샘플링 전략 및 돼지 생물 의학 모델에서 Biobank 조직 샘플의 처리

요약

실용적인 응용 프로그램 및 다운스트림 분석 biobank 프로젝트에서의 광범위 한 스펙트럼에 대 한 돼지 동물 모델의 대표적인 조직 샘플의 세대를 위한 방법의 성능을 시연, volumetry를 포함 하 여 체계적인 무작위 샘플링 그리고 차동 질적 및 양적 형태 론 적과 분자 분석 유형에 대 한 조직 샘플의 처리.

초록

변환 의료 연구에서 돼지 모델 꾸준히 더 인기가 되고있다. 특히 유전자 변형된 돼지의 개별 동물의 높은 가치를 고려 하 고 모델과이 모델의 사용 가능한 동물의 자주 제한 수, 적절 하 게 처리 조직 샘플의 (biobank) 컬렉션의 설립에 적합 한 샘플링, 시간 시점에서 지정 되지 않은 분석을 포함 하 여 후속 분석 방법의 광범위 한 의미 있는 접근을 활용 모델의 변환 값을 나타냅니다. 돼지 해부학의 특성에 관하여 포괄적인 지침 최근 대표, 다른 돼지 장기와 조직에서 높은-품질 샘플의 표준화 된 세대에 대 한 설립 되었습니다. 이러한 지침의 결과 다른 연구와 조사 사이 그들의 comparability 재현성에 대 한 필수적인 전제 조건은 없습니다. 기본 데이터, 장기 무게 볼륨, 결정의 샘플링 위치와 조직 샘플의 숫자의 생성으로 그들의 방향, 크기, 처리 및 트리밍 방향, 녹음 관련 요인이 가해질 및 분자, 질적, 양적 형태소 분석에 대 한 견본의 유용성을 결정. 여기, 한 설명, 실용적인, 단계별 데모의 가장 중요 한 기술 담당자의 세대에 대 한, 돼지 조직에서 다목적 biobank 견본 제공 됩니다. 여기에 설명 된 방법이 포함 기관/조직 볼륨 및 밀도, 조직의 수축의 넓이의 포인트-세기, 결정에 의해 parenchymal 장기에 대 한 볼륨-가중치 체계적인 무작위 샘플링 절차의 응용 프로그램 결정 샘플, 및 "Orientator" 및 "Isector" 방법, 및 수직 제복에 의해 생성 된 균일 한 임의의 등방성 (IUR) 섹션 등 양적 stereological 분석에 대 한 무작위로 지향 샘플 세대의 조직학 포함 관련 무작위 (VUR) 섹션입니다.

서론

변환 의학, 돼지는 점점 사용을 위해 일반적으로 큰 동물 모델^1,2,3,,45는 돼지 사이의 여러 유리한 유사성 때문과 인간 해부학 및 생리학, 및 설립된 분자 생물학적 방법의 세대에 대 한 허용 여부 맞춤, 유전자 변형 돼지 질병 조건^1,4의 넓은 범위에 대 한 모델.

그러나, 설치류 모델에 비해, 동물 실험에 대 한 언제 든 지 제공 될 수 있다 각각 돼지 모델의 수가 제한 됩니다. 이것은 약 1 년, 그리고 돼지 모델 및 축산의 생성에 필요한 금융 및 시간 집중적인 노력 돼지 세대 간격. 따라서,이 돼지에서 생성 될 수 있는 샘플으로 서 돼지 모델의 개별 동물 들은 매우 귀중 한 유전자 변형 돼지 모델 및 장기 실험 문제 (예를 들면, 늦은 합병증의 경우에 특히 만성 질환) 세 개인^2,,67에 검사 합니다.

모든 연구 과정에서 연구의 초기 실험 설계에 예정 하지 했다 추가 분석의 성능 수 나중으로 판명 관련, 예를 들어, 이전에서 발생 하는 별개 질문 발견 주소 예기치 않은 결과. 이러한 추가 실험에 대 한 적합 한 샘플을 사용할 수 없는 경우 disproportionally 높은 비용과 시간이 많이 소요 비용 추가 돼지와 조직 샘플을 생성 하는 데 필요한 수 있습니다. 그런 우발적 사건을 위해 준비 되, 다른 기관, 조직, 또는 바이오-액체, 양적 및 질적으로 후속 분석의 광범위 한 적합의 보존 백업 샘플 biobank 컬렉션의 중요 한 여겨진다 접근^2,,67. 돼지 동물 모델에서 최적의 혜택을 파생, 적절 한 biobank 샘플의 가용성 또한 가능성을 제공 합니다 독특한 멀티 기관 수준에 동일한 샘플 자료에 광범위 한 다양 한 분석 방법 수행 하는 매우 동일한 개별 동물, 예를 들어, 다른 작업 그룹의 과학자 샘플의 유통 조직 연구 네트워크^2,,67. 또한, biobanking에 '앞 ' 샘플링 전략 연구에 필요한 동물의 수의 감소에도 기여 한다. 돼지 모델 biobanking의 장점은 최근 다 기관, multiomics 연구, 검사 기관에서에서 입증 되었습니다에서 뮌헨 MIDY 돼지 Biobank 표본을 사용 하 여 장기 당뇨병의 유전자 변형된 돼지 모델에서 크로스 토크 ².

일반적으로 안정성과 이후에 수행된 분석의 결과의 판독을 준수 해야 합니다 biobank 샘플 몇 가지 필수 요구 사항이 있습니다. 샘플 reproducibly, 생성 해야 합니다 그리고 그들은 대표 해야 합니다, 즉, 적절 하 게 반영 하는 샘플⁷에서 찍은 조직/기관의 관심이 형태학 및 분자 기능. 다운스트림 분석 종류의 넓은 범위에 적합 될, 샘플 되어야 충분 한 수량에 촬영 하며 설명 포함 하 여 다른 분석 방법의 요구 사항 (시간 및 온도 조건 등)에 따라 처리 histopathological 분석, cryohistology, 파라핀 및 플라스틱 조직학, immunohistochemistry, 제자리에서 교 잡, ultrastructural 전자 현미경 분석, 임상 실험실 뿐만 아니라 분자 진단 분석 등 DNA, RNA, 단백질, 및 대사 산물의 분석.

