높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

DNA 압축 일부 박테리아에서 확인 된 극적인 세포질 이벤트입니다. 때 Synechococcus elongatus 는 교양 12 h 아래 각 명암 주기, 압축 된 다른 시간에 그것의 외관에서 명확 하 게 다른 빛 기간의 끝에 등장 하는 DNA¹포인트. 그것은 제안 되었습니다이 프로세스 카이 단백질²에 따라 circadian 시계에 의해 제어 됩니다. 세 키 외 DNA Hoechst 33342 물 빛 기간의 끝으로 S. elongatus 세포에 압축 되었고 형광 현미경 물결 막대 모양을 보여주었다 보고 했다. 다음 압축된 DNA 셀 분할 그리고 마지막으로³각 딸 세포는 정상적인 균일 한 분포에 반환으로 막대의 센터에서 두 가지로 구분. 그러나, 일시적인 자연과 전자 현미경 검사 법에 대 한 큰 크기 구조 분석을 방해. 무라 타 외. 동기 문화, 형광 현미경 검사 법, 급속 동결, 및 높은 포함 여러 방법을 결합 전압 전자 cryo-단층 촬영 (cryo-HVET), 그리고 일시적인 DNA 압축의 구조 확인에 성공 polyphosphate 시체 (PPBs)⁴의 활동을 포함 하 여. 원고 실험 절차를 결합 하 여 자세히 이러한 어려운 자료의 시각적 설명을 제공 합니다.

S. elongatus 는 캡슐 모양, 길이 2 ~ 5 µ m, 너비 0.5 µ m에 대 한 완벽 한 DNA 압축의 아주 짧은 시간 동안만 생활 셀에 나타납니다. 따라서, cyanobacterial DNA 압축에서 발생 하는 구조적인 변화 자세히 알려지지 않은 됐다. 전자 현미경 검사 법에 의해 이러한 구조를 조사 하기 위하여 그것은 두 가지 주요 기술적 문제를 극복 하는 데 필요한입니다. 하나는 기본 조건, 근처에 전체 박테리아 같은 두꺼운 표본 관찰 이며 다른 동적 구조의 급속 한 고정. 첫 번째 문제에 관해서는 전자의 탄성이 평균 자유 경로 (iMFP) 전자 현미경⁵의 가속 전압에 따라 달라 집니다. 전송 전자 현미경 (TEM) 300에서 kV, 그것은 보다 350 nm. 예를 들어, 얼음 포함 cyanobacterium (견본 간격 ≈ 600 nm)는 200kV TEM에서 관찰 (iMFP ≈ 250 nm), 셀 내부 구조는 관찰 하기 어려운. 1 MV 가장 대조적 (iMFP ≈ 500 nm) 줄 수 있고 이미지 셀 (그림 1)에 걸쳐 세포질 구조. 솔루션 1의 가속 전압에 고전압 전자 현미경 (HVEM)의 한 부분으로,이 프로토콜에 MV 고용 했다. 그러나, 시설 HVEM을 구현 하는 세계적으로 제한 됩니다. 가능한 대체 솔루션을 또한 토론 섹션에 설명 되어 있습니다. 두 번째 문제는 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)에 의해 해결 되었다. 이 기본 조건, 표본을 급속 냉동 장치를 사용 하 여 액체 탄에 급속 하 게 얼 고 냉동된 순간 수정⁶의 최소와 함께 직접 관찰은 근처에 동적 구조를 시각화를 위한 강력한 도구입니다. 단층 촬영을 결합, 3 차원 (3D) 구조의 스냅숏으로 기울기 시리즈⁷에서 개축 될 수 있다. 이 실험에서 DNA 압축 S. elongatus 미만 12 h 각 명암 주기, 동기 문화를 사용 하 여 재현 했다 그리고는 시료의 동결의 타이밍 형광 현미경 모니터링에 의해 결정 되었다.

여기에 설명 된 방법 세균성 세포, 예를 들어 세포 분열, 염색체 분리 및 살 균 소 감염에 동적 구조 연구에 광범위 하 게 적용 되며 미생물 연구에 새로운 길을 열 가능성이 있다.

