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Summary

태아 마우스의 높은 주파수 초음파 이미징 영상 해상도 개선 하 고 심장 개발 및 구조적 결함의 정확한 비-침략 적 특성을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 실시간 태아 쥐 심장 초음파에서 vivo에서수행 하도록 설계 되었습니다.

Abstract

선 천 성 심장 결함 (CHDs) 어린 시절 병 적 상태와 초기 사망률의 가장 일반적인 원인입니다. 태아 기 탐지 CHDs의 기본 분자 메커니즘의 새로운 예방 및 치료 전략을 발명에 대 한 결정적 이다. 돌연변이 마우스 모델은 새로운 메커니즘 및 심장 발달 및 그들의 잠재적인 CHDs 드라이브 환경 스트레스 한정자를 강력한 도구입니다. 그러나, 이러한 putative 참여자의 인과 관계를 설정 하는 노력 되었습니다 조직학 및 분자 비 생존 동물 실험에서 연구 하는 주요 생리 및 hemodynamic 매개 변수를 모니터링 하는 결 석. 라이브 이미징 기술을 CHDs의 병 인을 설정 하는 필수적인 도구가 되고있다. 특히, 초음파 영상 없이 사용할 수 있습니다 prenatally 수술 노출 태아, 심장 챔버의 hemodynamic 및 구조 측면에서 환경 스트레스의 영향을 모니터링 하는 동안 그들의 기준선 생리학을 유지 수 개발입니다. 여기, 높은-주파수 초음파 (30/45) 시스템 사용 하 여 심장 혈관 시스템 E18.5에서 utero에 기준선에 태아 쥐에 태아 hypoxia 노출에 대 한 응답에서을 검사 하. 우리 심장 챔버 크기, 형태, 심 실 기능, 태아 심장 박동, 그리고 탯 줄 동맥 흐름 인덱스, 그리고 조직의 만성 산소에 utero에서 진짜에서에 노출 태아 쥐에 그들의 변경 측정 시스템의 타당성 입증 시간입니다.

Introduction

심장의 선 천 성 기형의 조기 심장 개발 하는 동안 발생 하는 다른 유형의 구조적 결함이 있습니다. 운영 절차의 현재 기술 진보는 CHDs^1,2유아의 생존 율에 상당한 개선을 이끌어 냈다. 그러나, 삶의 질입니다 종종 장기간된 입원을 필요 손상 된 보조 외과 수리 절차^1,2,3,,45을 벌였다. CHDs의 기본 분자 메커니즘의 태아 기 탐지 계획 초기 개입, 새로운 예방 전략을 실시 하 고 평생 결과^6,7을 개선 하기 위해 결정적 이다.

여러 유전과 환경 요인 CHDs 병에 연루 되어, 비록 unmet 필요가 개선 진단, 치료, 그리고 예방 전략^{1,8,9 남아는 인과 관계를 설정 ,10,,1112}. 또한, 미래의 조사^11,12에 대 한 새로운 장소 열립니다 utero에 스트레스 요인과 epigenetic 한정자의 역할을 검토. 지난 10 년간 실제로 차세대 시퀀싱 기술 등 단일 염기 다형성 (SNP) microarray, 전체 exome 시퀀싱, 게놈 전체 메 틸 화 연구, 유전자 연구에 그들의 사용에서에서 급속 한 발전을 목격 했다 CHDs^1,,89,10,11 소설 돌연변이 아직 되지 않은 유전 이체를 식별 하는 방법은 포장을 포함 하 여 복잡 한 인간의 질병의 원인 그들의 pathogenicity 적절 한 동물 모델에 대 한 테스트.

다른 질병 모델 시스템 가운데 마우스는 선택, 뿐만 아니라 초기 cardiogenesis^13,14,,1516, 동안 뿐만 아니라 명료 CHDs의 메커니즘을 조사 동물 모델 임산부 및 주 스트레스 요인에 늦은 임신에서 기능과 심장 챔버 성숙에 그들의 영향. 따라서, vivo에서 phenotypic 특성 돌연변이 태아 마우스 심 혼의 개발 초기와 후반 단계를 수행 하는 것은 이러한 유전자 변이 심장 개발에 환경 요인의 역할을 이해 하는 중요 한 고 약 실 특정 성숙에 잠재적인 미래 영향 쥐에 처리합니다.