수 있도록 다양 한 숫자, 볼륨, 길이, 또는 독특한 조직 구조의 표면 영역 같은 뚜렷한 양적 형태학 매개 변수 평가 대 한 양적 stereological 분석에 의해, 무작위로 섹션의 비행기는 각각 장기/조직의 조직학 샘플^7,,89,,1011준비를 해야 합니다. 양적 형태학 연구, 조직, 기관, 또는 기관 구획의 총 볼륨의 정확한 결심에에서 샘플 (즉, 참조 공간)에서 찍은 결정적으로 중요 한^{7,9 , 12} 각 기관, 조직, 또는 유기 체 내에서 관심이 매개 변수의 절대 수량 계산 하. 결국, 조직학 단면도의 준비 하는 동안 포함-관련 조직 수축 효과 결정 하 여 계정¹³에 있다. 따라서, 이전 연구에서 보관 된 샘플 (고정 조직 샘플, 임베디드 조직 블록, 조직학 단면도, 등등)의 특히 양적 stereological 분석은 때때로 심각 하 게 제한 하거나 심지어 불가능 한¹², 특히 각 기관/조직의 volumetry 수행 되지 않았습니다, 아니 적절 한 샘플링 디자인 영장 대표 샘플을 숫자와 양의 사용 가능한 개별 샘플 충분 하지 않은 경우에 적용 하는 경우 또는 경우의 처리는 샘플의 양적 형태학 매개 변수 추정과 호환 되지 않습니다. 매니폴드 가능한 영향을 미치는 요인으로 인해 뚜렷한 양적 형태학 매개 변수 분석에 대 한 아카이브 샘플 자료의 적합성 명백 하 게 답을 수 없는, 그러나 각 개인적인 케이스의 신중한 평가에 따라 달라 집니다.

따라서, 위치, 크기, 숫자, 처리, 트리밍, 방향과 샘플의 후속 분석의 결과 영향을 줄 것 이다, 이러한 요인 매우 중요 하 고 어떤 연구의 실험 설계에 고려 되어야 한다. 이러한 측면 및 돼지 해부학, 돼지에 적응된 동물 모델 설립 되었습니다 최근, 포괄적인, 상세한, 대규모 샘플링 지침의 특수 기능 표준화, 재현성에 대 한 강력한 참조를 제공 하 그리고 50 개 이상의 다른 돼지 장기와 조직^6,7에서 중복, 적절 하 게 처리, 높은-품질의 효율적인 생성.

방법론 설명 및 현재 문서에 표시 된 비디오 튜토리얼 제공, 설명, 이해할 수 있는, 단계-의해 단계를 지시 volumetry를 위한 기술의 다양 한의 실제 성능에 대 한 돼지 직물의 샘플링 및 장기, 고 다른 다운스트림 분석 방법에 대 한 조직 샘플의 처리. 관련 조직의 3 차원 수축 량의 크기의 결정을 포함 하 여 추천된 기술 기관/조직 볼륨 및 Archimedes 및 Cavalieri⁹의 원칙에 따라 밀도의 결정에 대 한 메서드를 포함 합니다 조직학 검사에 대 한 처리 하는 동안 다른 포함 미디어¹⁴ 에 포함, 실용적인 볼륨 가중치 체계적인 무작위 샘플링의 응용 프로그램, 샘플된 조직 표본에 대 한 처리 접근 다른 후속 분석^7,8,,915및 적절 하 게 지향 및 잠재적인 양적 stereological 분석^{7,8, 샘플 처리 9,,1011}. 돼지 biobank 프로젝트에 응용 프로그램, 옆 시연된 메서드는 일반적으로 장기/조직의 양적 조직 형태학 속성을 검사 하는 모든 연구에 대 한 적절 한. 또한, 체계적인 무작위 샘플링 디자인은 분자 분석 방법을 사용 하 여 풍부한 변경의, 예를 들면, RNAs, 단백질, 또는에서 대사 산물을 검출 하는 실험에서 대표 샘플의 세대에 대 한 특히 유용 각종 기관 및 조직입니다.

다음 단락에서는 그들의 실질적인 성능을 프로토콜 섹션에서 설명 하는 동안 이러한 방법에 대 한 간략 한 소개를 제공 합니다.

기관/조직 볼륨의 결정
장기 무게와 볼륨의 결정은 여러 실험 설정에서 중요 한으로 이러한 요소를 나타낼 수 있습니다 변경, 잠재적으로 관련 된 실험적으로 시험 관심의 요인. 기관/조직의 총 볼륨 또한 일반적으로 절대 양적 매개 변수 (예:, 전체 휴대폰 번호), stereologically 예상된 숫자 볼륨 밀도 (즉, 볼륨 단위 당 세포의 수에서 계산 하는 데 필요한 조직)의^7,12. 컴퓨터 단층 촬영, 같은 복잡 한 기술적인 장비를 사용 하 여 기술을 제외 하 고는 기본적으로 일반적으로 기관 또는 조직의 절대 볼륨을 결정 하는 데 사용 하는 세 가지 실용적인 방법. 장기의 볼륨 "직접 체적 측정" Archimedes, 즉의 원칙에 따라, 물 또는 염 분 완전히 빠져들 때 구조에 의해 난민의 볼륨을 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, comparably 대형 돼지 장기에 대 한 이러한 접근은 허무 하 고 경향이 부정확성, 이후 그들은 매우 큰 체적/측정 플라스 크를 필요로. 더 편리 하 게,의 기관/조직 볼륨의 무게와 밀도^7,,1216, 효율적으로 "침수 방법"^{7,12 사용 하 여 결정 될 수 있는 산출 될 수 있다 ,16} (프로토콜 단계 1.1.). 기관/조직 볼륨 (1598-1647) "Cavalieri의 원칙"에 따라 volumetry 접근을 사용 하 여 추정 또한 수 있습니다. 간단한 기간에서는, Cavalieri 원칙 상태, 두 개체는 접지 평면에 평행한 평면에 구분 하 고 섹션의 프로필에 해당에 두 개체를 극복 하는 경우 지 면에서 거리는 동일한 지역, 두 개체 동일한 볼륨이 있다. 따라서, 임의로 모양의 개체의 볼륨 병렬, 동등 하 게 먼 섹션 평면 및 단면 평면 사이의 거리에 그들의 섹션 프로필 분야의 제품으로 추정 될 수 있습니다. 이것은 다음과 같은 비유를 이해할 수: 동일한 동전 같은 수로 구성 된 두 개의 스택을 병행 하 여, 서로 양보는 동전, 스택과 다른 원통 모양 모양 스택 동전 질서와 하나의 스택 배치 됩니다 고려 오프 센터 코인의 스택 위치 동전 (그림 3A). 두 동전 더미의 형태는 다른, 그들의 볼륨 동일 합니다, 이후 두 스택의 해당 수준에서 동전의 영역 (즉, 병렬 섹션의 프로필 영역에서 동등한 거리에서 두 동전 스택을 통해 잘라는 접지) 같습니다. 돼지 장기 및 조직 Cavalieri 원리^7,,1215 를 사용 하 여 볼륨의 추정 단계 1.2에서에서 설명 되어 있습니다.

