빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

Summary

여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.

Abstract

간단한 순서 반복 (SSR) 식물과 동물 유전자 연구 및 분자 breeding 프로그램에서 사용 하는 가장 효과적인 마커 중 하나입니다. 실버 얼룩 polyacrylamide 젤에 SSR 마커 검출에 대 한 널리 사용 되는 방법입니다. 그러나, 실버 얼룩에 대 한 전통적인 프로토콜은 기술적으로 요구 하 고 시간이 많이 걸리는. 다른 많은 생물학 실험실 처럼 기법, 프로토콜을 얼룩이 지 실버는 검출 효율 향상을 위해 꾸준히 최적화 되었습니다. 여기, 우리 보고 단순화 된 실버 얼룩 메서드를 크게 시 약 비용 감지 해상도 사진 선명도 향상 시킵니다. 새로운 메서드는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 대 한 두 가지 주요 단계 (임신 및 개발) 및 3 개의 시 약 (실버 질산염, 수산화 나트륨, 그리고 포름알데히드), 그리고 처리의 불과 7 분을 필요합니다. 이전에 보고 된 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 쉽습니다, 빨리 그리고 SSR 탐지에 대 한 더 적은 화학 시 약을 사용 하 여. 따라서,이 간단 하 고, 낮은-비용, 고 효과적인 실버 프로토콜을 얼룩이 지는 유전 매핑 및 SSR 마커 데이터의 빠른 세대 번 식 마커 기반 도움이 됩니다.

Introduction

PCR 기반 마커의 개발 식물 유전학 및 번 식¹의 과학을 혁명을 했다. 간단한 순서 반복 (SSR) 마커는 가장 일반적으로 사용 되 고 가장 다재 다능 한 DNA 마커 중입니다. 그들의 게놈을 광범위 한 범위, 풍부, 게놈 특이성 및 반복성 heterozygous genotypes²의 검출에 대 한 그들의 codominant 상속 뿐만 아니라 SSR 마커의 장점 중 일부입니다. 여러 연구 결과 유전적 다양성 조사, 가계를 추적, 유전 결합 지도, 구성 및 경제적으로 중요 한 특성^3,4에 대 한 유전자 지도를 SSR 마커를 사용 했습니다.

SSR 마커의 PCR 제품 agarose 또는 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 및 다음 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 후 또는 UV 빛은 얼룩과 시각에 일반적으로 구분 됩니다. Polyacrylamide 젤에서 DNA 파편의 얼룩은 다른 착 색 방법^5,6 보다 더 민감한 이며 SSR....

Protocol

1. SSR 마커의 PCR 제품의 준비

1. 서식 파일 DNA를 포함 하 여 PCR 반응을 위한 모든 화학 제품 및 시 약 준비 (30 ng / µ L), 2 × PCR 마스터 믹스 (0.4 m m 각 dNTP, MgCl₂, Taq DNA 중 합 효소와 염료의 0.1 U / µ L의 3 m m의 2 × PCR 버퍼를 포함 하는), 각 10 µ M 앞으로 반전 뇌관 증 류 및 저온 (dH₂O).
   참고: 현재 연구에 사용 된 SSR 마커 했다 PT51333 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' 및 역방향 뇌관 순서: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3') 및 PT50903 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3'와 뇌관 순서를 반대로: AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3-5' ') 담배, 및 CX-43 (뇌관 순서 앞으로: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' 반전 뇌관 순서: 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3')와 CX-157 (뇌관 순서 앞으로: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' 뇌관 순서를 반대로: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3') 꽃 배 추에 대 한.
2. 템플....

Results

PCR amplicons 꽃 배 추와 담배에 해당 SSR 뇌관 쌍을 사용 하 여 생산 되었다. 전기 이동 법, 후 polyacrylamide 젤 SSR 마커 (그림 1)의 밴딩 패턴을 명확 하 게 감지 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 위의 실버를 사용 하 여 얼룩이 있었다.

프로토콜을 얼룩이 지는 다른 실버의 검색 효율성 비교를 SSR 마커 담배와 꽃 배 추에서의 PCR 제품 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 분리 했다 고 5 출판은 얼룩을 사용 하 여 시각화 프로토콜^9,11,12,,<.......

Discussion

임신 후 젤의 세척은 중요 한 단계 이다. 부족 세척 시간 및 물 볼륨 접시와 젤의 표면에 침 솔루션의 불완전 한 제거 발생 하 고 어두운 배경에서 발생할 수 있습니다. 적절 한 개발에 또 다른 핵심 단계 이다,-개발 DNA 파편의 낮은 콘트라스트 이미지와 함께 어두운 갈색 배경에서 발생할 수 있습니다. 또한, 임신 단계 DNA 파편의 착 효율을 크게 영향을 줍니다. 임신 시간 5 분 이상 확장 또는 증가 임신 솔루션에서 AgNO₃ 금액 개선 하지 않으면 크게 얼룩 품질, 비록 3 분 또는 AgNO₃ (양을 감소 시간는 임신을 감소 < 1 g) 회색 또는 얕은 검은 DNA 파편 귀 착될 수 있다.

효율적인 DNA 검출에 대 한 신속 하 고 쉽게 작업 방법 얼룩 실버 바람직합니다. 이 연구에서 개발 된 새로운 프로토콜 방지 해결, 중지 및 몇 가지 세척 단계 다른 프로토콜^6,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR 마스터 믹스 (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, 중국	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, 미국	#170-8200
DL500 DNA 마커	Takara Bio Inc., 일본	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou 화학 시약 공장, 중국	#6381-92-6
아크릴아미드	Sangon Biotech 상하이, 중국	#79-06-1
N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드	Sangon Biotech 상하이, 중국	#110-26-9
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민	Sangon Biotech 상하이, 중국	#110-18-9
과황산 암모늄	광저우 화학 시약 공장, 중국	#7727-54-0
바인드 실란	Solarbio 베이징, 중국	#B8150
AgNO3	Sinopharm 화학 시약 베이징 유한 공사, 중국	#7761-88-8
포름 알데히드	톈진 DaMao 화학 시약 공장, 중국	#50-00-0
NaOH	광저우 화학 시약 공장, 중국	#1310-73-2
아세트산	광저우 화학 시약 공장, 중국	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao 화학 시약 공장, 중국	#497-19-8
에탄올	광저우 화학 시약 공장, 중국	#64-17-5
HNO< sub>3	Guangzhou 화학 시약 공장, 중국	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm 화학 시약 Beijing Co., Ltd, 중국	#10102-17-7
에리오크롬 블랙 T(EBT)	톈진 DaMao 화학 시약 공장, 중국	#1787-61-7
플라스틱 트레이	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,	China-TS-1
Shaker	Qilinbeter JiangSu,	China-BenQ
M800 스캐너	BenQ, 중국	-
DYY-6C 전원 공급 장치	Beijing Liuyi Instrument Factory,	China-High
throughout vertical gel systems, JY-SCZF	베이징 Tunyi 전기 영동 Co., 주식 회사, 중국	-