수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

요약

이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

초록

큰 동물 (가축과 야생 동물) 동물 매개 병원 체, 세라, 진 균 bovis, 살 모 넬 라, 대장균, 등의 중요 한 공기 통으로 봉사 하 고 pathogenesis의 연구에 대 한 유용 및 자연 호스트에서 박테리아의 확산입니다. 호스트 면역 반응에서 림프절의 핵심 기능으로, 림프절 조직 역할을 다운스트림 transcriptomic 분석에 대 한 RNA의 감염의 과정을 통해 세포에 유전자 발현의 시간적 변화를 평가 합니다. 이 문서는 림프 노드 컬렉션, 조직 샘플링 및 다운스트림 RNA 아메리카 들소 (비 손 비 손에서에서 제공 하는 추가 예제와 함께 모델로, 가축 (보스 토 러 스)를 사용 하 여 가축, 처리 과정의 개요를 선물 한다 ). 프로토콜 시체의 위치, 식별 및 여러 주요 사이트에서 림프절의 제거에 대 한 정보를 포함합니다. 또한, 생 검 샘플링 방법론 여러 동물에서 샘플링의 일관성에 대 한 수 있도록 제공 됩니다. 샘플 보존에 대 한 몇 가지 고려 사항, RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 같은 다운스트림 방법론에 대 한 적합 한 RNA의 생성을 포함 하 여 설명 합니다. 큰 동물 대 마우스 시간 과정 연구에 내재 된 긴 지연으로 인해 들소와 소 림프절 조직에서 대표적인 결과의 검토의 맥락에서이 조직 유형에 저하의 시간 과정을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 다른 조직에서 RNA 저하에 이전 방법론 작동 합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 유용 두 수의 연구에 큰 동물 샘플 transcriptome 프로젝트를 시작 하 고 분자 생물학 조직 샘플링 vivo에서 그리고 생체 외에서 처리 기법을 학습에 관심이 있을 것입니다.

서론

림프절의 transcriptome의 RNA 시퀀싱 분석 병원 체의 다양 한 동물의 면역 반응을 하 기회를 제공 한다. 이 방법론은 생쥐에서 광범위 하 게 이용 되어, 하는 동안 분석은 최근 큰 포유류^1,2로 확대 되었습니다. 가축 또는 큰 동물 림프 노드 호스트 감염 뿐만 아니라 백신 또는 유전 자화 율 연구에 그들의 사용을 위해 그리고 인간 연구에 대 한 모델 시스템으로 서 뿐만 아니라 신약 개발에 대 한 대상의 식별에 대 한 응답 특성을 사용할 수 있습니다. 동물 매개 질병에. 예를 들어 brucellosis (동물 매개 세균성 질병 그 영향은 절반 백만 사람들이 전 세계 매년), 경우에 크게 증가 비용, 연구 양에서 또는 염소는 더 인간 감염 및 인간 백신 관련 실험실 동물 모델 보다 개발입니다. 마우스 감염 모델 정리 reticuloendothelial 시스템 감염 하지만 하지는 특징적인 임상 증상³_.

실험실 동물 연구에 비해 큰 동물 실험에서 조직의 반드시 수확 과정 포함는 안락사의 보존에 대 한 잠재적인 도전을 선물 한다 조직 컬렉션 사이 긴 지연 높은-품질 한 RNA 그대로 RNA 생물학 관련 transcriptomic 데이터의 생성을 위해 필수적 이다. 조직 샘플에서 높은-품질 RNA의 생성은 특히 큰 동물 병원 체 연구에 대 한 중요 한 실시 제약 시설에서. 이러한 연구는 본질적으로 더 그들은 뿐만 아니라 시설 승인 및 고도로 훈련 직원 필요 하지만 상당한 금융 비용을 작업에 따라 수백 수천 달러의 수만에서 배열할 수 있다 수행를 수행 하기 어렵다. 이러한 유형의 연구는 또한 크로스-징계 협업 및 그들의 복잡성을 추가 하는 그들의 완성에 대 한 크로스-징계 지식을 포함 한다. 따라서,에 대 한 교육, 개발, 샘플 수집 및 보존에 대 한 효율적인된 시스템을 준수 하는 이득을 제공 한다 중요 한 조직의 다운스트림 분자 연구에 대 한 감염 된 동물에서.

큰 림프 노드의 컬렉션 murine 림프절의 유사한 샘플링에 비해 조직 컬렉션에 대 한 추가적인 도전을 선물 한다. 샘플 절단에 대 한 준비 관련 내부 구조를 포함 한 림프절의 해부학에 대 한 기본적인 이해를 필요로 합니다. 림프 노드의 구조는 림프 lobules sinuses 림프로 가득 둘러싸인 구성 됩니다. 이러한 구조는 거친, 섬유질 캡슐 포함. ⁴ 림프 lobule "기본 해 부와 기능적인 단위 림프 노드의" 이며 낭, 깊은 외피 단위 및 골 수 코드와 sinuses⁴ (그림 1A)로 구성 됩니다. B와 T 세포는 각각 낭과 깊은 외피 단위에 가정. 이러한 구조 3D 비 계를 제공 하 고 있는 림프 톨 항 원 또는 항 원 제시 세포 사이 상호 작용 촉진.