조직학 포함 관련 조직 수축의 범위 결정
조직학 직물 단면도에서 측정 된 여러 양적 형태학 매개 변수 분석, 포함-관련 조직 수축 조직 조직학에 대 한 처리 중에 발생의 효과 결정 하 고 고려 한다. 포함-관련 조직 수축 범위 변수를 있을 수 있습니다 그리고 모두 처리, 조직과 포함 중간^{8,,1317,,1819}에 따라 달라 집니다. 포함-관련 변경 사항 (즉, 주로 수축) 조직 샘플의 볼륨의 공간, 및, 따라서, 양적 stereological 분석^{8에 의해 모든 차원 매개 변수 추정의 모든 3 개 차원에서 발생 하는 일반적으로,} . 기본적으로, 단계 1.3에서에서와 같이 포함-관련 조직 수축, 선형 조직 수축 계수 (f_S)로 표현 된 범위 추정 수 있습니다. 그리고 (수축 구분) 양적 형태학 매개 변수¹⁴의 수정에 대 한 사용.

기관/조직의 체계적인 무작위 샘플링 볼륨 가중치
돼지 장기/조직 샘플의 biobank 컬렉션의 설립에 대 한 볼륨 가중치 체계적인 무작위 샘플링 방법과 같은 2 단계에서 설명한 입증 실용적, 시간-절약 및 효율적인 기술 대표의 생성에 대 한 다목적 조직^7,8,,915샘플링합니다.

Stereological 정량 분석에 대 한 임의의 균일 한 등방성 섹션 및 임의의 유니폼 수직 섹션의 세대
Biobank 조직 샘플 매개 변수를 적절 하 게 준비 된 표본 없이 확인할 수 없습니다 그의 최대의 견적에 대 한 다른 양적 stereological 분석 방법의 넓은 범위에 적합 해야 합니다. 거의 모든 양적 stereological 매개 변수, "등방성 (독립) 획 일 한 무작위 (IUR) 섹션"^8,9를 사용 하 여 결정 수 있습니다. IUR 섹션에서 조직 샘플의 섹션 평면 3 차원 방향 무작위입니다. "Isector" 방법¹¹ (3.1 단계 프로토콜), 또는 단면 평면을 기준의 방향의 랜덤 적용이 섹션 비행기의 위치를 기준으로 조직 샘플의 위치는 랜덤에 의해 달성 될 수 있다는 "Orientator" 방법¹⁰ (프로토콜 단계 3.2)에서 조직 샘플 피부 또는 점 막 견본 표시는 또는 정의 자연스럽 게 존재 하 고 제대로 식별 수직 축, "수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션"의 준비 등 조직 샘플에서 (프로토콜 단계 3.3.)의 평면 내에서 엄격 하 게 구분 그들의 수직 축은 유리^8,20입니다. IUR/VUR 샘플링의 이론적 기초 및 잠재적인 다운스트림 양적 stereological 분석에 대 한 포괄적인 논의의 완전 한 담 론에 대 한 관심이 있는 독자 양적 stereology 인생에서의 교과서 라고 과학^8,9.

프로토콜

모든 방법을 설명 여기 죽은 동물에서 파생 된 조직 샘플을 사용 하 고 동물 복지의 독일 법적 규정 준수.