조기 발견 및 개발 하는 동안 심장 결함의 정확한 진단이 중재 계획^17,18에 대 한 중요 합니다. 안전, 간단 하 고, 휴대용 하 고 반복 되 고, 태아 초음파 실제로 되고있다 이미징 병원에서 심장 평가 위한 기술 표준. 태아 순환 평가 도플러 초음파를 사용 하 여 널리 사용 되었습니다 임상 연습 심장 결함의 검출을 위한 뿐만 아니라 뿐만 아니라 혈관 이상, 태 반 부족 및 자궁내 성장 금지를 감지 하 고 평가 하 태아 복지 utero에 모욕 hypoxemia, 모성 질환 및 약물 독성^17,18를 포함 하 여에 대 한 응답. 인간의 결함과 질병 평가에서 그 가치를 병렬로 태아 쥐의 초음파 평가 실험 설정^{19,20,,2122에서 증가 유틸리티를 얻고 있다 23}. 특히, 태아 심장 초음파 (심장 초음파) 개발의 순차적 vivo에서 시각화를 수 있습니다. 많은 실험 연구 유전자 변형 태아 쥐에 태아 심장 혈관 개발 관찰을 초음파 이미징 기술을 사용. 도플러 초음파는 특히 유용 생리 적 문제 또는 질병 조건^10,19태아 순환의 흐름 패턴 같은 pathophysiological 매개 변수를 명료 하 게 되었습니다. 둘 다 인간과 동물, 태아에 게 비정상적인 혈액 흐름이 나 산소 공급 utero에서 태아 환경 중단 하 고 fetoplacental 축, 태 반 이상를 포함 하 여 어머니 산소에 영향을 미칠 수 있는 다양 한 조건에서 발생할 수 있습니다. 임신 성 당뇨병, 고 약물 유도 혈관 수축^15,22. 따라서 태아 쥐에 도플러 초음파를 수행 하기 위한 표준화 된 방법을 수립 강화할 것입니다 대단히 CHDs의 미래 연구 모니터링 흐름 패턴 및 동안 심혈 관 회로의 주요 hemodynamic 인덱스를 촉진 하 여 유전 마우스 모델. 에 심장 개발의 다른 단계

높은 주파수 초음파 마우스 모델 및 인간 질병¹⁸에서 심장 혈관 시스템의 개발 및 생리 적 매개 변수를 측정 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 이 기술은 최근 몇 년 동안에서 더 세련 되어 있다. 우리와 다른 연구자는 태아 마우스 심 혼^{15,19,20,21,22에 매우 높은 주파수 초음파 연구 수행을 위한이 시스템의 타당성을 증명 하고있다 ,23}. 시스템은 도플러 컬러 흐름 매핑 및 높은 주파수 (30 ~ 50 m h z) 프레임 레이트에서 2 차원, 동적 이미지를 생성 하는 선형 배열 센서를 갖추고 있습니다. 낮은 주파수 초음파 시스템 및²², 높은 주파수의 초음파^21,이전 세대에 비해 이러한 이점을 제공 심층 평가 태아 순환에 대 한 필요한 감도 및 해상도 시스템, 심장 구조, 챔버 기능 및 태아 쥐의 흐름 지 수의 포괄적인 묘사를 포함 하 여 실험 설정에서. 여기, 우리가 높은 주파수 시스템을 사용 하 여 심장과 순환 및 배아 하루 E18.5에서 vivo에서 에서 feto 태 반 순환의 급속 한 평가 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 약 60 µ m의 축 분해능과 – 150 µ m의 수평 해상도 30/45 MHz 트랜스듀서를 선택 했다. 그러나, 유사한 방법론 접근에 따라 이전 발달 단계를 분석 하는 더 높은 주파수 변환기 (40/50 MHz)를 선택할 수 있습니다. M 모드는 선택 된 높은 시간 해상도 수준 (1, 000 프레임/s)에서 모션 조직의 시각화 수 있습니다. 마지막으로, 우리가 태아 심장 혈관 hemodynamic 상태 및 기능 기준선에 쥐에 있는 태아 hypoxia 스트레스에 대 한 응답에서의 상세한 포괄적인 phenotypic 특성에 대 한 높은 초음파의 타당성을 보여줍니다.

