능을 정의 하기 위해 노력해왔다. Dc는 그들의 패턴 인식 수용 체, 조직 배포에서에서 서로 다른 이기종 세포 인구 구성 및 철새와 항 원 프레 젠 테이 션 기능3,,45. 다른 DC 하위 집합에 비해 monocyte 파생 된 DC (MoDC) 종양에 훨씬 더 풍부 하 고 순환에서 쉽게 생성 될 수 또는 종양 침투 monocytes6,7. 따라서, 그들의 상대 보급을 활용 하고자 하는 많은 임상 실험은 T 세포 면역 8,9를 유도 하기 위해 헌 MoDC의 비보와 비보 전 조작 기반으....

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프로토콜

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프로토콜 아래 마우스 MoDC의 격리를 참조 하십시오 아직 전반적인 원리 다른 DC 하위 집합 셀에도 적용 될 수 있습니다. 12-16 주 된 C57Bl/6j 생쥐 실험 동물 관리 인증-공인 동물 시설에 대 한 미국 협회에서 유지 되었다. 모든 프로토콜은 스탠포드 대학 및-텔아비브 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 종양의 절연 관련 Monocyte 파생 된 DC

  1. 층 류 두건에서 CO2 안락사 마우스에서 종양을 제거 하 고 소 태아 혈 청 (FBS) 없이 RPMI 매체에 종양을 배치 합니다.
    참고: 그것은 좋습니다 쥐를 면도 하는 모피에서 잠재적인 오염을 최소화 하기 위해 종양을 제거 하기 전에 그들을 70% 에탄올 스프레이. 더 큰 종양 때문에 허약 하 고 세포 죽음을 받아야 하는 경향이 경향이 적은 DC 종양 25-40 m m2 를 초과 하지 않는 수 있습니다. DC의 큰 숫자는 필요한 경우 각 마우스는 여러 사이트에서 종양 세포 주입 수 있습니다.
  2. 후드 무 균 층 류, 수술이 위를 사용 하 여 작은 조각 (대략 1 x 1 m m2)으로 종양을 잘라.
    1. 30 mL 메 마른 플랫 바닥 관으로 자기 저 ....

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결과

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우리는 처음 종양 세포에 바인딩할 순 syngeneic 고 수용자 쥐에서 항 체의 용량 비교. 이 위해, B16F10 LMP 종양 세포 라인 paraformaldehyde에서 고정 되었고 광범위 하 게 씻어. B16F10 흑색 종 세포 선, C57Bl/6 마우스의 폐 전이에서 원래 고립 되었다 이다. LMP는 KrasG12D에서 고립 되었다 췌 장 종양 세포 / +, LSL-Trp53R172H / +, 그리고 Pdx-1-Cre 마우스 129F1 마우스에 꾸준히 성장 하 고. IC를, 종양 세포는 1 x 105 종양 세포 당 syngeneic 또는 수용자 IgG의 2 μ g으로 얼음에 20 분 동안 incubated 했다. IgG 및 IgM 항 체 순의 순환에서 고립 된 단백질 A, 크기 배제 크로마토그래피로 다음에 20-24 주 된 쥐 설명24. 셀에 씻어 했다 그리고 PE 활용 된 쥐 반대로 마우스 IgG .......

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토론

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마우스에 우 두를 접종에 필요한 DC의 많은 수를 감안할 때 (약 2-4 x 106 DC 한 마우스 당), 예방 접종 BM과 비장 뒤에 그들의 비보 전 활성화에서 DC의 격리를 기반으로하는 생쥐에서 전략의 대부분. 그러나, 종양 DC에서 vivo에서, 비장 및 BM DC 활성화에 대 한 동일한 조건을 사용 하 여 활성화, 자주 하지 효과적인 면역 생산에 성공 하려고 합니다. 두 후속 출판물, Carmi 외. 그 혈액과 종양 MoDC 크게 차이가 비장 및 BM DC에서 그들은 자연스럽 게 내장의 상부 티로신 인산 가수분해 효소를 부담 하 고 IC24,25활성화 전에 못쓰게 해야 하는 것을 발견 했다. 또한, 이러한 결과 더 스트레스 더 활성화 상태에서 DC를 유지 하기 위해 추가 조치를 취하에 대 한 필요성 그들의 생리 적 상태를 반영 합니다. 따라서, 현재 .......

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공개 사항

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모든 저자 그들은 충돌의 관심을가지고 그들은 공개 없다 선언 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep 단핵구 분리 키트StemCell Technologies19861
Collagenase IVSigmaC9697-50MG각 로트의 내독소 테스트
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86바이오레전105017
APC/Cy7-Ly-C6바이오레전드 108423
PE/Cy7-CD15바이오레전드 135523
endotoxin 대해 각 로트를 테스트합니다.드

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S.

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재인쇄 및 허가

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Monocyte derived Dendritic CellsImmune Complex ActivationTumor Cell IsolationBlood Cell IsolationMagnetic Bead SeparationDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisCD11b Cell SelectionCFSE labeled Tumor ComplexDendritic Cell Activation

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