1입니다. Volumetry

1. 조직/기관 밀도의 결정에 대 한 침수 기법 (그림 1 및 그림 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. 재료 준비: 메스 블레이드, 종이 타 올, 고급 집게, 표준 실험실 저울, 유리 또는 플라스틱 비 커, 0.9% 식 염 수, 그리고 자체 생성 된 견본 홀더 (그림 2A).
   2. 직물의 조각을 소비 세 (최대 크기: 2 x 2 x 2 cm³) 기관/조직, 특히 관심의 기관 실에서에서에서. 뇌 하 수 체, 뇌의 송과선, 등 작은 기관은 측정 토토이다.
      주의: 샘플의 크기 특히 비 커 (단계 1.1.5 하 참조), 그리고 단계 1.1.7에서에서 비 커의 내벽을 접촉 하지 않고 샘플의 완전 한 침수를 허용 하도록 그것의 충전 레벨의 내경 보다 작은 있는지 확인 합니다.
   3. 조심 스럽게 면봉 과잉 혈액/조직 액체를 제거 하는 종이 타월로 샘플.
   4. 정밀 규모 샘플 무게와 샘플 (m_S)의 무게를 기록. 가장 가까운 mg (그림 1A) 작은 조직 샘플의 무게를 결정 합니다.
   5. 규모에 실내 온도 0.9% 식 염 수로 채워진 비 커를 놓습니다. 완전히 허용 하기 위해 다음 단계에서 조직 샘플의 침수 범람 없이 비 커를 작성 하지 마십시오.
      주의: 비이 커 크기는 크기와 무게 측정 조직 sample(s)의 규모의 효과적인 측정 범위에 적합 한 사용 합니다. 2 x 2 x 2 cm³큰 샘플에 대 한 50-100 ml 비이 커 크기는 적절 조합에서 500 g 약 100 밀리 그램에서 측정 하는 규모와 작은 샘플을 함께 사용 하 여 조합에서 5-10 mL 볼륨의 비 커와 정밀 저울 약 0.1 mg 20 g 사이 측정 범위.
   6. 표시 된 위치 ( 그림 1B, 그림 2B및 그림 2C에 화살표)에 염 분에 샘플 홀더 (즉, 얇은 철사의 충분히 엄밀한 루프 또는 이와 유사한, 그림 2A) 잠수함. 그런 다음, 다시 (자체) 0 규모의 디스플레이 설정 합니다.
   7. 조심 스럽게 샘플 홀더를 조직 샘플을 첨부 하 고 ( 그림 1B, 그림 2B및 그림 2C에 화살표) 샘플 홀더에 표시 된 위치에 도달할 때까지 완전히 샘플은 염 분에 잠수함.
      주의: 잠긴된 샘플 및 샘플 홀더 없어야 비 커의 하단 또는 염 분의 표면 또는 내부 벽과 접촉 합니다.
   8. 그 자리에 샘플 홀더 및 물속에 잠긴된 샘플을 잡고, 조직 샘플에 의해 전치 하는 염 분의 무게를 언급 (m_L), 눈금에 표시 무게 기록 (그림 1 C, 그림 2B, 그리고 그림 2C)입니다.
   9. 계산 하는 샘플 m_L에서 (V_S)의 볼륨 및 실내 온도 (20 ° C)에 염 분의 밀도 (ρ_{염 분} = 1.0048 g/cm³) V_S m_L= / Ρ_{염 분} [g/g/cm³] (그림 1)입니다.
   10. 무게 (즉, 대량) 샘플 (m_S)와 볼륨 (V_S)에서 조직 샘플 (ρ_샘플)의 밀도 계산: ρ_샘플 = m_S /V_S[g/cm³] (그림 1).
   11. 측정 기관 토토, 3 번 측정을 반복 하 고 단일 측정 값에서 평균 장기 밀도 계산. 큰 장기/조직에 대 한 동일한 기관/조직/기관 구획의 다른 샘플 반복된 측정을 수행 하 고 그에 따라 단일 측정에서 평균 밀도 계산.
   12. 그 무게와 밀도 (그림 1)에서 기관/조직/기관 구획의 전체 볼륨을 계산 합니다.
2. 돼지 장기 볼륨의 결정 위한 Cavalieri 방식 ⁷
   1. 재료 준비: 통치자, 캘리퍼스, 칼가 위, 집게, 방수 펜, 플라스틱 투명, 스캐너, 카메라, 그리고 상호 격자 플라스틱 투명에 인쇄 된 사진.
   2. 일반 표면 (절단 자료)에 전체 기관/조직을 놓고 (그림 3B, 그림 5A) 세로 축 따라 장기의 길이 (l)를 측정 합니다.
   3. 잘라 완전 한 기관/조직 등거리 병렬 조각 직교 경도 기관 축 (그림 3C, 그림 5B). 두 섹션 사이 (즉, 단면 간격/섹션 두께, 보통 대략 1 cm) 조직/기관 석판의 충분 한 번호를 충분히 작은 거리 d 를 선택 합니다. 무작위로 장기의 여백에서 0과 단면 간격 사이의 거리 내에서 첫 번째 섹션을 배치 합니다. 슬 라이 싱, 하는 동안 시각적으로 위치와 대략 균일 한 두께의 약 병렬 기관/조직 석판을 얻기 위해 각 섹션 평면의 방향을 판단.
      참고: 조직/기관 석판의 필요한 수 검사 기관/조직의 크기와 모양에 따라 달라 집니다. 작은 기관 또는 샘플 ≤ 5 mm의 얇은 석판에 구분 될 필요가, agar 단면 이전에 샘플을 포함 (단계 1.3.3 참조) 천 포함 된 샘플의 조각화에 대 한 기술적 장치를 사용 하 여. 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 단면 간격 뿐만 아니라 조각화 장치에 대 한 예제는 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"⁷의 보충 자료에 표시 됩니다.
   4. (즉, 오른쪽 또는 각 기관 슬 래 브, 3D 그림, 그림 5C의 왼쪽된 섹션 평면에 일관 되 게) 가공 기지에 아래로 향하게 동일한 표면에 모든 기관/조직 석판을 놓고 석판 (n)을 계산 합니다.
   5. 다음 방법 중 하나에 의해 조직 석판의 섹션 프로 파일을 얻기:
      1. 신중 하 게 그들의 상위 및 하위 섹션 표면 방향을 유지 하면서 레이블이 표시 된 플라스틱 투명에 조직 슬라브를 놓습니다. 방수 펜 (그림 3E1-2)를 사용 하 여 플라스틱 투명에 조직 석판의 윤곽선을 추적 합니다.
      2. 섹션 표면 (그림 3 층) 위에 수직으로 카메라를 들고 조직 석판의 사진 이미지를 가져가 라. 보정에 대 한 조직 석판 옆 크기 통치자를 놓습니다.
      3. 그들의 상위 및 하위 섹션 표면 (그림 3)의 방향을 유지 하면서 조직 석판 평판 스캐너에 스캔. 보정에 대 한 조직 석판 옆 크기 통치자를 놓습니다.
   6. 다음 방법 중 하나에 의해 모든 조직 석판의 (추적, 촬영, 또는 스캔) 섹션의 영역을 측정:
