오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

요약

시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

초록

항균 약물 극적으로 증가 수명과 삶의 질^{20 세기에서} 비록 항균 성 저항 조직의 감염을 치료 하는 우리의 전체 사회 능력을 위협 한다. 년 및 비용 추가 건강에 약 20 십억 달러는 미국에서 혼자, 항생제 내성 감염 약 23000 명 죽 일. 항균 성 저항에 대처 하기 위해 한 가지 방법은 조합 치료, 감염의 중요 한 초기 단계에 특히 유용 하다 전에 감염 유기 체와 약물 저항 프로필 확인 되었습니다입니다. 많은 항균 성 치료는 조합 치료를 사용합니다. 그러나,이 조합은 대부분의 첨가물, 결합 된 효능은 개별 항생제 효능의 합계와 같은 의미. 일부 조합 치료는 시너지: 결합 된 효능 첨가제 보다 훨씬 큽니다. 때문에 그들은 항균 약물 저항 종자의 성장을 억제할 수 있는 시너지 조합은 특히 유용 합니다. 그러나, 이러한 조합은 희귀 하 고 식별 하기 어려운 있습니다. 이것은 없음을 방식으로 테스트 하는 데 필요한 분자의 완전 한 숫자 때문 이다: 1000 분자의 도서관은 1 백만 잠재적인 조합. 따라서, 시너지 효과 대 한 분자를 예측 하기 위해 노력 되었습니다. 이 문서에서는 중복² 방법 (O2M)로 알려진 시너지 작은 분자 쌍을 예측에 대 한 우리의 높은 처리량 방법. O2M 화학 유전자 데이터 집합에서 사용 하 여 과민 시너지 쌍에서 각 분자를 하지만 다른 분자는 돌연변이 식별. 브라운 실험실 돌연변이 하지 야생-타입 세포의 성장을 억제 하는 분자에 대 한 높은 처리 화면을 수행 하 여이 성장 차이 이용 한다. 실험실의 작업은 이전 항생제 trimethoprim와이 전략을 사용 하 여 항진균 약물 fluconazole synergize 분자 식별. 여기, 저자 여러 미생물에 대 한 변경 될 수 있습니다 새로운 시너지 조합에 대 한 화면을 방법 제시.

서론

항생제 내성 박테리아 발생할 2 백만 이상의 감염과 23000 죽음 매년 CDC¹에 따르면 미국에서. 새로운 치료는 이러한 감염을 극복 하기 위해 필요 하다. 이러한 새로운 치료를 식별 하는 전략에는 새로운 항균 약물의 개발 이나 작은 분자 치료 미생물 감염^2,,34다른 조건에 대 한 승인의 재사용 포함 됩니다. 그러나, 새로운 약물의 발견은 매우 비싸고 시간이 많이 소요. 마약을 재사용 소설 마약을 식별할 수 있습니다 또는 약물 대상^5,6. 우리의 실험실 시너지 조합 치료로 알려진 세 번째 전략에 초점을 맞추고. 시너지 조합 두 작은 분자는 함께 그들의 개별 신진대사⁷의 첨가제 효과 보다는 효능을가지고 하는 경우 발생 합니다. 또한, 시너지 조합 큰 잠재적인^{8,9, 렌더링 덜 원치 않는 오프 대상 효과 이외 쌍에 있는 작은 분자 중에 병원 체 저항에 대 한 효과가 될 수 있습니다. 10}.