조잡 한, 낭과 깊은 대뇌 피 질의 단위 확인할 수 있습니다 잘라 표면에 그들은 빽으로 채널을 포함 하 고 보다 더 섬세 한 망상 채널의 구성 되어 나타나고 라이터는 sinuses 표시 (그림 1B). 규칙에 따라 병리학 표면 피 질 (낭), paracortex (깊은 외피 단위)와 골 수 (골 수 코드와 sinuses) 림프절의 영역을 참조 하십시오. 모든 3 개의 영역의 적절 한 시험 간주 되었습니다 최고로 림프절⁵에 대 한 일상적인 병 적인 시험 지침에 연습. 참고 일관성, 크기, 및 단일 동물 내 에서도 림프절의 색상에 상당한 변이가 있다. 동물 나이, 그들의 림프절 크기 감소와 젊은 동물의 그들 보다는 더 확고 한 되, 일반적으로 그들의 결합 조직 및 림프 정상의 감소에서 증가로 인해^6,7을 구조 하는 경향이 됩니다.

그림 1. 림프절의 해부학. (A)이 만화 이미지 표시, 림프절의 해부학 키 구조를 묘사. (B)이 여전히이 이미지 횡단면으로 잘라 소 림프 노드를 보여 줍니다. 육안으로 볼 수 있습니다 관련 구조/레이어 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

실험적인 질문에 따라 다른 림프절 수집 및 분석에 대 한 관심이 될 것입니다. 주변 림프절은 피하 조직에 깊이 있는. 가축, 주변 또는 표면 림프절 임상 및 실험 연습에서 자주 사용 한다 포함 귀 밑, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural)와 표면 사 타 구니 (supramammary 여성, 남성에서 음 낭에서) ( 그림 2)입니다. 표 1주요 표면 림프절의 속성 가축 시스템⁸에 설명 된 대로 설명 되어 있습니다. 아래 소의 세균성 전염병에 대 한 몇 가지 잠재적인 림프 노드 컬렉션 계획 조사에 대 한 시작 지점으로 제공 됩니다.

세라 abortus/세라 melitensis: 표준을 B. abortus위한 necropsies-가축 및 B. melitensis감염-감염 된 염소 국립 동물 질병 센터에서 supramammary, prescapular, 및 선 림프절 조직 복구 모두 호스트 RNA 식 프로 파일링에 대 한 RNA 준비를 위한 세균성 열거형에 대 한 분쇄. B. abortus 정기적으로 실험적으로 감염 된 가축⁹_. 에 이러한 림프절의 각 재기 될 수 있다 B. melitensis에 이러한 림프 노드 형식 각각에 있는 박테리아의 존재를 검출 될 수 있다-우리의 연구 (Boggiatto 그 외 여러분, 미 출판)에서 RNA 기반 방법론을 사용 하 여 감염 된 후 적어도 9 개월까지 염소를 감염. 살 모 넬 라 sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), 그리고 mesenteric 림프절 살 모 넬 라 보급^10,,1112 에 대 한 가축 시체를 프로 파일링 하는 동안 유용 하 게 되었습니다, transcriptomic 연구에 대 한 잠재적인 관심의 것입니다. E. 콜라이 O157:H7: (중간 소장 원심 소장 위치에서) Mesenteric 림프절 박테리아 감염 된 송아지 (에 감염 된 성인 가축)¹³의 가끔 회복의 사이트 수 있습니다. 렙 (Leptospira sp.): 박테리아의 만성 지 속성 유선¹⁴배출 림프절에서 관찰 되었습니다. 진 균 bovis : 가축, 박테리아 종 아리¹⁵의 mediastinal 및 tracheobronchial 림프절에서 복구 된 후 실험 감염 되었습니다. 또한, 림프절 RNA 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스²등 큰 동물 호스트 응답을 검사 하 이용 되어 있다. 그림 2 는 가축 시체에서 이러한 주요 림프절의 하위 집합의 위치를 보여 줍니다.

그림 2: 선택 된 림프 노드 위치를 묘사 하는 만화 보스 토 러 스 . 번호가 매겨진된 림프절은 주석 처리 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 문서와 관련 된 비디오, 선물이 큰 동물 감염의 transcriptomic 연구에 관련 된 분자 생물학에 대 한 유익 하도록 설계 된 RNA 연구에 대 한 큰 동물 림프절의 격리에 대 한 프로토콜. 먼저, 우리 제공 격리 절차의 개요, 림프절에 대 한 예제로 소과 들소 조직에서 샘플링을 사용 하 여. 와 결합 하 여이 데모 비디오에 표시 된 대로, RNA 격리에 대 한 재현 조직 샘플링에 대 한 워크플로우가 이다. 다음, 우리는 감염 된 림프절, 안전, 일관성, 그리고 RNA 품질에 초점을 맞춘의 처리에 대 한 중요 한 고려 사항을 설명합니다.