      1. 오버레이 또는 추적된 기관 슬 래 브 프로필을 적절 한 크기의 첨가, 플라스틱 투명도 및 수 모든 프로필 영역 (3E 그림3-4; 비교 타격 십자가에 동등 하 게 간격 둔된 십자가의 보정된 표 인쇄 그림 5D). 1 십자가에 해당 하는 지역에 의해 프로 파일 영역을 타격 하는 십자가의 수를 곱하여 각 기관 석판의 섹션 프로필 영역을 계산 합니다.
         참고: 충분히 정확한 볼륨을 받을 추정, 인접 한 십자가 사이 충분히 작은 거리와 교차 그리드를 선택, 적어도 100의 평균 교차 되도록 한 기관 연구의 경우에 각 시험의 석판의 섹션 표면 충돌 . 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 크로스 그리드 크기 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"⁷의 보충 자료에 표시 됩니다.
      2. 영역 측정 사진/스캔의 디지털 이미지에서 조직 석판의 사용 하 여 적절 한 상용 또는 프리웨어 morphometry 소프트-및 하드웨어 응용 프로그램 (그림 3 H), 상업 이미지 분석 시스템²¹, 등 또는 ImageJ²².
         주의: 참고 한 조직 슬 래 브 (첫 번째 또는 마지막) 각각 자연 표면에 휴식 하는 스캐너에 배치 됩니다, 그리고 그것의 자연적인 표면 카메라를 얼굴. 따라서,는 스캔 한 이미지,이 슬 래이 브의 사진 이미지, 섹션 표면 표시 되지 않습니다. 따라서, 아무 섹션 영역 프로 파일은이 조직 슬 래 브 (그림 3I)의 스캔 한 이미지/사진 이미지에 측정 됩니다. 또한 참고-프로젝션 스캔 한 이미지와 기관/조직 석판, 즉의 사진에만 실제 섹션 프로필의 아니지만의 슬 래 브 섹션 표면 (그림 12 뒤에 이미지에 조직 영역 측정 G-H).
   7. 계산 영역의 모든 해당 섹션 프로필 사건 당 모든 조직 석판의 합계의 제품으로 추정된 기관 볼륨 (즉, 오른쪽 또는 왼쪽의 일관 되 게 각각, 각 장기의 상위 또는 하위 섹션 표면 슬라브 그리고 석판 (즉, 수직 기관 축 (l)와 석판의 수의 측정된 길이의 몫)¹⁵의 평균 두께.
3. 조직학에 대 한 조직 샘플의 처리 하는 동안 3 차원 포함-관련 조직 수축의 범위 결정
   1. 재료 준비: 톰 블레이드, 집게, 한 천, 금속 주조 금형, 디지털 스캐너, 및 (예를 들어, 그래프 용지) 크기 통치자.
   2. 잘라 고정된 조직 샘플에서 신선한, 평면 섹션 표면.
      참고: 샘플을 사용 하 여 쉽게 변형 (부드러운) 조직 (지방 조직, 젤라틴 조직), 포함 고정된 조직 샘플 한 단면 (그림 4A) 이전에.
   3. Agar에 샘플을 포함:
      1. 미생물학 문화 매체 물에 대 한 적절 한 볼륨으로 사용 된 표준 한 천 분말 믹스 (약 0.5-1 g 한 천/10 물) 유리 비 커에. 혼합물을 저 어 하 고 3-5 미 혼합물을 저 어 하 고 다시 3-5 s에 대 한 종 기를 끓는 때까지 700 W에 렌지에 그것을 열.
      2. 필요한 경우, 조직 샘플을 agar의 대비를 증가, 액체 천, 예를 들어, 검정 잉크와 염료 (뜨거운 액체 agar의 10 mL를 1 mL 잉크를 추가 하 고 적극적으로 볶음).
      3. 주조 금형 (예를 들어, 파라핀 포함, 그림 10A-D에 사용 되는 금형)에 뜨거운 agar를 부 어 따뜻한 agar에 고정된 조직 샘플을 잠수함. 한 천은 응고까지 시원한, 그리고 톰 또는 면도날을 사용 하 여 포함 된 조직으로 한 블록을 잘라 보자.
         주의: 뜨거운 액체 agar를 처리 하는 동안 보호 고글과 장갑을 착용 하십시오. 프로세스 조직 샘플 포름알데히드는 배기 솔루션에서 고정 후드 및 보호 고글과 실험실 장갑을 착용.
   4. 크기 눈금자 함께 평판 스캐너에 직면 하 고 그것의 섹션 표면 샘플을 놓고 섹션 표면 (그림 4AB)를 검색 합니다.
   5. 단계 1.2.6 (그림 4B)에 설명 된 방법 중 하나를 사용 하 여 디지털 스캔에서 고정된 조직 샘플 (_f)의 섹션 표면 영역을 결정 합니다.
   6. 에폭시 (예를 들어, Epon) glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/병 무 청)²³, 다음 표준 프로토콜^23,,2425 (와 같은 플라스틱 포함 매체에 샘플 포함 그림 4C)입니다. 이전 단계 (1.3.4)에서 스캔 고정된 샘플의 섹션 표면 플라스틱 포함 샘플에서 유지 됩니다 확인 하십시오.
      참고: 샘플의 처리 중 섹션 표면 샘플의 방향을 유지, 일관 되 게 포함 카세트 또는 주조 금형으로 아래쪽으로 직면 하 고 그것의 의도 된 섹션 표면 샘플을 배치 하거나 의도 섹션 표시 표면 (또는 샘플의 반대편) 잉크.
   7. 해당 고정된 조직 샘플 (단계 1.3.2)의 원래 섹션 표면 하 플라스틱 블록에서 조직학 섹션을 사용 하 여 잘라 톰 (그림 4D), 유리 슬라이드 (그림 4D)에 섹션을 탑재와 정기적으로 (얼룩 예를 들어, Hematoxylin 및 오신 얼룩, H & E)^24,25.
      주의: 고정된 조직 샘플의 원래 섹션 표면으로 동일한 평면에 조직학 단면도 받을, 단면 전에 신중 하 게는 톰의 마운트에 플라스틱 블록의 위치 조정.
   8. 슬라이드 크기 눈금자 함께 평판 스캐너에 아래쪽으로 직면 스테인드 섹션 배치 하 고 검색 섹션 (그림 4E).
   9. 1.2.6 (그림 4 층) 단계에서 설명한 방법 중 하나를 사용 하 여 디지털 스캔에 플라스틱 포함 조직 샘플 (A_e)의 섹션의 영역을 결정 합니다.
   10. 매체를 포함 하는 플라스틱에 포함 전후 (각 조직과 매체 포함)에 대 한 평균 포함-관련 조직 수축 조직 샘플의 해당 섹션 프로필의 측정된 영역에서 계산 합니다. 선형 수축 량 요인 f_s 의 영역과 매체 (_e)을 포함 하는 플라스틱에 포함 후 n 조직 샘플의 섹션 프로필의 분야의 몫의 제곱근으로 계산 되는 매체 (_f) (그림 4G)를 포함 하는 플라스틱에 포함 하기 전에 동일한 조직 샘플의 해당 섹션 프로필¹⁴.

