침 샘 hypofunction는 자가 면역 질환과 방사선 치료의 빈번한 결과 이다. 이러한 질병 마우스 모델에서 침 샘 기능의 재현 평가 기술 도전 이다. 여기, 쥐에 타 액 생산의 정확 하 고 재현 가능한 측정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Sjögren의 증후군, 전 분 비에 영향을 미치는 면역 질환 환자는 침 샘 염증을 개발 하 고 타 액 생산을 감소 했습니다. 마찬가지로 타 액 생산 머리와 목 암에 대 한 방사선 치료를 받은 환자에서 심각 하 게 손상 됩니다. 설치류 모델, 이러한 임상 조건 모방 개발 질병 pathogenesis의 이해를 촉진 하 고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 허용. 따라서, 정확 하 게, reproducibly, 그리고 반복적으로 동물 모델에서 침 샘 기능을 측정 하는 능력은 중요 합니다. 문학에서 설명한 이전 절차에 건물, 메서드는 이러한 기준을 충족 하 고 쥐에 있는 침 샘 기능을 평가 하는 데 사용 했다 개발 되었다. 이 새로운 방법의 추가적인 이점은 그것 쉽게 마스터 하 고는 작은 간 연산자 변화입니다. 침 샘 기능 (무게 또는 양) 또는 pilocarpine 자극에 대 한 응답에서 생산 하는 타 액의 속도 (mL/min)로 평가 됩니다. 수집 된 타 액 단백질 콘텐츠, 면역 글로불린 농도, 및 다른 생체 분석에 대 한 좋은 소스입니다.
서론
침 샘 침 다양 한 신경 및 기계적 자극1에 대 한 응답을 생성합니다. 자극에 선 아드레날린 및 해 수용 체 교감 및 부 교감 신경 신경 시스템을 통해 수행 됩니다. Pilocarpine muscarinic 수용 체에 우위 하 게 작동 해, 파라 sympathomimetic 에이전트입니다. 침 샘에 그것은1M3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체에 행동에 의해 타 액의 생산을 유도합니다. Pilocarpine 관리에 따라 타 액 생산 자극에 응답 하는 침 샘의 능력의 지표 이며 침 샘 기능의 측정으로 상용 된다.
타 액 생산의 정확한 측정은 Sjögren의 증후군2 등 방사선 상해 다음 머리와 목 암 치료3침 샘 질환의 연구에 중요 합니다. 여러 가지 다른 방법은 설치류에 타 액 생산을 측정 하기 위해 개발 되었습니다. 4배설 침 덕트, 진공5, 아래 구강에서 타 액의 수집 그리고 유리 모 세관6 또는 micropipette7,8, 를 사용 하 여 컬렉션의 직접적인 cannulation 포함 됩니다. 9. 직접 cannulation 침 덕트의 가장 정확 하 고 순수한 타 액을 제공 합니다. 그러나, 이것은 기술적으로 도전적인 절차, 그리고 ductal 상해를 일으키는 원인이 되기를 위한 잠재력 같은 동물에서 반복적인 침 컬렉션 걸로 하겠습니다. 진공에서 타 액을 수집 튜브에서 타 액의 건조 변수 결과 발생할 수 있습니다. 이 감소는 감소 된 타 액 분 비와 쥐에 더 과장 된다. 그러나 유리 모 세관 후속 분석을 위해 타 액의 컬렉션, 병에 걸린 상태에서 분 비 하는 타 액의 점도 변화는 모 세관의 효율적인 충전을 방지 하는. 또한, 잔여 타 액을 수집 구강 청소 하려고 부상으로 이어질 수 있습니다. 피펫으로 메서드는, 완전 한 컬렉션에 대 한 수 있습니다 하 고 같은 연산자에 대 한 그것은 눈에 띄게 실험 사이. 그러나, 알 수 없는 이유로이 방법은 다른 연산자 사이의 중요 한 변화를 보여줍니다. 따라서, 적절 한 비교를 허용 하려면 동일한 연산자는 특정 프로젝트와 관련 된 모든 실험을 수행 필수적 된다. 명확 하 게,이 실험실을 위한 중요 한 불리를 나타냅니다.