산성화 페 놀 guanidine isothiocyanate 시와 조직에서 RNA의 준비 Chomczynski 및 Sacchi^16,17, 실리 카 기반 스핀 열의 존재에 대해 정화의 원래 방법에 따라 Vogelstein 길¹⁸의 원래의 작품에 따라 chaotropic 대리인. 우리는 또한 transcriptomics에 대 한 대체 방법으로 보존 하는 가축 림프절에서 RNA의 복구에 대 한 가능성을 검사 합니다. 마지막으로, 우리는 안락사와 들소에서 복구 된 RNA 프로 파일에 샘플링 사이의 시간 증가의 효과 묘사 하는 대표적인 실험을 포함 하 여 큰 동물 necropsies에서 RNA 품질에 시간 변수의 영향을 탐구 하 고 소 림프 노드입니다. 이 문서 뿐만 아니라 분자 생물학 하지만 transcriptomic 연구를 개시 하는 또한 하 수의 연구자에 유용할 것 이다.

프로토콜

여기에 묘사 된 동물 검 시 절차 국립 동물 질병 센터, Ames, 아이오와에 승인된 IACUC 프로토콜 적용 모든 실험 동물 보호 및 복지에 대 한 승인 된 지침에 따라 실시 했다.

1. 미리 검 시 전에 계획

1. 전에 검 시 검 시 스위트 전송에 대 한 다음 자료 준비:
   1. 1.5 또는 2 mL microcentrifuge 튜브 가득 ~ 1.0 mL 랙 또는 수송 컨테이너에 RNA 보존 솔루션의. 조직의 볼륨을 보존 솔루션의 볼륨의 비율에 대 한 제조업체의 지침에 따라 해야 합니다.
   2. 일회용 scalpels와 깨끗 한, 압력가 마로 소독 집게: 피부와 림프절 (한 동물 당 각 림프절), 수집 하기 위한 다른 세트를 해 부에 대 한 설정 하나 피부와 림프 노드 환경 식물의 교차 오염을 방지 조직입니다.
   3. 3 m m 사용된 scalpels와 생 검 도구 및 절단 보드와 sharps 컨테이너 또는 림프절 절 개에 사용 하기 위해 일회용 쟁반 생 검 도구, 검 시 칼을 펀치.
   4. PPE는 시스템에 대 한 적절 한 BSL 수준 작업에 필요한을 포함 한 개인 보호 장비를 사용 합니다.
   5. 압력솥 재사용 가능한 금속 도구, 설정 기구/드라이 제품을 사용 하 여 검 시 전에 금속 팬에 집게를 포함 하 여.