Protocol

캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 동물 관리 및 사용 위원회는이 프로토콜에 표시 된 모든 절차를 승인 했습니다. 실험은 활성 동물 프로토콜 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 캘리포니아, 미국에서 진행 중인 연구의 일환으로 실시 되었다. 동물 처리 및 치료 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드의 기준에 따 랐 다. 1. 높은 주파수 초음파 이미징 시스템 준비 초음파 이미징 시스템 및 생리학 모니터링 장치를 켭니다. 30/45 MHz 트랜스듀서를 연결 합니다. 그것의 홀더 이미징 플랫폼 근처에 해당 스캔 헤드를 놓습니다. 심장 측정 프로그램 옵션을 선택 합니다. 초음파 젤 37 ° c 설정 미리 데우는 컨테이너에 거꾸로 하는 장소 마 취에 대 한 적절 한 배관 시스템을 확인 하 고 산소와 isoflurane 수준을 확인 합니다. 이미징 플랫폼과 작업 영역을 치료. 일정 온도 유지 하기 위해 이미징 플랫폼의 열 수준 및 댐의 심장 박동을 설정 합니다. 2. 임신 마우스 준비 마 취 유도 실에서 임신 마우스 (C57/BL6) 댐을 놓습니다. 마 취를 유도 사용 하 여 지속적으로 100% 산소 (100% O2) 유도 실에서 200 mL/min의 유량에 섞인 inhalational isoflurane (isoflurane 2%-3%)를 전달. Sedated 동물 부정사 위치에 이미징 플랫폼에 전송. 안 면 마 취 튜브 시스템 제공 isoflurane (1.0-1.5%)에 연결을 사용 하 여 정상 상태 진정 섞인 100% O2 200 mL/min에서 제공 합니다.주의: 용기 집합을 포함 하는 숯 필터를 갖춘 환기 시스템을 사용 하 여 마 취 가스의 누설을 제어 합니다. 모성 심장 및 호흡 속도 지속적으로 모니터링을 달성 하기 위해 전극 젤의 신청 후 부드럽게 임베디드 electrocardiographic 전극에 사지를 테이프. (50 비트/분 (bpm) + 450)의 평균 심장 박동을 유지 하기 위해 isoflurane 수준을 조정 합니다. 37.0 ° C ± 0.5 ° c.의 범위 내에서 체온을 유지 체온과 생리학 컨트롤러 단위에 표시 되 고 심장 박동을 모니터링 합니다. Sedated 마우스 이미징 절차에 걸쳐 마다 15 분의 생체 신호를 기록 합니다. 마우스의 자세, 심장 박동, 그리고 pinches 발가락에 대 한 응답을 평가 하 여 마 취의 정도 평가 합니다. 눈 건조 및 각 막 손상을 방지 하기 위해 안과 밤 (각 눈에 1 방울)을 적용 합니다. 초음파 감쇄를 최소화 하기 위해 depilatory 크림을 사용 하 여 더 낮은 사지에 중순 가슴 수준에서 모피를 제거 합니다. 습식 및 건식 거 즈를 교체 하 여 응용 프로그램 손상을 방지 하기 위해 피부에 패치 후 크림 1-1.5 분을 제거 합니다. 3. 배아 식별 복 부 벽은 태아를 찾아서 그들을 밖으로 확산을 부드럽게 만져 댐의 복 부에 각 배아를 주석 하 고 마커를 사용 하 여 그들의 이전 후부 및 등 쪽 복 부 방향을 정의 합니다. Sedated 댐의 자 궁 경부를 사용 하 여 랜드마크로. L1, L2, L 3, 왼쪽 및 오른쪽 자 궁 뿔에 태아 레이블 등 (왼쪽)와 R1, R2, R3, 등 (오른쪽), 각각 (그림 1A).주의:는 태아를 강제로 확산 하지 마십시오. 각 담가에 1-2 태아는 다른 사람, 그들의 위치 및 이미징 신뢰할 수 없는 만드는 겹칠 수 있습니다. 분석에서이 태아를 제외 합니다. 4. 태아 심장 시각화 및 주석 복 부에 미리 데워 진된 초음파 젤을 적용 하 고 거품 형성을 피하기 위해 신중 하 게 그것을 확산. 