이러한 문제를 해결 하려면 프로시저 결합 타 액 수집 방법 인간과 설치류에 대 한 사용 개발 되었다. Pilocarpine 유도 침 볼륨 측정에 대 한 아래 설명 하는 면봉 방법을 간단 하 고, 재현성, 연산자에 의해 영향을 받지 이며 같은 동물에 반복적으로 수행할 수 있습니다. 또한, 단백질, 면역 글로불린, 또는 다른 생체의 후속 분석을 위해 타 액을 수집 하는 수 있습니다.
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프로토콜
아래에 설명 된 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 그것은 건강의 국가 학회에 의해 설립 하는 윤리적인 지침을 따릅니다. 이 보고서에 제공 된 모든 데이터는 10-12 주 나이의 여성 쥐를 사용 하 여 생성 되었습니다. 쥐의 다음 긴장 사용 했다: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S, 및 (B6XA/J) F1. 모든 마우스 장에 장벽 (5 동물 케이지 당) 특정 병원 체 자유로운 조건에서 지 내게 되었고 먹이 물 ad libitum 제공.
1입니다. 준비
- Pilocarpine 염의 재고 솔루션을 준비, 화합물의 10 밀리 그램의 무게 그리고 vortexing, 5.63 mg/mL의 재고 솔루션을 제공 하 여 살 균 isotonic 식 염 수의 1.776 mL에 녹이 지. 이 솔루션을 소독 아무 필요도 없다. 하지만 원하는 경우 0.2 µ M 필터를 통해 필터링. 최대 3 개월까지-80 oC 냉장고에 여러 aliquots에서이 재고 솔루션을 저장 합니다. 각 냉동된 주식은 단일 사용 됩니다. 일단 해 동, pilocarpine 솔루션을 refreeze 하지 마십시오.
- 0.6 mL microfuge 관을 신중 하 게 온수 18 게이지 바늘으로 각 튜브의 하단에 작은 구멍을 펀치. 이러한 튜브 2 mL 튜브로 설정 합니다. 튜브 살 균 될 필요가 없습니다.
- 샤 프, 메 마른 면도칼 블레이드를 사용 하 여 조각 길이 약 2 ㎝ 원통형 흡수 성 면봉 잘라. 2 원뿔 모양의 면봉에 게 대각선 각 2 cm 조각 잘라. 각 0.6 mL microfuge 관 한 면봉을 배치 합니다.
- 무게 0.6 mL microfuge 관 마른 면봉을 포함 하는.
- 전송으로 새로운 깨끗 한 물 병 공부 하 쥐. 수집 타 액 오염에서 음식 입자를 방지 하기 위해 타 액 컬렉션의 시작 이전에 적어도 2 시간에 대 한 음식 없이 마우스를 유지.
참고: 그것은이 절차에 대 한 감 금 소 당 1 마우스를 유지 하는 데 필요한 아니다. 그러나, 각 장에 배치 하는 쥐의 수는 특정 기관의 규칙 및 동물 사용에 대 한 규정에 따라 다릅니다. - 2 h의 끝의 바로 전에 멸 균 식 염 수에 재고 솔루션 100 배 희석 하 여 작업 pilocarpine 솔루션 (0.0563 mg/mL)을 준비 합니다. 추가 필터를 필요는 없습니다이 솔루션을 소독. 항상 작업 pilocarpine 솔루션 얼음에 보관 합니다.
주: 표 1 pilocarpine 마우스 몸 무게 줄 마지막 복용량 0.375 mg/kg의 체중의 범위에 대 한 주입을 금액을 제공 합니다.
2입니다. 절차
- 각 마우스 무게 고 각 마우스를 사용 하 여 표 1에 대 한 마 취 혼합의 복용량을 결정 합니다. 복 경로 의해 마 취 혼합의 적절 한 볼륨으로 최초의 마우스를 주사. (대부분 마우스 긴장이이 프로토콜에서 테스트로 이동 자 2 분) 2 분 타이머를 설정 합니다. 마우스가 제대로 걷는 때 평평한 표면에 배치의 부족에 의해 마 취를 확인 합니다. 마우스는 여전히 걷고, 다음 단계로 진행 하기 전에 추가 2 분 동안 기다립니다. 건조를 방지 하기 위해 두 눈을 윤 활 유 안과 연 고의 한 방울을 적용 합니다.