2. 식별 및 가축과 들소에서 림프절의 샘플링

그림 3 . 소 머리와 목의 림프절. (A)이 만화 이미지 쇼 선택한 림프 노드 머리와 보스 토 러 스의 목의. (B)이이 이미지는 단면 (오른쪽)에 단면 (왼쪽)에 비해 선 침 샘에에서 선 림프 노드를 보여 줍니다. 두 조직 종류 텍스처 차이 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1. 가축과 들소 prescapular 림프절의 절연
   1. 현지 IACUC 프로토콜에 따라 동물 (가축 또는 모든 나이의 실험에 대 한 적절 한 들소) 안락사 특히 심장 박동, 호흡, 부족 부족과 각 막 반사의 부재를 포함 하 여 기관 IACUC 프로토콜에서 설명 하는 방법으로 죽음을 확인 합니다. 검 시 바닥에 동물을 이동 합니다.
      참고: 큰 동물의 실험실 연습에 사용 하는 자비 롭 안락사의 다양 한 방법이 있습니다. 그러나, pentobarbital 나트륨과 phenytoin 나트륨 솔루션의 정 맥 행정은 가장 일반적으로 승인 하 고 활용 하는 형태. 동물의 안락사에 AVMA 지침을 문의 하십시오. ¹⁹
      주의: 펑크-증거 컨테이너와 재사용 가능한 금속 칼 및 집게 정화 sharps의 안전한 처리에 대 한 지침을 포함 하 여 호스트 기관에 검 시에 대 한 모든 관련 biosafety 프로토콜을 따르십시오. 이 프로토콜은 일회용 scalpels의 사용에서 sharps 낭비를 생성합니다. 부츠, 작업복, 장갑, 눈 보호를 포함 하 여 기관 지침에 의해 규정 개인 보호 장비를 착용 하십시오.
   2. 3 참가자는 동물의 조직에서 작동을 식별 합니다.
      참고: 여기, 것 1 것입니다 수는 대규모 담당 단면 원하는 동물의 조직의 것 2 다른 동물 섹션에서 림프절을 복구할 것 이다, 것 3 각 림프절에서 섹션을 별도 테이블에 작동 하 고 방부 제 솔루션 튜브에 그들을 전송.
   3. 측면 recumbency에 동물을 배치 하 여 시작 합니다.
   4. 어깨 무릎 (손목);의 수준에서 앞 다리를 다시 이동 하 여 확장 이 모션 다시 어깨를가지고 하 고는 림프절의 쉽게 촉진에 대 한 허용 합니다. 림프 노드 "덩어리"의 존재에 대 한 느낌.
      참고: 질병 상태, lymphadenopathy 존재할 수 있습니다, 쉽게 림프절의 식별, 하지만이 과정 또한 영향을 미칠 수 일관성, 구성, 및 림프 노드 아키텍처.
   5. 일단, 그리고 여전히 확장 어깨, 어깨의 윤곽선을 따라 피부 절 개를 만들기 위해 메스 또는 검 시 칼을 사용 합니다.
      참고: 림프 노드 위치 를 통해 촉진 되었습니다 경우에 절 개의 크기를 제한 하지 않습니다. 더 큰 절 개 깊은 조직에 쉽게 액세스를 제공 하 고 쉽게는 림프절의 절제는 것.
   6. 집게의 쌍을 사용 하 여, 어깨의 포인트를 공개와 목 근육을 피부 철회.
      참고: prescapular 림프 노드는 overconditioned 동물에 (서) 특히 피하 지방에서 자주 발견 된다.
   7. (그림 3A) 림프절의 위치를 다시 한번 만져.
      참고: 달리 피하 지방, 림프 노드 모양을 palpated 때를 개최 한다. 또한, 그들은 얇은 섬유 캡슐을 둘러싸인으로 림프절 어떤 주변 조직으로 인접 하지 않습니다.
   8. Prescapular 림프 노드를 찾는 후 신중 하 게 피하 지방, 메스와 집게를 사용 하 여 밖으로 해 부하 고 림프 노드를 분리.
      1. 같이 그림 1B, 림프절 및 지방 조직; 사이 구별 하는 얇은 섬유질 캡슐의 존재에 대 한 보고 림프절은 어떤 주변 조직으로 연속.
   9. 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 림프 노드를 전송.
      참고: bison에 이러한 림프절의 모양이 비슷합니다. 관련된 비디오는 아메리카 들소의 오른쪽 어깨에서 해 부로 prescapular 림프절의 모양을 보여 줍니다.
2. 가축과 들소에 선 림프절의 절연
   1. 검 시 바닥에 측면 recumbency에 동물을 배치 하 여 시작 합니다. 턱 관절을 (TMJ)를 찾습니다.
      1. 이 찾을 어려운 경우는 mandible를 천천히 이동 하 고는 mandible 두개골;을 연결 하는 위치를 결정 이것은 TMJ 이다.
   2. 신중 하 게 메스 또는 검 시 칼을 사용 하 여, 피부에 절 개를 확인 합니다. 공동으로 지 절 개를 시작 하 고 그것 ventrally/수직으로 연장 jawline 따라.
   3. 피하 조직을 떨어져 피부를 해 부. 선 침 샘 표시 됩니다 처음, 그것의 큰 크기, lobulated 표면 외관, 및 빨간 채색 때문.
   4. 사용 하 여 집게와 메스, 선 침 샘을 이동 제쳐두고 그냥 두개골 및 침 샘 (그림 3A)에 중간 앉아 선 림프 노드를 찾을. 추가 처리 전에 텍스처에 대 한 선 림프절 조직을 검사 합니다.
      참고: (선, submandibular) 얼굴의 림프절은 림프 노드 격리를 혼동 수 있습니다 침 샘, 연관. 비해 림프절, 침 샘 훨씬 더 큰 이며 lobulated 표면 모습. 또한, 절단된 표면에 침 샘 자연에 균질 이며 림프절 (그림 3B)의 고전적인 대뇌 피 질과 골 수 건축 패턴을 전시 하지 않습니다.
   5. 메스와 선을 삭제하시오 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 그것을 전송.
3. Supramammary 림프절 여성 가축과 들소의 격리
   1. 측면 recumbency에 동물을 배치 합니다.
   2. 사 타 구니 영역을 노출 하 고 젖 통을 찾아 뒷 다리를 상승 합니다.
      참고: 건강 하 고, 젖을 비 동물에서 이러한 림프절의 촉진 하지 가능. 젖이 동물에서 이러한 림프절 젖 통의 기지의 꼬리 테두리에 만져 서 있을 수 있습니다.
   3. 메스를 사용 하 게 절 개 단지 등 위쪽 다리 노출 supramammary 동맥을 따라 젖 통.
   4. 피하 조직 해 부 고 피하 지방에의 얇은 계층에 포함 된 supramammary 림프 노드. 시각적으로 구별할 수, 경우 피하 지방 내에서 확고 한 구조의 존재에 대 한 노출된 조직 만져.
   5. 포 셉, 메스 using, 신중 하 게 지방에서 림프 노드 밖으로 해 부. 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 그것을 전송.