2. 볼륨-가중치 계산 하 고 다운스트림 분석 종류⁷ 에 대 한 조직 하위의 처리에 의해 체계적인 무작위 샘플링을

1. 재료 준비: 통치자, 캘리퍼스, 칼가 위, 집게, 방수 펜, 포인트/크로스 플라스틱 투명, 및 무작위 번호 테이블에 인쇄 하는 격자.
   참고: 복사 템플릿은 교차 하는 격자 (5-60 m m) "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"⁷의 보충 자료에 제공 됩니다.
2. 기관/조직을 일반 표면 (절단 자료)에 놓고 (그림 5A, 그림 6A) 세로 축 따라 장기의 길이 (l)를 측정 합니다.
3. 잘라 완전 한 기관/조직 등거리 병렬 조각으로 직각의 경도 축 (그림 5B). 두 개의 섹션 (즉, 단면 간격/섹션 두께, 보통 대략 1 cm) 조직/기관 조각의 충분 한 수를 충분히 작은 사이의 거리 d 를 선택 합니다. 무작위로 장기의 여백에서 0과 단면 간격 사이의 거리 내에서 첫 번째 섹션을 배치 합니다. 슬 라이 싱, 하는 동안 시각적으로 위치와 대략 균일 한 두께의 약 병렬 기관/조직 석판을 얻기 위해 각 섹션 비행기의 방향을 판단.
   참고: 조직/기관 석판의 필요한 수의 검사 기관/조직 및 샘플된 조직 위치 수 크기에 따라 달라 집니다. 작은 기관 또는 샘플 ≤ 5 mm의 얇은 석판에 구분 될 필요가, agar 단면 이전에 샘플을 포함 (단계 1.3.3 참조) 천 포함 된 샘플의 조각화에 대 한 기술적 장치를 사용 하 여. 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 단면 간격 뿐만 아니라 장치를 부 러 뜨 리에 대 한 예제는 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"⁷의 보충 자료에 표시 됩니다.
4. 모든 기관/조직 석판 절단 자료 (그림 6B)에 아래로 향하게 동일한 표면에 놓습니다.
5. 오버레이 바깥쪽을 배치 하 여 플라스틱 투명성에 적절 한 크기의 크로스 그리드와 조직 석판 인쇄 남은 격자의 십자가 위 조직 (그림 5C-D, 그림 6B)에서 임의의 포인트.
   참고: 선택 충분히 작은 거리, 인접 한 십자가 사이 십자가 그리드 연구의 각 검사 경우, 적어도 두 번 많은 십자가에 있는 샘플의 수로 샘플링을 조직 구획의 섹션 사용을 칠 것 이다 그 조직 구획에서 가져온. 가장 돼지 장기와 조직에 대 한 경험적으로 추천 크로스 그리드 크기 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"⁷의 보충 자료에 표시 됩니다.
6. 표시 및 모든 십자가 조직 (각각 조직 하위 구획 샘플링 수 하) 타격. 일관 되 게 계산 하 고 각 줄, 오른쪽 왼쪽에서 각각 십자가의 연속 번호 여 예를 들어, 모든 조직 석판에서 샘플링을 조직 구획 타격 십자가의 번호의 유니폼 모드 적용 아래, 또는, 예를 들어, 12 시 위치, exemplarily 5E 그림에서 시연으로 가장 가까운 십자가 함께 시작 하는 시계 방향에서 또 다른 후 하나의 조직 슬 래 브에 십자가 번호 매기기 여 탑.
7. 체계적 샘플링 간격 (i)를 생성 하는 샘플의 수에 의해 수 샘플된 (n) 조직/조직 구획을 명 중 하는 십자가의 수를 나눕니다.
8. 1과 나사이의 간격에 임의의 숫자 x 를 선택 하 여 첫 번째 샘플링 위치를 결정 합니다. 이 위해, 난수 표를 사용 합니다. 첫 번째 샘플링 위치 (x)와 모든 다음 x + i, x + 2나, x + 3, 등, 플라스틱 투명도에 샘플링을 조직/조직 구획 타격 크로스 방수 펜 (그림 5 층)을 사용 하 여.
   참고: 임의의 숫자 테이블 수 편리 하 고 신속 하 게 생성 한 온라인 난수 생성기를 사용 하 여.
9. 태그 위치에 해당 하는 표시 (그림 5G, 그림 6E 핀셋의 쌍을 사용 하 여 조직 슬 래 브의 표면에 깨끗 하 고 빈 색종이 종이의 작은 조각으로 약간 플라스틱 투명도 높이 십자가 조직 ).
10. 샘플링된 위치 (그림 5, 그림 6 층, 그림 7A)에서 직물의 견본을 소비 세 및 추가에 지정 된 대로 후속 분석 (그림 6G, 그림 7A-B)의 종류에 대 한 그들을 세분화합니다 표 1.
11. 샘플링 후 따뜻한 물과 비누, 건조, 플라스틱 투명을 청소 하 고 그들을 다시 사용 합니다.