참고: 테이블 1의 마 취 혼합의 복용량은 0.007 mL/g 몸 무게. 이 절차에 대 한 최적의 범위 0.006 0.008 mL/g 몸 무게는. 그러나, 4 분, 마우스는 여전히 산책을 하거나 육 포의 움직임을 전시 하는 경우 적절 하 게 증가 하는 마 취의 복용량에 대 한 제도적 수 의사와 상담 후. - 표 1 을 사용 하 여 마우스에 대 한 pilocarpine의 복용량을 결정 하 고 복 경로 의해 적절 한 금액을 투입. 2 분 타이머를 설정 하 고 머리와 귀 스틱 컷된 쪽으로 때까지 50 mL restrainer 튜브에 마우스를 삽입 합니다. 장소, 머리는 45도 각도로 튜브 및 위 복 부 표면. 이동에서 계속 절차 보드 튜브 테이프.
주: 표 1 제공 합니다 복용량을 17 g 보다는 마우스에 대 한이 절차가 쥐 17 g 아래의 무게에 시도 하지 않은. - 2 분의 끝에, 부드럽게 입으로 집게를 해 부 마이크로의 닫힌된 쌍을 삽입 하 고 입 열을 위쪽으로 아래 턱을 들어. 입, 혀는 집게의 최고 팔에 볼 다는 것을 확인에 집게를 1-2 m m 더를 밀어. 또 한 쌍의 좋은 집게, 원뿔 끝 가까이 미리 무게 마른 면봉 붙.
- 부드럽게 입으로는 면봉의 원뿔 끝을 밀어. 구강에는 면봉의 끝 동안에 집게를 철회 한다.
- 입 밖으로 확장 하는 면봉의 넓은 끝을 잡고 그것을 회전 입과의 접촉의 최대 영역을 허용 하도록. 15 분 동안이 자리에는 면봉을 유지.
참고: 이렇게 하면 면봉 컬렉션 동안 입안에 남아 있습니다. 면봉의 원뿔 끝 역할 심지와 면봉의 넓은 부분을 참고 입 밖으로 남아 있습니다. - 15 분의 끝에, 부드럽게 흡수 되지 어떤 타 액을 수집에 면봉을 회전 하 고 0.6 mL microfuge 관에서 젖은 면봉을 배치. 튜브를 닫고 얼음에 2 mL 튜브에 그것을 설정 합니다.
참고:이 시점에서 구강 점 막이 나타납니다 완전히 건조. 마우스 이제 이동할 수 있습니다 다시 그것의 감 금으로 마 취에서 회복을 위한. - 장에 마우스를 전송 합니다. 빠른 재 수 있도록 타 액 수집 후 장에 moistened 음식 펠 릿을 놓습니다.
참고: 쥐를 컬렉션의 끝 후 10 분 이내를 시작. 0.2 mL 미리 따뜻하게 isotonic 식 염 수의 피하 주사도 회복을 가속 화 하기 위해 주어진 수 있습니다. - 다음 마우스를 이동 합니다. 모든 그들은 완전히 복구 될 때까지 모니터링 해야 하는 쥐와는 보 행.
3입니다. 측정
- 모든 컬렉션의 끝에, 젖은 면봉 0.6 mL 튜브 무게. 젖은 무게와 타 액 생산의 무게를 건조 무게의 차이 계산 합니다. 2 mL 튜브에 다시 타 액 0.6 mL 튜브를 놓습니다.
- 2 ml 튜브의 뚜껑을 잘라. 그런 다음 복구는 타 액을 마이크로 원심 분리기에 4oC에서 7500 x g에서 2 분 동안 2 mL 튜브 원심. micropipette를 사용 하 여 얻은 타 액의 양을 측정 합니다.
- 타 액 무게 (mg)10 15 분 이상 또는 타 액 무게 (mg)의 비율으로 결과 표현/몸 무게 (g) 마우스.
참고: 면봉에서 추출 하는 타 액의 양을 측정 하는 경우 타 액 복구 (mL)의 볼륨 또는 타 액의 양 (mL)의 비율으로 결과 표현 / 몸 무게 (g) 마우스.