시너지 쌍 드물다, 약물 조합^11,,1213의 약 4-10%에서 발생. 따라서, 인덱스도 스크린 등 전통적인 기술 도전과 백 분자의 작은 도서관에서 잠재적인 조합의 수천 시간이 있습니다. 또한, 공동 성 상호 작용 일반적으로 예측할 수 없습니다 화합물¹⁴의 활동에서. 그러나, 저자 오버랩² 방법 (O2M)¹²라는 시너지 쌍에 대 한 화면에 대 한 높은 처리 접근을 개발 했다. 여기서 설명 하는이 방법을 이러한 시너지 쌍의 빠르고, 보다 효율적인 식별 수 있습니다. O2M 알려진된 시너지 쌍 및 화학 유전학 데이터 집합 사용을 해야합니다. 녹아웃 돌연변이의 도서관은 많은 다른 작은 분자의 성장 하는 때 화학 유전학 데이터 집합 생성 됩니다. 그 같은 돌연변이에서 표현 형을 elicits 다른 작은 분자 알려진의 각 멤버와 또한 synergize 해야 경우 알려진된 시너지 쌍에서 한 분자 두 번째 시너지 분자 처럼 특정 녹아웃 돌연변이에서 동일한 표현 형을 유도, 시너지 쌍입니다. 이 근거 시너지 항생제 쌍 대장균 (대장균) 에 대 한 활성 및 병원 성 균 류 Cryptococcus neoformans (c.에 대 한 활성 시너지 항진균 약물 쌍을 식별 하는 갈색 실험실에서 사용 되었습니다. neoformans)^11,12. O2M만 다양 한 병원 균에 대 한 적응력은 하지만 쉽고 빠르게 상승 쌍을 확인 하려면 분자의 큰 도서관의 심사에 대 한 수 있습니다. O2M 식별 유전자 돌연변이와 심사 시너지에 대 한 예측만 그 작은 분자를 확인 하기 위해 수 있습니다. 따라서, 쌍 2000 분자 라이브러리를 테스트 걸릴 것 이라고 개월, 반면에 있던 경우에 20 분자 synergize 것으로 예측 하는 해당 라이브러리에서 일의 문제가 걸립니다 지금은 시너지에 대 한 테스트. O2M 프로그래밍 기술, 필요 하지 않습니다 이며 필요한 장비 대부분 연구소 나 핵심 시설에서 사용할 수 있습니다. 연구팀은 약물 조합에 관심이, 뿐만 아니라 O2M 분석 약 화면을 완료 하 고 중요 한 약물-약물 상호 작용을 식별 하 여 그들의 명 중을 확장 하 고 싶어 누가 누구에 게 관심입니다. 아래는 박테리아, 시너지 작은 분자 식별로 잘 알려진 분석^15,16예측된 공동 성 상호 작용을 확인 프로토콜이입니다.

프로토콜

1. 식별 오버랩² 방법 (O2M)에 의해 화학 유전학 Dataset에서 시너지 예측 돌연변이

참고: 이것은 시너지 예측 돌연변이 니콜스 외에서 게시 된 데이터 집합을 사용 하 여 식별 하기 위한 방법입니다. 대장균에서 ¹⁷ . 그러나,이 모든 화학 유전학 dataset 및 미생물에 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터 세트의 녹아웃 돌연변이 100 개 이상의 작은 분자의 성장 각 작은 분자에 각 돌연변이 대 한 양적 성장 점수를 주는 라이브러리 포함 되어 있습니다. 1 개의 상승 쌍을 알고 있어야 합니다, 그리고 성장 점수는 데이터 집합에 포함 된 두 작은 분자에 대 한 되어야 합니다.

1. 모든 돌연변이 각 작은 분자의 단일 농도의 성장에 대 한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산 합니다.
   참고:이 수행할 수 있는 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여. 브라운 실험실을 사용 하 여 Excel 기능 =AVERAGE(B3:B3981)와 작은 분자의 열 각의 계산에 대 한 =STDEV(B3:B3981).
   1. 다른 데이터 집합을 사용 하는 경우이 방향이 다를 수 있지만 의미 및 작은 분자의 각 열에서 표준 편차를 계산 합니다.
2. 니콜스 외에서 동일한 데이터 집합을 사용 하 여 작은 분자의 각 농도 대 한 Z 점수를 계산 합니다. 스프레드시트 프로그램에서 ¹⁷ . 이 대 한 음수 z 점수 Z(2.5) 것 = 의미-2.5 * 표준 편차, 그리고 긍정적인 z 점수 Z(2.5) 것 = 평균 + 2.5 * 표준 편차.
3. 어떤 유전자 돌연변이 포함 되 고 확실 하 게 그 분자의 모든 농도에서 알려진된 시너지 쌍을 구성 하는 작은 분자의 중요 한 Z 점수를 결정 합니다. 음수 Z (2.5) 보다는 작은 성장 돌연변이의 점수는 점수 또는 그 작은 분자에 대 한 긍정적인 Z (2.5) 점수 보다 큰, 그것은 중요 한 간주 됩니다.
4. 중요 한 유전자 돌연변이의 한 오 페론에 속하는 경우 결정 합니다.
   참고: 대장균, 저자 추천 "Ecoli 위 키" 정보에 대 한 검사에 관한 유전자는 polycistronic RNA의 일환으로 복사할 경우.
5. 다른 농도 작은 분자의 대부분에 공통 된 유전자/오 페론 돌연변이 식별 (예. 항생제 trimethoprim와 synergize 분자 식별 표시 중요 한 Z 돌연변이 찾고 때, 점수 trimethoprim와 sulfamethizole 또는 sulfamethoxazole와 같은 알려진된 시너지 파트너의 성장 하는 때). 이들은 상 상속 시너지 예측 돌연변이입니다.

