매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

요약

팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Vivo에서, 팁 성장 하는 식물 세포의 물리적 장벽; 시리즈를 극복 하기 위해 필요한 그러나, 연구 방법론 등 제한적인 조건에서 세포 행동을 시각화에 부족 합니다. 이 문제를 해결 하려면 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 기판에 성장 챔버 팁 성장 식물, 마이크로 조작 좁은 간격 (~ 1 μ m)의 시리즈를 포함 하는 셀에 대 한 개발 했습니다. 이 투명 한 소재를 사용 하면 시간 경과 영상에 의해 microgap 침투 하는 동안 개별 셀에 팁 신장 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 그들은 관통는 microgap 꽃가루 관의 형태학 변화 관찰이 실험 플랫폼을 사용 하 여 합니다. 우리이 과정 붙일 레이블된 식물 핵의 모양에 동적 변화와 꽃가루 관에서 정자 세포를 점령. 또한, 우리 1 µ m 간격 침투 루트 머리카락과 모스 protonemata의 기능을 시연 했다. 이 체 외에 플랫폼은 물리적으로 제한 된 공간에 개별 세포 응답을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 팁 성장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서론

낙인에 꽃가루 곡물 발 아, 후 각 곡물 계란 세포 및 중앙 셀 더블 수정에 대 한 난에 정자 세포를 운반 단일 꽃가루 관을 생성 합니다. 꽃가루 관 스타일을 통해 연장 하 고 결국은 난을 도달 하는 그들의 방법¹에 따라 여러 지도 신호를 감지 하 여. 신장, 동안 꽃가루 관 발생 하는 일련의 물리적 장벽; 전송 추적 셀, 채워집니다 그리고 꽃가루 관 그들의 대상 (그림 1A)²도달 하 난의 분 micropylar 개통을 입력 해야 합니다. 따라서, 꽃가루 관은 그들의 주위에서 압축 스트레스를 견 뎌 하는 동안 물리적 장애물을 관통할 수가 있어야 합니다. 루트 머리 포장된 토양 입자 (그림 1B)의 형태로 환경에서 물리적 장애물을 견딜 해야 합니다 팁 성장 하는 식물 세포의 또 다른 유형입니다.

꽃가루 관의 다양 한 기계적 특성 연구, turgor 압력 및 영역의 셀의 꼭대기, 초기 plasmolysis^3,방법⁴ 와 셀룰러 힘 현미경 검사 법을 사용....

프로토콜

1. PDMS Microdevice 꽃가루 관 성장 검사의 제작 및 Protonemata 이끼

참고: 우리는 실리콘 웨이퍼에 PDMS 몰드를 준비 하 maskless 사진 평판 장비를 사용. 시스템의 운영에 관한 세부 사항은이 원고에서 생략 됩니다. 표준 사진 평판 기술은⁹ 는 포토 마스크를 사용 하 여이 원고에 설명 된 PDMS 몰드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.

1. 11g 사전 폴리머 PDMS 혼합물을 부 어 (탄성 기본: 10: 1의 비율로 경화제) 각 4 인치 형으로.
2. 형 단계 1.1 진공 챔버에 20 분에 드
3. 비 대류 오븐에서 90 분 65 ° C에서 경화 후, 금형에서 PDMS 레이어를 껍질 하 고 생 검 펀치를 사용 하 여 유체 채널에 액세스 구멍을 펀치.
   참고: 꽃가루 관 장치에 대 한 구멍의 크기는 암 술의 직경을 반영 하기 위해 조정 될 해야 합니다. 이 값이 따라서 종에 의해 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 우리는 암 술만 위한 1 m m 구멍 및 액체 중간 저수지에 대 한 1.5 m m 구멍 찍 었다고. 모스 protonemata 장치는 4mm 구멍 샘플 저수지에 대 한 사용 되었습니다.
4. PDMS 층 ....

결과

그림 1에서 볼 수 있듯이 팁 성장 하는 식물 세포에서 발생 하는 일련의 그들의 성장 경로 비보따라 물리적 장벽. 미세 체 외에서 세포 문화 플랫폼이이 연구에 사용 검사는 성장 하는 팁의 세 가지 유형의 1 µ m 인공 격차 (그림 3를 통해 식물 세포 (꽃가루 관, 루트 머리, 및 모스 protonemata)에서 프로세스 그림 4, 그림 5). 꽃가루 관 연구에 대 한 라이브 셀 이미징 꽃가루 관 뿐만 아니라 식물 핵의 꼭대기 지역에 형태학 상 변화 및 발생 (보충 영화 1, 2)는 매우 작은 공간에 대 한 응답에서 정자 세포 모니터링 하 사용 되었다.

토론

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 위의 결과 얻기 위해 정확 하 게 지켜질 필요가 있다. 첫째, PDMS 층 및 유리 하단 접시 표면 둘 다 대우 되어야 한다 플라즈마로 충분 한 양의 결합 하기 전에 시간에 대 한. 그렇지 않으면, 팁 성장 세포는 microgaps를 건너는 동안 PDMS 층 유리 표면에서 분리 로컬 수 있습니다. 루트 머리와 모스 protonemata 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 microdevice의 살 균입니다. 일반적으로, 루트 머리카락과 모스 protonemata 세포는 몇 주에 대 한 교양은 microdevice에 있이 필요가 있다. 없이 장치를 살 균, 미생물은 이러한 팁 성장 세포의 성장에 영향을 미칠 수 번성 수 있습니다. 실험 반나절 내 결론은 꽃가루 관 장치의 살 균, 중요 하지 않습니다. 우리는 정기적으로 살 균 없이 꽃가루 관 장치를 사용 하 고 실험 하는 동안 어떤 바람직하지 않은 효과 관찰 하지 않았다.

아닌 디자인 관심사의 세포에.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PDMS	다우코닝	실가드184
무라시게 & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm 유리 바닥 접시	Matsunami 유리	D210402
35 mm 유리 바닥 접시	Iwaki	3971-035
수술용 블레이드	Feather	No.11
생검 펀치	Harris		Uni-Core
젤 로딩 팁	Bio-Bik	124-R-204
도립 현미경	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		이 맞춤형 현미경
에 대한 카탈로그 번호를 사용할 수 없습니다.MetaMorph 이미징 소프트웨어	분자 장치