1. 동기 문화 박테리아의

1. S. elongatus 한 천 1.5% (w/v) 및 0.3% (w/v) 나트륨 thiosulfate⁸(에 9 cm 살 균 플라스틱 페 트리 접시) 소독된 BG 11 접시에 PCC 7942 문화.
2. 12 h 빛/12 h 어두운 주기 및 50 µE/m²/s의 광도와 23 ° C에서 성장 챔버에 접시를 놓습니다.
3. 일주일에 한 번 신선한 BG11 한 천 배지 위에 셀을 전송 합니다.
   참고:는 agar에 문화의 녹색 띠로 표시 됩니다이 문화 조건 1 주일 후 셀 적극적으로 확산.
4. 신선한 BG11 한 천 격판덮개에 셀 셀 화 염 멸 균된 와이어 루프와 행진의 녹색 덩어리를 가져가 라. 이렇게 깨끗 한 벤치에.

2. 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링

1. 6 일에 대 한 천 배지에서 배양 세포를 사용 하 여 DNA 압축을 관찰. 셀에서에서 수집 접시 빛 기간의 끝에서 0.2 M 자당 솔루션의 따르는 1 mL에 의해 셀에. 셀의 대부분을 수집할 셀에 솔루션을 붓는 반복 합니다. DNA 얼룩에 대 한 마이크로 튜브로 중단 셀 솔루션을 전송 합니다.
2. DNA 얼룩 염료 (예: Hoechst 33342) 솔루션 1 µ g/mL의 최종 농도에 마이크로 튜브에서 일시 중단 된 셀 솔루션의 500 µ L 추가 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 어둠 속에서 튜브를 유지.
3. 2000 x g 침전 물에 1 분 동안 원심 셀. 삭제는 상쾌한 고 고밀도 세포 현 탁 액을 얻기 위해 0.2 M 자당 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
4. 슬라이드 유리에 얼룩진된 셀을 포함 하는 솔루션의 1 µ L를 전송, 커버 슬립 넣고 100 X 및 침수 기름의 확대와 함께 대물 렌즈를 사용 하 여 UV 필터 장착 형광 현미경으로 관찰.
5. DNA 압축은 대부분의 세포에서이 시점에서 관찰 확인 다음 다음 동결 단계에 대 한 샘플을 준비 합니다.

3입니다. 샘플 곳을 알아내는-HVET에 대 한 동결

1. 식이-냉동 장치를 설정 합니다. 액체 질소 탱크를 테 플 론 튜브 탱크와 챔버를 연결한 후 cryo 약 실 냉각 시작.
2. 액체 질소 온도 챔버를 냉각 후 챔버 내부에 작은 cupper 냄비에 액체 탄을 입력 합니다. 액체 탄 폭발 때문에 작업 중 안경 착용.
3. 글로우 방전 홀리 탄소 코팅 그들의 탄소 쪽 그리드 (홀리 그리드) 30 50 s mA 플라즈마 이온 bombarder를 사용 하 여.
4. 1 µ L BSA 금 추적 프로그램의 적용 (15 nm) 표준 표식으로 홀리 눈금.
5. DNA 압축 단계에서 홀리 그리드 셀의 2.5 µ L 약 수를 적용 됩니다. 필터 종이 초과 솔루션에서 오 점. 즉시 식이 냉동 장치에 플런저를 사용 하 여 액체 탄으로 그리드를 급락.
6. 그들은 검사 때까지 냉동된 격자 액체 질소 저장소에 저장 합니다.