3. 등방성 균일 한 임의의 (IUR) 및 양적 Stereological 분석에 대 한 수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션의 세대

1. "Isector" 기술
   1. 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 구형 주조 금형 (예, 호두, 제과 업체에서 얻을 수 있습니다에 대 한 금형 주조), 폴드 백 클램프 및 집게.
   2. 체계적으로 임의로 샘플링의 고정, 적절 하 게 크기의 조각 (1 c m³x 1 x 1) 조직 구형 주조 금형에서, 폴드 백 클램프에 의해 함께 개최 장소와 따뜻한 액체 agar (그림 8A-E) 몰드를 채울.
   3. agar의 응고 후 캐스팅 금형에서 agar 영역 (그림 8F)를 제거 합니다.
   4. 한 천 구 롤 테이블에서 포함 된 조직 샘플, 중지, 그리고 임의의 위치에 섹션.
      참고: 결과 섹션 평면은 IUR 섹션 (그림 8F-G)입니다.
   5. GMA/병 무 청, 등 플라스틱 수 지에 조직 샘플을 포함 진행 (1.3.5 참조) 비행기 IUR 섹션의 방향을 유지.
2. "Orientator" 기술
   1. 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 집게, 임의의 숫자 테이블, equiangular, 및 코사인이 중 원의 지문이.
      참고: 복사 템플릿은 서클의 이전 간행물^8,26에 제공 됩니다.
   2. 고정된 조직 (또는 고정 조직의 한 천 포함) 샘플에 배치 equiangular 원의 인쇄 한 가장자리를 가진 병렬 0-180 ° 방향 (그림 9A, 그림 10E).
   3. 임의의 숫자 테이블을 사용 하 여 임의의 각도 결정 합니다. 샘플에 달려 equiangular 원의 규모에 해당 마크를 찾아. 지향 되 고 단면 평면 equiangular 원의 규모에 표시 된 임의의 각도의 방향에 평행한 및 수직 하는 샘플을 통해 (또는 포함 된 조직 샘플을 둘러싼 agar), 섹션 컷 이러한 마크를 사용 하 여는 (그림 9B-C, 그림 10 층) 샘플의 표면 휴식.
   4. 코사인이 중 원에 아래쪽 (그림 9D, 그림 10 H) 1-1 방향에 평행 하 게 배치 하 여 휴식 서피스의 모서리와 직면 하 고 이전 단계에서 생성 된 섹션 표면 조직 블록을 배치 합니다.
   5. 3.2.3 단계를 반복 하 고 임의의 숫자 테이블 (그림 9E-F,-J 10I 그림)를 사용 하 여 결정 임의의 각도로 샘플을 통해 새로운 섹션을 잘라.
      참고: 결과 섹션 평면은 IUR 섹션입니다.
   6. 필요한 경우 1.3 단계에서 설명한 대로 포함-관련 조직 수축 (그림 9G-J)의 결정에 대 한 고정된 조직 샘플의 IUR 섹션 프로 파일의 영역을 결정 하 고 플라스틱에서 조직 샘플을 포함 진행 GMA/병 무 청 등 수 지.
3. 수직 획 일 한 무작위 (VUR) 섹션의 세대
   1. 재료 준비: 면도칼 또는 톰 블레이드, 한 천, 집게, 임의의 숫자 테이블, 및 equiangular 서클의 인쇄.
      참고: 복사 템플릿은 서클의 이전 간행물^8,26에 제공 됩니다.
   2. 후속 단계 샘플/섹션에서 인식할 수 있는 것은 항상 고정된 조직 샘플에서 세로 축을 정의 합니다.
      참고: 일반적으로, 조직 샘플의 자연적인 표면에 수직 축 수직 축으로 선택 됩니다.
   3. 해당 되는 경우는 agar (그림 11B)에 샘플을 포함 합니다.
      참고: 일반적으로 작은, 얇고, 연약한, 또는 부드러운 샘플에 대 한 추천은 한 천 포함 이전 VUR-또는 IUR-단면 고정된 샘플의. 또한 사용 하 여 샘플의 agar 포함 플라스틱 수 지 매체에 샘플의 후속 포함 하는 동안 VUR sectioned 샘플의 위치를 용이 하 게.
   4. 기가 테이블/종이 테이블 (그림 11C)의 평면에 지향 되 고 수직 축 equiangular 원 인쇄에 샘플을 놓습니다.
   5. 샘플 (임의의 번호 테이블을 사용 하 여 결정) 임의의 각도로 섹션 평면 직교 테이블에 잘라내어 VUR 단면 (그림 11D) 받을 수직 축에 평행.
   6. 해당 되는 경우 포함-관련 조직 수축 단계 1.3 ( 그림 9G-J를 비교)에 설명 된 대로의 결정에 대 한 고정된 조직 샘플의 IUR 섹션 프로 파일의 영역을 결정 하 고 진행에서 조직 샘플을 포함 하 GMA/병 무 청 같은 합성 하 수 플라스틱 지

결과

조직/기관 밀도의 결정에 대 한 잠수 기술

그림 12A -B 는 밀도의 대표 결정 돼지 신장 단계 1.1 (그림 1, 그림 2)에서 설명 된 침수 기술을 사용 하 여 볼륨을 보여줍니다. 더 대표 추가 돼지 장기 및 조직의 밀도 측정 결과 표 2에 표시 됩니다. 다양 한 돼지 조직 및 장기의 기준 밀도의 더 포괄적인 목록 "조직 샘플링 가이드에 대 한 돼지 생명 모델"⁷에 표시 됩니다. 침수 메서드를 사용 하 여 가져온 조직 밀도 측정 값의 유효성은 독립적인 견본의 동일한 샘플의 반복된 측정 하 여 추정 수 있...