스캔 이미지의 영역에 젤의 추가 금액을 추가 합니다. 그것의 기계적인 보유자에 초음파 프로브를 놓고 두꺼운 젤 레이어 검색 B 모드 (그림 1)를 사용 하 여 뛰는 심장에 대 한 찾는 동안 접촉 하 게 피부 쪽으로 점차적으로 그것을 동원 합니다. 2 차원 이미지를 스캔 B 모드 버튼을 클릭 합니다. 첫 번째 태아는 오른쪽 또는 왼쪽된 자 궁 경적에 위치를 식별 하 고 각각 R1 또는 L1로 표시 하는 랜드마크로 방광을 사용 합니다. 실시간으로 개별 태아의 오른쪽 및 왼쪽 방향 수평 평면에 이미징 플랫폼을 이동 하 여 확인 합니다. 랜드마크 (그림 1B, 비디오 1)로 서 주 둥이, 팔, 다리 및 척추를 주석을 꼬리 머리에서 스캔. 뛰는 심장 시각화 하 고 주석이 왼쪽된 심 실 (LV)와 우 심 실 (RV). 심장 시각화를 최적화 하기 위해 사용 색 도플러 모드 (그림 1 C-G, 동영상 1-2). 보기-parasternal 짧은 축를 스캔 B 모드 버튼을 클릭 LV와 RV 데이터 수집 프레임의 센터에 그들의 최대 직경에 표시 됩니다. 라이브 영상 (그림 1B-C)을 시작 합니다. 경도 4 챔버 보기 (그림 1D)를 비행기를 검색에 대해 마우스의 방향을 변경 합니다. 첫째, 심 방, interventricular 심장, 왼쪽 및 오른쪽 유출 책자 등 심장의 나머지 구조를 식별 합니다. 다음, 그들의 최대 직경에 표시 되는 심 실 및 심 방 실 있다. 이미지 수집을 시작 합니다. 최종 분석에서 최적 비, 간접 이미지를 제외 합니다. 10의 최소 연속 녹음 ‘Cineloops’를 Cini 클릭 기록된 이미지 저장 후 s. 5. 태아 심 박수 및 심 실 기능 평가 4 개의 챔버 비행기 (비디오 3)에서 심장 이미지를 스캔 M 모드 버튼을 클릭 합니다. 모든 태아의 이미지 작업이 완료 되 면 분석에 대 한 기록의 목록 보기 최종 분석에서 최적 비, 간접 이미지를 제외 합니다. 측정 벽 두께와 심장 (LVID, d;에서 왼쪽/오른쪽 심 실 내부 직경 분석 버튼을 클릭 RVID, d)와 systole (LVID, s; RVID, s), 그림 2와 같이. 각을 재생 하 여 평균 태아의 심장 박동 기록 추적 하 고 계산 하는 다음과 같은 흐름에 하나의 흐름 주기의 측정 주기 (인접 한 봉우리 사이의 간격) M 모드를 결정 합니다. 평균 심장 박동 (그림 2)를 얻기 위해 여러 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행 합니다. 왼쪽된 심 실 내부 확장기 직경 (LVID, d) 사이의 심장 주기 끝 systole (LVID, s)에서 왼쪽된 심 실 내부 직경 시간적 변화를 측정 합니다. 다음 분수 단축 백분율 (FS %)를 다음과 같이 계산: FS % [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d =] x100. 평균 FS % 값을 얻기 위해 여러 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행 합니다. 6. 구급 흐름 매개 변수를 평가 수집의 각도 분야 60o조정 합니다. 45-MHz 변환기를 사용 하 여 2 차원 4 챔버 영상 평면에서 펄스 파 도플러 측정을 수행 하려면 도플러 클릭 합니다. 먼저, 오른쪽 유출 관을 식별 하 고 폐 동맥의 분기 시각화. 다음으로 폐와 대동맥 밸브 (그림 3A, 비디오 4) 통해 흐름 패턴을 얻기 위해 펄스 파 도플러 단추를 클릭 합니다. 펄스 파 도플러 추적, 최대 수축 기 속도 (PkV), 배출 시간 (동부 표준시), (에서), 가속 시간 등에서 폐 흐름 측정을 가져옵니다. (오른쪽) 그림 3A 에서 같이 평균 측정을 얻기 위해 여러 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행 합니다. AT 계산 / 외 각에 대 한 유출 책자 patency의 지표로 서 밸브를 유출 비율과 혈액 흐름. 