4. 곳을 알아내는-HVET

1. 1의 높은 전압에서 HVEM 설정 MV.
2. 탑재 cryo-견본 홀더 HVEM cryo-워크스테이션, 내부 액체 질소로-150 ° C에 precooled에 대 한 언된 표는 HVEM에 로드 합니다. 얼음으로 오염을 피하기 위하여 주의 해야 합니다.
3. 1, 낮은 확대율에서 이미징 영역 선택 000 X. Eucentric z 축 높이 조정 합니다.
4. -60 °에 견본 단계 기울기와 기울기 회전의 반발을 제거.
5. 10, 확대 대상 위치 근처 초점 조정 000 X. 설정 된 초점된 이미지에서 편차에 의해 6 ~ 10 µ m의 초점에서. 이미지 설정 복용량 2 e^-/Å^-2 미리 견본에서.
6. HVEM에 이미지 화면에 전류 밀도 의해 전자 복용량을 측정 합니다. 전자 필름 또는 디지털 카메라 초점 프로세스에서 동일한 배율에서 이미지를 가져가 라.
7. 수집 기울기 이미지 수동으로 (4.5)와 같은 절차에 의해-60 °에서 60 °에 2 ° ~ 4 °의 기울기 각도 증가 합니다.
   참고: 많은 현대 전자 현미경, 기울기 시리즈의 수집 디지털 카메라의 조합에 의해 자동화입니다. 이 경우, 설명서를 따르십시오. 네거티브 필름에 대 한 전체 강도 개발자를 사용 하 여 개발자 탱크에 20 ° C에서 12 분에 대 한 영화를 개발 하 고 10 분 디지털화 4000 dpi (0.635 nm/픽셀 이미지)의 해상도에서 영화에 대 한 해결사 수정 평판 스캐너를 사용 하 여. 디지털 카메라의 경우 다음 이미지 처리 단계에 직접 수집 된 이미지를 제목. 필요한 경우, 중간 필터 2 ~ 4 범주화 (크기 줄이는 요소) 및 적절 한 소프트웨어 (예: ImageJ)를 사용 하 여 이미지 크기를 줄입니다.

5. 단층 촬영 재구성

1. 스택 이미지 파일을 개별에서 기울기 아이 모드 소프트웨어⁹명령 "tif2mrc" 또는 "newstack"를 사용 하 여 이미지를 확인 합니다.
2. 아이 모드에서 eTomo GUI 소프트웨어를 시작 하 고 이미지 매개 변수 설정: 픽셀 크기, 표준 직경, 이미지 회전, 등등. 그런 다음 스크립트를 만듭니다.
3. 자료의 테이블에 나열 된 소프트웨어에 따라 개별 프로그램 실행 어디 기울기 시리즈 (오류와 함께 평균 잔여 0.5 미만) 표준 마커를 사용 하 여 정렬 됩니다. 마지막으로, 3D tomogram 아이 모드에서 SIRT 알고리즘을 사용 하 여 재구성 합니다.
4. tomogram에서 관심 (ROI) 영역을 추출 하 고 denoise 필터를 사용 하 여 denoise: 아이 모드, EMAN¹⁰, 양자 필터 또는 수학 형태학에 비 등방성 확산 필터 필터¹¹, 등, 적절 한 매개 변수 대비를 향상 시킵니다.

6입니다. 관심의 기능 세분화

참고: 아래 설명 된 절차는 소프트웨어 사용 (참조 자료 테이블) 특정 하지만 다른 소프트웨어 패키지를 대신 사용할 수 있습니다. 그들의 사용자 가이드를 참조 하십시오.

1. 3D 뷰어 창에서 Amira 소프트웨어에 tomogram 파일을 열고 생성 한 OrthoSlice.
2. 세그먼트화 편집기 창에서 새로운 "레이블 필드"를 선택 하 여 분할 파일을 만듭니다.
3. 수동으로 추적 관심 (아버지)의 기능의 테두리. 모든 tomogram 슬라이스를 통해 법을 따릅니다. 두 번째 아버지에 대 한 새로운 "물자" 만들고 동일한 작업을 반복 합니다.
4. "SurfaceGen" 메뉴를 선택 하 여 표면 렌더링을 생성 합니다. 세그먼트 볼륨 시각화 "SurfaceView" 메뉴를 선택 합니다. 이동, 회전 하 고 3D 볼륨 확대, 3D 뷰어 창에는 도구를 사용 합니다.
5. 자동 분할에 대 한 마법 지팡이 도구를 사용 합니다. 개체를 클릭 하 고 개체의 기능에 의해 완전히 선택 되도록 값의 범위를 커버 하는 디스플레이와 마스킹 슬라이더를 조정.

정확한 동기 문화 각 명암 주기 12 h 미만, Hoechst 표시 DNA 어두운 상태 (그림 2a)에서 정상적인 균일 한 분포를 보여줍니다. 그러나, 그것은 점차적으로 빛 기간 동안 셀 내에 압축 하 고 가벼운 기간의 끝에 물결 막대 모양의 구조 (그림 2b)으로 나타납니다. 마지막으로, 막대 ( 그림 2c에서 화살표) 센터에서 분할 그리고 그 두 부분 딸 세포 (그림 2d)로 배포 됩니다. 세포 분열 후 압축된 DNA 사라집니다 즉시, 그리고 DNA는 정상적인 균일 한 분포를 반환 합니다.