토론

돼지 동물 모델에서 biobank 샘플 컬렉션의 대표, 중복 조직 샘플의 광범위 한 범위에 적합의 재현할 수 세대의 기관/조직, 결정에 대 한 강력한 기술 및 프로토콜 필요 다른 분석 방법, 그리고 랜덤 양적 stereological 분석에 대 한 샘플 섹션의 방향에 대 한. 현재 문서에서 설명 하는 방법 돼지 장기와 조직의 크기에 적응 하 고 효과적으로 이러한 요구^2,7을 충족 하도록 개발 되었습니다. 그들은 잘 인식된 방법론 원리에 기반 하 고 이전 다른 출판된 연구^2,7,,1221에 그들의 실행할 수 입증. 추천된 방법 대표 샘플의 세대를 위한 그리고 그렇지 않으면 확인할 수 없는 매개 변수 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agar	Carl Roth GmbH, 독일	한천(분말), Cat.: 5210.3	유리 또는 플라스틱 비이커에 10ml의 찬물에 약 1g의 한천을 녹이고 전자레인지에서 700W로 가열한 다음 용액을 엄격하게 저어주면서 두 번 끓입니다. 아직 따뜻할 때 곰팡이에 던지고 굳히십시오. 주의: 뜨거운 액체 한천으로 취급하는 동안에는 보호용 고글과 장갑을 착용하십시오.
캘리퍼스	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	모든 종류의 캘리퍼(기계 또는 전자식)도 사용할 수 있습니다.
주조 금형 (금속)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, 독일	Einbettschä lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5mm, Cat.: 14302b	파라핀 임베딩에 사용되는 다른 종류의 금속 주조 금형도 마찬가지입니다.
크로스 그리드(5mm - 6cm)의 복사 템플릿	n.a.n.a	.	크로스 그리드(5mm - 6cm)의 복사 템플릿은 Albl et al. 의 추가 데이터 파일에 제공됩니다. 톡시콜 파톨. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
등각 및 코사인 가중 원의 복사 템플릿	n.a.n.a	.	등각 및 코사인 가중 원의 복사 템플릿은 Nyengaard & 군데르센. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) 및 Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. 에서: Haschek 및 Rousseaux´ s Handbook of Toxicologic Pathology(독성 병리학 핸드북). 3판, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
폴드백 클램프(YIHAI 바인더 클립, 15mm 및 19mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., 중국	Y10006 및 Y10005	다른 유형의 표준 사무실 폴드백 클램프도 사용할 수 있습니다.
겸자 (해부학적)	NeoLab Migge GmbH, 하이델베르크, 독일	NeoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	모든 유형의 해부학적 겸자가 가능합니다.
포름 알데히드 용액 4 %	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	포름 알데히드 37/40 %, 카탈로그 : 1000411525005	농축 용액에서 4 %로 희석합니다. 중성 pH에 대한 완충액. 적절한 눈, 손 및 호흡기 보호구를 착용하십시오. 배기 후드 아래에서 포름알데히드 용액으로 고정된 조직 샘플을 처리하고 보호용 고글과 실험실 장갑을 착용합니다.
그래프 용지(교정용)	Bü romarkt Bö ttcher AG, 예나, 독일.	www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	모든 유형의 그래프 용지(밀리미터 단위로 축척)가 가능합니다.
실험실 비커 (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, 하이델베르크, 독일	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	5 – 100 ml 용량의 모든 종류의 유리 또는 플라스틱 비커가 가능합니다.
실험실 규모	Mettler Toledo GmbH, Gieß en, 독일	PM6000	측정 범위가 0.1 mg에서 약 20 g 사이, 각각 100 mg에서 약 500 g 사이인 모든 표준 실험실 저울은
	. 독일 팅겐	BP61S
마이크로톰 블레이드	엥겔브레히트 메디진 & Labortechnik, Edermü nde, 독일	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	모든 종류의 일회용 마이크로톰 블레이드가 가능합니다.
형태 측정 / 플라 니메트리 소프트웨어 / 시스템	국립 보건원 (NIH)	ImageJ	https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997)에서 다운로드.
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM 이미지 분석 시스템	품절
사진 카메라	Nikon	D40	삼각대에 장착할 수 있는 모든 종류의 디지털 사진기가 가능합니다.
플라스틱 투명 필름	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	모든 (레이저) 인쇄 가능한 플라스틱 투명도가 가능합니다.
난수 테이블	n.a.n.a	.	난수 테이블은 다음과 같은 난수 생성기를 사용하여 편리하게 생성 할 수 있습니다 (정의 된 수의 난수 및 정의 된 간격 내에서). https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	모든 종류의 면도날이 가능합니다.
통치자	Bü romarkt Bö ttcher AG, 예나, 독일. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	모든 종류의 cm-mm 스케일 눈금자도 사용할 수 있습니다.
식염수 (0.9 %)	Carl Roth GmbH, 독일	나트리움 클로리드, >99 % 카탈로그 : 0601.1	0.9 % 식염수를 준비하려면 9>C에서 1000ml의 증류수에 NaCl을 용해합니다.
메스 블레이드	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN 수술용 블레이드 N° 22	어떤 종류의 메스 날이든 가능합니다.
스캐너	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	150-600dpi의 해상도로 스캔할 수 있는 모든 유형의 표준 사무용 스캐너가 가능합니다.
슬라이싱 장치	n.a.n.a	.	자체 제작 슬라이싱 장치의 예는 Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) 및 Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)의 보충 데이터 파일에서 찾을 수 있습니다.
구형 주조 금형 (예 : 직경 25.5mm)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5mm	구형 주형 주형은 자체 제작하거나 다른 제과 공급 업체 (프랄린의 경우)에서 얻을 수 있습니다. 여기에 표시된 주조 금형은 실제로 중공 프랄린 본체의 패키지/포장입니다(먼저 프랄린을 먹은 다음 i-섹터 섹션 생성을 위해 패키지를 사용).
얇은 와이어	Basteln & 취미 Schobes, Straß 독일의 푸르스. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	다른 종류의 얇은 와이어도 사용할 수 있습니다.
티슈 페이	NeoLab Migge GmbH, 하이델베르크, 독일	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	다른 종류의 실험실 티슈 페이퍼도 사용할 수 있습니다.
방수 펜	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nü rnberg, Grmany	Lumocolor 영구 313, 0.4mm, S, 검정색, Cat.: 313-2	다른 종류의 방수 펜도 마찬가지입니다.