3. 단면 및 림프절의 저장

1. 주 검 시 공간에 인접 한 해 부 테이블에 3 dissector에 것 2에서에서 격리 된 림프절을 전달 합니다. 마의 신선한 섹션에 각 림프 노드를 배치 합니다. 미리 림프 노드를 연속적으로 여러 개의 림프절의 영수증을 촉진 하 여 절단 보드 섹션에 레이블을 지정 합니다. 감염 샘플에 대 한 일회용 트레이 사용 합니다.
2. 집게와 일회용 메스 또는 검 시 칼을 사용 하면, 림프 노드의 섹션 제거할. 날카로운 칼을 사용 하 여 림프 노드를 열어 화살 컷을 확인 합니다.
3. 특히 감염 된 동물 표본에서에서 림프절의 내부 검사, 비대칭을 찾고, 병 변, 색상 차이, 등 기록 관측.
4. (옵션 1) 작은 조직 단면도
   1. 일회용 scalpels를 사용 하 여 삭제할 두께에서 5 m m 미만 하 고 깨끗 한 집게와 RNA 보존 솔루션 튜브 각 조각을 전송 각 림프절의 조각.
5. (옵션 2) 림프절 생 검 또는 단면 방법론
   참고: 생 검 또는 단면 방법론, 다른 노드 및 동물, 병렬 림프 노드 섹션에 적용 하는 경우 대량 RNA 분석을 위한 샘플링 조직의 일관성을 제공 합니다.
   1. 웨지 단면 메서드
      1. 후 세포 림프 노드의 프로필 전체를 삭제할 외부 캡슐에 센터에서 림프절에서 파이 모양 쐐기를 화살 섹션 검토. 노드 2 cm 폭 (표준 크기; 표 1참조), 쐐기 외부 아크 길이 4 m m 센터에 자르고 5mm 두께에서 젖은 무게 해야한다 ~ 100mg.
      2. 메스를 사용 하 여, 작은 조각, 5 밀리미터, 그리고 약 50-100 mg 각 젖은 조직 무게에서 보다 두꺼운 쐐기 잘라.
         참고: 일관성을 위해 모든 웨지 조각 또는 별도 튜브에 하나의 일괄 처리에서 다음 RNA 풀링 관심의 림프절에서 대표적인 RNA 프로 파일을 제공 하는 단일 림프절에서 처리 합니다.
      3. 조직의 볼륨에 비해 RNA 보존 솔루션의 적어도 10 볼륨 포함 된 튜브에 집게와 조직 조각을 놓습니다.
   2. 펀치 생 검 방법
      1. 목표는 노드에서 특정 낭 등 특정 섹션을 수집 하는 경우 펀치 생 검 도구를 선택 합니다. 컬렉션에 대 한 원하는 샘플의 크기와 일치 하는 도구를 선택 합니다. 펀치 생 검 도구 직경 8 m m 1에서 크기의 범위에서 사용할 수 있습니다.
      2. 시각적으로 림프절에 샘플에 대 한 관심의 영역을 찾습니다.
      3. 펀치 생 검 도구를 사용 하 여 관심, 누르고 도구를 만드는 핵심 조직으로 선회의 섹션을 삭제할. 집게와 RNA 보존 솔루션의 적어도 10의 볼륨을 포함 하는 관 조직 조각을 전송. 5 m m 보다 두꺼운 경우 추가 조직 더 작은 조각으로 분할 하 포 셉, 메스를 사용 합니다.
6. 일단 샘플 보존 솔루션에 전송 (예., RNALater), 실 온에서 실험실 등을 맞댄 그들을 수송.
7. 4 ° C 하룻밤 조직 침투 수 있도록에서 샘플을 저장 합니다.
8. 다음 날, 과잉 RNA 방부 제 솔루션을 부 어 고-80 ° c.에서 조직 샘플을 저장 샘플을 동결 하기 전에 가능한 많은 방부 제를 제거 합니다. P1000 / P200 micropipette 팁을 사용 하 여 효율적인 RNA 방부 제 솔루션 제거를 위한.
   주의: 폐기 decanted 보존 솔루션 적절 하 게, 안전 데이터 시트에 지정 된 대로 방부 제 솔루션의 화학 및 환경 위험 뿐만 아니라 활용 하는 병원 체의 감염 속성에 따라.
   참고: 여기에 제공 된 지침 자료의 테이블에서에서 설명 하는 RNA 보존 솔루션에 대 한 제공 됩니다. 대체 보존 솔루션을 사용 하는 경우 제조업체의 지침을 참조 하십시오.

4. RNA 림프절에서 처리

주의: 실험실 외 투, 장갑, 그리고 처리 단계에 대 한 적절 한 눈 보호를 착용 하십시오.

참고: 여기에 사용 되는 페 놀 기반 시 약 재료의 테이블에서 에서 설명 하는 (그리고 프로토콜 제조업체의 지침에 따라)²⁰. 다른 페 놀 기반 시 약의 사용에는 구입한 특정 제품에 대 한 제조업체의 권장 사항에 따라 절차의 수정 할 거 수 있습니다.