2. 예측 O2M에 의해 화학 유전학 데이터 집합 내에서 Synergizers

1. 데이터 집합¹⁷되돌립니다 시너지 예측 돌연변이에서 상당한 성장 점수를 elicits 작은 분자의 각 농도 식별 합니다. 이것은 작은 분자의 각 농도 대 한 계산 된 Z 점수 보고에 의해 이루어집니다. 다시 말하지만, 상당한 성장 점수는 부정적인 Z 점수 보다 보다 작거나 작은 분자의 그 농도 대 한 긍정적인 Z 점수입니다.
   참고: 분자의 농도 중도에 나타납니다, 분자 예측된 synergizer를 간주 됩니다. 중요 한 성장 점수를 유도 하지 않는 어떤 분자 예측된 비-synergizer입니다.

3입니다. 예측된 시너지 상호 작용의 유효성 검사

1. 예측 된 synergizers의 최소 억제 농도 (MIC)를 찾는.
   1. 37 ° c.에 M9 최소한의 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장
      
   2. >
   4. 
      
   7. 
      
2. 1. 
      
   3. 
      
3. 5. 
      
   6. 
      
4. 
   
   1. 
      
5. 5. 
      
   6. 
      

1. 
   
   2. 
      
2. 1. 
      

결과

바둑판 분석 실험은 공동 성 상호 작용을 측정 하기 위한 반 정량 방법. 최종 점수 출력, FICI, 결정 약물 조합 시너지 (FICI ≤0.5)으로 간주 됩니다, 만약 비-상호 작용 (0.5 < FICI < 4), 또는 대립 (FICI ≥4.0). 그림 1 에 바둑판 분석 결과에서 마약 그라디언트를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 일반적인 결과를 보여 줍니다. 성장을 (보라색 우물) 90% 성장 억제 보다 적게 표시 하는 것이 좋습니다. 각 접시에서의 OD₆₀₀ , 측정 후 우리 정상화는 마약 통제에 모든 잘. 정규화 된 값으로 아무것도 > 0.1 (10% 잘 컨트롤의 OD₆₀₀ 의) "성장"으로 점수입니다. FICI 점수 다를 수 있습니다에 따라 잘 고른 이다; 우리는 각 접시에 대 한 낮은...

토론

시너지 작은 분자 쌍 미생물 감염을 치료에 강력한 도구가 될 수 있습니다 아직 시너지 쌍을 식별 하는 도전 때문에 그들은 그들의 전체 임상 잠재력을 도달 하지 않은. 이 문서에서는 간단한 없음을 조합 보다 훨씬 빠르게 상승 쌍을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 화학 유전학 데이터 집합을 사용 하 여 O2M 다음 시너지 쌍을 예측 하기 위해서는 화면 큰 라이브러리 작은 분자의 판독으로 사용 될 수 있는 유전자 knockouts와 돌연변이 식별 합니다. 작은 분자를 예측 하는 능력에 시너지 파트너의 대규모 식별에 게 스크린, 높은 확장성에 대 한 수 있습니다. 확인 후 시너지 쌍, 명료 하 게 하는 분자 메커니즘 기본 시너지 상호 작용, 다음 합리적으로 디자인 추가 시너지 쌍¹¹수 하나.

O2M 화학 유전자 데이터 집합 및 알려진된 시너지 쌍을 필요합니다. 다행히, 화학 유전학 데이터 집합은 다양 한 미생물^1...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bioscreen C	기기	성장 곡선 미국
시너지 H1	기기	BioTek
M9 국물	시약	Amresco	J863-500G
카사미노 산	시약	Fisher Scientific	BP1424-500
포도	시약	시그마	G7021-10KG
니코틴산	시약	Alfa Aesar	A12683
티아민	시약	Acros Organics	148991000
CaCl2 Dihydrate	시약	Fisher	C79-500
MgSO4 Heptahydrate	reagent	Fisher	M63-500
chemical-genetics dataset	dataset	examplesexamples: Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014 등 본문에 인용되어 있습니다.
트리메토프림 (예시 입력 약물; 모든 약물 사용 가능)	시약	Fisher Scientific	ICN19552701
설파메톡사졸 (예시 테스트 약물; 모든 사용 가능)	시약	Fisher Scientific	ICN15671125