펄스 파 도플러를 사용 하 여 2 차원 꼭대기 4 챔버 뷰에서 mitral 및 대동맥 흐름 패턴을 얻을로 이동 합니다. 먼저, 왼쪽된 심 방 및 좌 심 실 챔버를 식별 합니다. 그런 다음 펄스 파 도플러 샘플 볼륨을 (A) (그림 3B)24,25mitral 유입 도플러 패턴 및 측정 초기 확장기 속도 (E)와 심 방 수축 속도의 기록에 대 한 놓습니다. 대동맥 도플러 제트 패턴을 얻기 위해 도플러 샘플 볼륨을 조정 합니다. 대동맥 도플러 제트기 (오른쪽) 그림 3B 에서 같이 가속 (에서) 시간과 배출 시간 (동부 표준시)을 측정 하기 위해 추적 (비디오 5)를 사용 하 여 7. 평가 Feto Placental 축 컬러 도플러 검사를 사용 하 여 45의 트랜스듀서 (그림 4A)를 사용 하 여 자 궁 동맥 및 feto 태 반 혈관 트리 시각화. 태아 복 부에서 코드 종료 직후 탯, 양수 내 세그먼트에 탯 줄 혈관 (두 동맥과 1 개의 정 맥)를 식별 합니다. 장소 펄스 파 도플러 샘플 볼륨 탯 줄 동맥 흐름 패턴 (그림 4A)를. (에서), 방출 시간 (동부 표준시), 가속 시간을 포함 한 혈관 피크 흐름 매개 변수를 측정 하 고 흐름 속도 끝 systole (PkV, s)에서 피크 펄스 파 도플러 검사 기록 (그림 4B)를 사용 하 여. 태아의 움직임과 모성 호흡 운동, 각 선박에 대 한 평균 최고 속도 측정 하의 부재에서 각 선박에서 5 연속 파형을 얻을. 다음 배아를 진행 합니다. 8. 후 이미징 동물 모니터링 이미징 프로세스의 완료 후 isoflurane 컨테이너를 해제 합니다. 계속 복구 단계 동안 체온, 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다. 댐 시작 자발적인 움직임은 안 면 및 연결된 배관 시스템을 제거 합니다. 적절 한 주거에 댐을 반환 하 고 표준 기관 수술 후 프로토콜에 따라 관찰을 계속. 정상적인 활동의 전체 재개 시간을 문서화 합니다. 9. 성능 요구 사항 및 기술 고려 사항 생체 신호 및 생리 적 매개 변수에 장시간된 마 취의 부작용을 피하기 위해 약 1 h ~ 8 태아에 대 한 처리 시간을 제한 합니다. 이미지 수집 및 흐름 패턴 짧은 시간 프레임에 추적에 대 한 기술을 최적화 하 8-10 임신 쥐와 함께 훈련을 완료 합니다.

Representative Results

심장 및 hemodynamic 인덱스의 통계 분석은 오프 라인으로 수행 되었습니다. 3 최적의 이미지에서 5 연속 측정 수단을 계산 했다. 데이터는 ± SEM. 학생의 t의미 표현 했다-테스트 intergroup 비교 유추 하는 데 사용 되었다. P 값이 0.05 통계적으로 간주 되었다. 위의 프로토콜에 따라 우리 특징 태아 쥐의 심장 혈관 상태에 ?…

Discussion

심장 혈관 기형 및 질병 실질적으로 유전 요인과 환경 요소¹⁹에 의해 좌우 된다. 우리 이전 두 번째 임신의 feto 태 반 순환 흐름 및 태아 심장 기능⁹중 시작 모성 열 량 제한의 상당한 영향을 설명 했다.

태아 저 산소 증은 대단히 feto placental 생리학 및 순환 시스템에 영향을 미칠 수 있습니다 태아 개발 중 또 다른 일반적인 스트레스 요소 이다…

Materials

Vevo 2100	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	N/A	High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)	Charles River Laboratories	N/A	Inbread wild type mouse strain