1. 샘플, 사전 약 균질 튜브 (1.5 mL/튜브), 냉장된 (4 ° C) 페 놀 기반 시 약 수에 액세스 하기 전에 피 펫을 사용 하 여.
   주의: 페 놀은 독성, 부식성, 및 건강 위험. 클로 프롬은 독성과 건강 위험. 화학 증기 두건 4.1 4.9 처리 단계를 완료 하 고 화학 물질과 접촉을 방지 하기 위해 장갑을 착용. 미국에서는, 클로 프롬은 위험한 폐기물; 튜브를 포함 하는 지역 및 기관 지침에 따라 유해 폐기물의 처분. 프로세스 조직 샘플 해당 BSL-2, BSL-3, 또는 BSL-4 지침 아래 병원 체 감염 동물에서.
2. 일단 샘플 깨끗 한 집게와 microcentrifuge 튜브에서 느슨하게 될 수 있습니다, 즉시 페 놀 기반 시 약을 포함 하는 균질 튜브 보존된 조직의 약 50-100 mg 전송.
   1. 페 놀 기반 시 약을 추가 하기 전에 녹고 제한 합니다. 드라이 아이스에 스토리지를 사용 하 여 여러 샘플 처리에 대 한 냉동 고에서 제거 됩니다 때.
3. 단단히 튜브 캡, 균질 화기에 배치 하 고 페 놀 기반 시 약에서 회전자-stator 조직 균질 화기와 샘플을 균질. 실 온에서 처리를 완료 합니다. 언제 완료, 검사 샘플은 성공적으로 무 균; 되도록 흐린 외관에 대 한 조직 흐린 현 탁 액에 분산 한다.
   참고: 2 분 RNA 추출 설정이 사용 됩니다 (는 균질 화기에 대 한 사전 설정된 RNA_02_1 설정 테이블의 자료에서 설명, 냉동된 조직에 대 한 설계). 이 프로토콜에 지정 된 회전자 고정자 (참조 테이블의 자료) 이며 큰 이빨 균질 섬유 소재를 포함 하 여 조직 유형의 범위에 대 한 적응. RNA_02_01 설정은 설계 구체적으로 (반대로 신선한) 냉동 조직. 림프절 섬유질 결합 조직 구성으로, 마찬가지로 최적화 된 회전자-stator 균질 화기는 효과적인 분리를 달성 하기 것이 좋습니다. 국립 연구소의 환경 건강 과학²¹ 균질 권장 사항에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오.
   1. 직물의 큰 덩어리는 균질 후 유지, 균질 절차를 반복 합니다. 효율적으로 RNA를 복구, 조직 해야 합니다 수 잘 해리 했다.
   2. 더 섬유 림프 노드 조각에 대 한 사전 림프 노드 조각 균질 튜브를 전송 전에 여러 작은 조각으로 잘라 집게와가 위를 사용 합니다. 소개에 설명 된 대로 더 오래 된 동물에서 림프절 조직 섬유 더 있을 수 있습니다.
      참고: 호스트와 병원 체 RNA의 이중 분석을 원하는 경우 (예: 구슬 균질) 추가 치료 필요할 수 있습니다 세균 RNA의 복구에 대 한 그람 양성 균은 조직에 존재 하는 경우에 특히.
4. 즉시 무 균된 샘플 튜브에서 제거 하 고 RNase 무료 microcentrifuge (2.0 mL 크기에서)와 함께 튜브 P1000 micropipette 전송.
5. 어떤 샘플 파편 든 지 제거 하 4 ° C에서 12000 x g에 5 분에 대 한 샘플 원심 P1000 micropipette 팁을 사용 하는 펠 릿을 남겨두고 신선한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.
6. 실 온에서 5 분 동안 상쾌한 품 어. 두 개의 1.5 microcentrifuge 튜브 사이의 각 샘플 분할.
7. 페 놀 기반 시 약 (즉, 1.5 mL 샘플 0.3 mL);의 1 mL 당 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 혼합 단계, 하지만 하지 소용돌이 샘플 1-2 분이 손으로 반전. 실 온에서 2 분 동안 그것을 품 어.
8. 4 ° c.에 12000 x g에서 15 분 동안 원심
9. 조심 스럽게 제거는 interphase 또는 빨간색 페 놀-클로 프롬 레이어를 방해 하지 않고 상위 계층을 형성 하는 micropipette 팁 P1000 (P200) 위, 명확한 수성 단계. 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
10. 100% 에탄올;의 동등한 양으로 혼합 반전 튜브 4-5 배 하 여 철저 하 게 믹스. 튜브는 흐린 자주 표시 됩니다.
11. Micropipette 팁을 더 정화 하 고 RNA, 다음 제조 업체의 지침²²elute 상업 스핀 실리 카 기반 열에 액체를 전송. 생성 된 RNA elute ~ 50mg RNase 무료 물 50-100 µ l로 조직.
    참고: 페 놀 기반 시 약 추출 qRT-PCR 그리고/또한 RNA 시퀀싱 응용 프로그램에 RNA의 다운스트림 사용을 위해 유기 단계에서 DNA를 제거 하는 동안 DNase RNA 샘플의 추가 치료를 것이 좋습니다.
12. 약 수를 줄이기 위해 어떤 동결 해빙 주요 RNA 샘플의 정량화 및 품질 평가에 사용 하기 위해 튜브를 분리 하는 eluted RNA. 저장용-80 ° C에 튜브를 전송 합니다.
13. 샘플 낮은 biosafety 수준 포함 영역으로 이동 됩니다 병원 체의 부재에 대 한 결과 RNA 샘플 확인 림프절 샘플 BSL-3 견제 수준에서 특히 zoonotic 병원 체 감염 동물에서 파생 된 경우 품질 분석, RT-PCR 및 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비
    참고: 그것은 중요 한 현지 규정을 고려 하 고 CDC (질병 통제 예방 센터) 비활성화 선택 에이전트와 작업에 대 한 지침, 경우 그것은 연구자의 로컬 사이트에 모든 비활성화 절차의 유효성을 검사 하는 데 필요한.
    1. 1/10^번째 볼륨 단계 4.12에서에서 각 eluted RNA 샘플의 (즉, 총 RNA의 50 µ l에서 5 µ l)를 제거 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여, 샘플 100 µ l 세균성 성장 국물 멸 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서의 혼합. 살 균 플라스틱 분산기를 사용 하 여 한 천 배지 표면 RNA 국물 혼합 분산.
       참고: 국물 종류와 한 접시는 동물 도전 하는 병원 체의 성장을 일치를 선택 합니다.
    2. 병원 체는 동물도 전했다의 성장에 특정 조건 하에서 한 천 배지를 품 어. BSL-3 봉쇄에서 샘플을 제거 하기 전에 복구 된 박테리아의 부재를 확인 합니다.
       참고: 결과 eluted RNA, 정량화 및 무결성, 테스트 후는 RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을 포함 하 여 다운스트림 응용 프로그램에 적합.
14. RNA 복구 및 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 평가 합니다. RNA 품질을 평가 하는 분석을 위한 분 광 광도 계에 eluted RNA 샘플의 1-2 µ l을 로드 합니다. 자외선 (UV) 범위에 샘플의 스펙트럼을 기록 합니다.
    1. UV 스펙트럼에서 A₂₆₀/A₂₈₀ 비율, A₂₆₀/A₂₃₀ 비율, 그리고 샘플 A₂₆₀ 값 기록 (A = 흡 광도).
    2. 40 µ g/mL의 농도에서 단일 가닥 RNA 260에서 1.0의 흡 광도 nm A₂₆₀ x 40 정화 샘플을 곱하여 RNA 농도 (µ g/mL)을 계산.
15. RNA 무결성의 평가의 빠른 방법으로 어떤 저하 샘플 추가 분석에서 제외, 혼합 각 RNA 샘플의 2 µ l과 1.5 x formamide 로드 염료 [95% 이온된 formamide, 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol, 5 mM EDTA (pH 4 µ l 8.0), 0.025% (w/v) SDS] 1.5 ml에서 microcentrifuge^23,24튜브.
16. 1 분에 70 ° C에서 튜브가 열 하 고 1 분 동안 얼음에 튜브를 전송.
17. 1에서 준비 1 %agarose 젤에 샘플 로드 x TBE (RNA에 대 한 네이티브 agarose 젤 전기 이동 법의 전체 설명에 대 한 리오, Ares 주니어, Hannon, 및 참조 Nilsen)²⁴. 표준 젤 전기 이동 법 방법으로 샘플 고 28S와 18S 리보솜 RNA 밴드의 존재를 확인 합니다.
18. 젤 전기 이동 법 [예를 들어, Bioanalyzer 및 린 (RNA 무결성 번호) 분석] RNA 무결성 확인에 대 한 정량 분석 방법 대표 결과 뮬러, O. 에에서 설명 된 대로 따라 외. ²⁵ 와 슈뢰더, A. 외. ²⁶.