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결과
실험 마우스 모델 시스템에서 응답 pilocarpine 자극으로 타 액을 생산 하는 능력은 침 샘 기능의 지표로 서 사용 됩니다. 타 액 생산 면봉 메서드에서 11 주 된 C57BL/6 여성 쥐에서 측정 했다. 그림 1A, 결과 타 액 (mg) 수집된 pilocarpine의 증가 복용량을 다음의 금액으로 표시 됩니다. 체중 1 mg/kg의 복용량에 쥐의 일부 (무의식적인 떨고 고 떨고) 조 난 전시 시작 했다. 따라서 더 높은 복용량의 1 밀리 그램/kg 체중 넘어 pilocarpine 하지이 연구에서 테스트 되었습니다. 그림 1B, 결과 마우스 몸 무게 (g)을 타 액 무게 (mg)의 비로 표시 됩니다. 샨 다, 이러한 데이터 좋은 복용량 응답 관계를 pilocarpine 양과 타 액 생산을 보여줍니다. 면봉에서 회복 하는 타 액의 양을 측정 했다.
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토론
타 액 생산은 복잡 한 프로세스 이며 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 실험실 동물에 침 샘 기능을 측정 하는 것은 도전 될 수 있습니다. 추가 도전 침 샘 기능 같은 동물에서의 반복된 측정은 질병의 발병을 설정 하거나 복구 치료 다음과 설명 필요입니다.
이 보고서에 설명 된 면봉 메서드는 데이터를 표현 하기 위해 여러 옵션을 수행할 수 기술적으로 간단 하다. 얻은 결과 작은 간 연산자 변이로 재현할 수 있습니다. 메서드는 침 샘 기능 장애의 다른 모델에 타 액 생산에 감소를 검색할 수 있습니다. 중요 한 이점은 이다 불활성, 높은 흡수 성 고분자의 사용 및 수 침 생체 측정 수집, 타 액의 효율적인 복구. 이 방법의 또 다른 장점은 하나의 연산자에 의해 한 번에 최대 2 마우스에서 동시에이 절차를 수행 하는 것. 이 한 번에 하나의 마우스에서 수행 됩니다 일부 다른 방법 보다 훨씬 더 효율적입니다.
타 액 생산 측정의...
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공개 사항
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
연구는 국립 보건원, 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (DE025030)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Chemicals for Saliva Collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | 멸균 등장성 식염수에 희석합니다. 100X 재고의 일회용 부분 표본을 -80oC |
| Name | Company | >카탈로그 번호 | Comments |
| >Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL 케타민 염산염 + 0.5 mL 자일라진 + 8.5 mL 멸균 등장 식염수를 멸균 바이알에 혼합합니다. 3 개월 동안 사용할 수 있습니다. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 재고는 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | 재고는 20 mg/mL |
| Isotonic sterile Saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | 희석제로 사용 |
| 인공 눈물(윤활제 안과 연고) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | 시술 중 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 사용 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| >타액 채취용 재료 | |||
| SalivaBio 어린이용 면봉 | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, 미국 | N/A | 개별 포장된 면봉 |
| 50mL 폴리프로필렌 튜브 | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | 튜브의 바닥을 1cm 잘라냅니다. 절단면이 매끄러운지 확인하십시오. |
| 마이크로 원심분리기 튜브 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | 가열된 18 게이지 바늘로 튜브 바닥에 구멍 만들기 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| 영구적으로 부착된 바늘이 있는 인슐린 주사기 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 게이지 일반 베벨 바늘 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| 멸균 메스 블레이드 #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| 미세해부 겸 | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | 톱니 모양의 각도 0.8mm 팁, 4" 길이 |
| 라벨 테이프 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3채널 타이머 | Amazon.com, 미국 워싱턴주 시애틀 | B06W2KCYVN | |
| 분석 저울 | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| strong>Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | 내독소가 없는 물에 용해시키고 스톡 용액을 5mg/mL로 저장합니다. 멸균 HBSS 100 ug/mL로 희석 - 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | 주입 멸균 식염수에 1:1로 희석합니다. 복강내 0.1mL 주입 |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | 실험실 | 생성 재조합 마우스 Ro52 | |
| Name | Company | >카탈로그 번호 | Comments |
| Chemicals/ 타액 분석용 키트 | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | 제조사의 지시에 따라 사용됨 |
| Name | >Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| 샌드위치 ELISA에 의한 Salivary IgA 추정 ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | 샌드위치 ELISA에 대한 표준 - 범위 30 ng/mL - 0.5 ng/mL |
| 염소 항-마우스 IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | 중탄산염 완충액에서 1 ug/mL의 코팅 |
| 염소 항-마우스 IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | 1:4000 희석 |
| TMB 기질 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | 제조업체의 지침에 따라 사용 |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 타액 단백질 추정 | |||
| Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축 | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | 제조업체의 지침에 따른 단백질 추정 |
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