때 DNA 압축의 최종 단계에 있는 셀을 포함 하는 셀의 약 수 했다 즉시 전송 홀리 그리드와 빠른 냉동 액체 탄, 그리고 냉동된 그리드 1 MV cryo-HVEM, 남조류 등의 내부 구조에 의해 관찰 되었다 DNA, thylakoid 막, 세포 벽, 레이어와 PPBs, 동결 (그림 3a)의 순간에 스냅숏으로로 나타났다. 많은 셀 셀 ( 그림 3a에서 흰색 화살표)에 고유한 DNA 압축 그리고 정상 세포 ( 그림 3b에서 흰색 화살표)에서 쉽게 구별 될 수 있습니다. 일부 전시 세포의 중심에 수축 세포 분열 (노란색 화살표 그림 3a에서) 전에 예상 대로.

3D tomograms에서 셀의 주요 세포를 세그먼트 수 있습니다; 세포 벽, thylakoid 막, DNA, 레이어와 PPBs 수 구별 (그림 4). 특히, 압축 된 DNA는 세포질 DNA 저밀도 물자에 의해 포위 되었다 고 thylakoid 막 레이어 압축된 DNA의 물결 막대 따라 왜곡 됐다에서 뚜렷한 간격에 의해 분리 되었다. PPBs의 동적 동작을 새롭게 관찰 되었다: DNA에 압축 셀, 그들은 큰 반면 많은 작은 PPBs DNA에 보인 적은 정상 세포에서. 또한, 대부분은 PPBs의 쌍으로 등장 하 고 일부 DNA는 PPBs에서 분리의 과정에 있을 것으로 보인다. 이 DNA 합성에 대 한 인산의 공급 업체로 스스로 PPBs DNA 복제 및 기능으로 2로 분할 된다 제안 했다.

그림 1입니다. 곳을 알아내는-EM 얼음 포함 정상적인 박테리아, S. elongatus PCC 7942 다른 가속 전압에서의 이미지. a) 200kV 및 b) 1000kV. 눈금 막대 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Cyanobacterium S. elongatus 셀의 그림 2: 형광 현미경 검사 법. 동기 문화 12 시간 미만 각 명암 주기, 후 셀 Hoechst 33342와 얼룩이 있었다. (a) 어두운 상태의 발병의 2 시간 후 셀 표시 동일한 DNA 라벨. 많은 세포에서 DNA는 점차적으로 가벼운 기간 동안 집 광. 그것은 궁극적으로 두꺼운 물결 막대 (b) DNA 압축의 전형적인 형성. 이 단계 후에 신속 하 게 세포 분열 (c), 그리고 2 개의 파편 중 그들의 센터 (화살촉)에서 분할 압축된 DNA 구조 딸 세포로 분리 된 (d). 딸 세포는 균일 한 DNA 라벨 어두운 기간에 다시 돌아갑니다. 눈금 막대 = 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 곳을 알아내는-HVEM 이미지 남조류의 무 조직 얼음에 포함 된 (a)은 raw 이미지 0 ° 기울기입니다. 이미지 조명 기간의 끝에서 찍은 사진. 일부 셀 표시 물결 막대 모양의 DNA 시체 핵 압축 된 염색체 (흰색 화살표)와 비슷합니다. 정상 세포에 박테리아 (흰색 화살표) 세포질 내에서 뚜렷한 DNA 구조를 전시 한다. 일부 전시 세포 분열 (노란색 화살표) 전에 예상 대로 셀의 중심에 수축. (b) xy, xz, yz-3D tomogram의 조각. 노란색 점선을 조각의 교차점 표시. 눈금 막대 = 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 포함 된 셀의 열 대권 외 압축 DNA. 주요 구성 요소는 세그먼트: 세포 벽 (밝은 노란색), thylakoid 막 (빨간색), 그리고 DNA (파란색). 3D tomogram의 z 슬라이스 (a) 보여준다. (b) 모든 세그먼트. 세포 분리를 나타내는 수축 (화살표) 셀의 가운데에 나타납니다. PPBs 노란색 또는 주황색 분야;으로 모델링 됩니다. 각 주황색 구체 가까운 노란색 영역에의 대응을 나타냅니다. 눈금 막대 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.