5. 대체 추출 방법에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직

참고: FFPE 직물 보존 팬 들은 핵 산 보존의 가장 강력한 방법의 정보를 대표 하지 않는다, 하지만 아래 제시 하는 프로토콜 수 다른 보존된 조직에 사용할 수 없는 경우 일부 transcriptional 변화를 공부 하는 방법을.

1. 플라스틱 용기에 포 르 말린을 분배 하 여 조직 보존을 위한 포 르 말린 시 약을 준비 합니다. 조직 말린 포 르 말린: 조직 볼륨/무게 20: 1의 비율에 각각 유지 한다.
   주의: 말린 알려진된 인간 발암 물질 이며 비록 심하게 독성, (일반적으로 흡입된 가스)를 통해 만성 노출 중요 한 건강 위험을 나타낼 수 있습니다. 적절 한 환기 및 PPE (즉, 니트 릴 장갑, 초기 노출 후 15 분 이내에 변경할 수 사용) 건강 위험을 최소화 하기 위해 필요 합니다. OSHA 포름알데히드 표준 참조 (29 CFR 1910.1048) 노출 모니터링 및 위험 평가 대 한 자세한 내용은.
   참고: 너무 작은 포 르 말린을 사용 하 여 방부에 빠져들 때 완벽 하 게 보존 되는 조직 수에 영향을 수 있습니다.
2. 관심의 조직 분리 후 신중 하 게 두께에서 5mm 미만 조직을 정돈 한다.
   1. 트림 된 조직 어떤 splashing을 최소화 하기 위해 포 르 말린으로 잠수함 신중 하 게 집게를 사용 하 여.
      참고: 조직 해야 합니다 수 완전히 침수 말린 완전 한 고정에 대 한 허용에. 그것은 중요 한 조직의 모든 서피스는 완전히 말린 덮여입니다.
3. 일단 조직 포 르 말린에 빠져들 되었습니다가지고, 실 온에서 24 시간 이상 발생 조직 고정 하실 수 있습니다.
   참고: 말린 침투 조직 천천히, 모든 표면^27,28에서 시간당 1 m m의 속도로. 따라서, 유지 조직 단면도의 두께 5mm 결과 보다는 더 적은 전체 조직의 빠른 정착에.
4. 고정, 후 조직 파라핀 포함에 대 한 적절 한 시 약으로 전송.
   참고: 예를 들어 조직 검사이 원고에 포함 하기 전에 70% 에탄올으로 옮겨 졌다.
5. 파라핀으로 조직을 포함 합니다. ²⁹
6. 10-80 µ m 조직 두께 (사용 10-20 µ m 미르를 원하는 경우)에 섹션²⁹.
7. 메스와 집게를 사용 하면, 처리 하는 살 균, nuclease 무료 microfuge 관으로 각 샘플에서 40 mg 조직 조각을 제거할.
8. Deparaffinization 및 핵 산 복구 FFPE 조직 샘플의 보존된 샘플에서 RNA를 추출 하기 위한 상업 키트를 활용.
   참고: 재료의 테이블에서 에서 참조 하는 키트 활용 크 실 렌 그리고 파라핀, 효소 치료 단계 및 RNA를 정화 하는 유리 섬유 필터를 제거 하 에탄올 세척.

결과

이 문서 (프로토콜의 단계 1-4)에서 제공 하는 고려를 사용 하 여 호스트 유전자 표현 연구에 다운스트림 분석 적합 큰 동물 샘플에서 RNA의 회복에 도움이 됩니다. 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 RNA 품질은 여러 표준 측정에 의해 평가 됩니다. 분 광 광도 학, 단백질 오염 물질의 측정을 제공 하는 A₂₆₀/A₂₈₀ 비율 및 A₂₆₀/A₂₃₀ 비율 순수성 평가 페 놀 등 화학 오염 물질 감지의 다른 수단을 제공 합니다. 각각의 경우의 비율 ~ 2.0 높은-품질 RNA의 증거 이며 감소 비율 오염의 증거. 중요 한 것은, 이러한 비율 질적으로 평가 될 수 있다 RNA 저하에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 (4.15-4.17 단계) 및 양적 (4.18를 단계는 RNA를 통해 무결성 번호 또는 린 점수와 같은).

그것은 림프절 조직 섹션에서 복구 하는 RNA의 예상된 품질 수준은, 평균에, 소과...

토론

마우스, 쥐, 또는 사후 인간의 샘플 transcriptomic 연구와 관련 된 프로토콜의 대부분에 의하여 초점 있다. 그러나, 가축과 야생 동물에 대 한 조사는 인간의 보건에 모두에 적용 가능한 동물 용 의약품, 동물 매개 질병에 관한 질병에 면역 반응의 특성에 대 한 기회의 넓은 범위를 제공합니다. 이 프로토콜은 큰 동물, 가축, 들소, 염소, 양 등에서 높은 무결성 조직에서 RNA 추출에 대 한 주요 고려 사항에 대 한 개요를 제공합니다. 샘플 컬렉션에 대 한 조건 및 동물의 크기는 복구 마우스 림프 노드 복구에 대 한 보다 긴 사후 처리 시간으로 더 광범위 한 프로세스를 확인 합니다. 마찬가지로, 이러한 림프절의 대형 샘플을 대표 림프 노드 내에서 면역/병리학 변화 뿐만 아니라 다른 동물에서 병렬 샘플을 복구 하는 프로토콜을 필요로 합니다. 림프 노드의 단면에 따라 대표 프로필 뿐만 아니라 그대로 RNA의 복구에 대 한 샘플 컬렉션이이 프로토콜에 대 한 제안을 제공 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RNA 보존 용액 (모든 실험에는 RNALater를 사용했습니다)	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml 또는 2 ml 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
일회용 메스	Daigger Scientific	EF7281
조직 겸자, 쥐 이빨	Fisher Scientific	12-460-117	곡선 팁, 테이퍼 가장자리 등을 포함한 기타 조직 겸자 사용 가능, 사용자 선호도에 따라 다름
3mm 펀치 생검 바늘	Fisher Scientific	NC9949469
샤프 용기 (부검을 위해 작고 운반 가능)	Stericycle	8900SA	1 qt. 여기에 표시된 크기
도마 또는 일회용 트레이	Fisher Scientific	09-002-24A	사용자 취향에 따라 다양한 크기로 제공
개인 보호 장비			병원체에 따라 다름 (장갑, 인공 호흡기 마스크, 고글 등)
페놀 기반 RNA 추출 시약(모든 실험에 TRIzol 시약 사용)	ThermoFisher	15596026
실리카 컬럼 기반 RNA 추출 키트(모든 실험에 PureLink RNA Mini 키트 사용)	ThermoFisher	12183018A	최대 100mg 조직용으로 설계됨
100% 에탄올(분자생물학을 위한 200 proof)	Sigma-Aldrich	E7023
동봉 된 균질화 튜브가있는 조직 균질화 기 (모든 실험에 gentleMACS dissociator를 사용했습니다)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (일반, 겔 전기 영동 용)	Sigma-Aldrich	A9539
1X	TBE Fisher Scientific	BP24301	실험실에서 처음부터 만들 수도 있습니다
탈 이온화 포름 아미드	EMD Millipore	S4117
나트륨 도데실 설페이트	시그마-알드리치	L3771
브로모페놀 블루	시그마-알드리치	114391
자일렌 시아놀	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)	Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis 분광 광도계 (NanoDrop 분광 광도계 사용)	ThermoFisher	ND-2000
장치(관련 구성 요소 및 프로토콜과 함께 Bioanalyzer 사용)	애질런트	G2939BA
FFPE RNA 추출 키트(포르말린 고정, 파라핀 내장 조직에 대해 RecoverAll 총 핵산 분리 키트를 사용함)	ThermoFisher	AM1975
플라스틱 스프레더(L자형 스프레더)	Fisher Scientific	14-665-231	감염된 동물의 샘플에 대한 무균 테스트에만 필요
Necropsy knifes	Livestock Concepts	WI-0009209