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방법 논문

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

6.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57290

⸱

2018년 2월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2UMR7104, Centre National de la Recherche Scientifique, 3U964, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 4Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .

초록

Embryogenesis, 동안 셀 셀 행동의 동적 변화를 받아야 하 고 개발 생물학의 분야에서 근본적인 목표는 이러한 변화 뒤에 세포 논리를 해독 합니다. Photoconvertible 단백질의 개발과 발견은 크게 주 었 이러한 동적 변화에 대 한 우리의 이해 광학 세포와 조직을 강조 하는 방법을 제공 하 여. 그러나, 동안 photoconversion, 시간 경과 현미경 및 후속 이미지 분석 뇌 또는 눈 등 장기 잠복 세포 역학에 매우 성공적인 것으로 입증 되었습니다,이 방법은 일반적으로 사용 하지 않습니다로 인해 개발에 심장 주기 동안 심장의 빠른 움직임으로 인 한 과제. 이 프로토콜은 두 부분으로 구성 됩니다. 첫 번째 부분에서는 photoconverting 및 이후 zebrafish 것 운하 (AVC)와 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀 (EdCs)를 추적 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 일시적으로 마음 자리를 정확 하 게 photoconversion에서 마약을 중지 포함 한다. 마음 다시 시작할 수 있습니다 약물 및 배아 개발의 제거에 따라 박동 EdCs 발달 시간 나중에 photoconverted의 고해상도 이미징 마음 다시 중지 될 때까지 정상적으로 계속. 프로토콜의 두 번째 부분에 2 차원 지도 3 차원 구조에서 형광 신호를 매핑하여 젊은 배아에서 AVC에서 photoconverted 또는 비 photoconverted 영역의 길이 계량 하는 이미지 분석 방법을 설명 합니다. . 함께, 프로토콜의 두 부분 기원 그리고 zebrafish AVC 및 것 심장 밸브, 구성 하 고 돌연변이, morphants, 또는으로 치료 배아 연구에 대 한 잠재적으로 적용할 수 있습니다. 있는 셀의 동작을 수 AVC 및 밸브 개발을 방해 하는 시 약

서론

Zebrafish는 현재 셀룰러 및 발달 과정에 vivo에서공부 하는 가장 중요 한 척추 모델 중 하나입니다. 이것은 크게 zebrafish의 광학 투명도 그리고 유전학, 그것에 게 유전으로 관련 된 광학 기술을 적용 하기 위한 강력한 모델을 순종 인코딩된 photoresponsive 단백질 기술1. 특정 심장 개발의 연구, zebrafish 받을 충분 한 산소 보급을 통해 하트 비트 없이 돌연변이 분석을 허용 하는 발달 유전자 교란된 효과에 개발의 첫 번째 주까지 살아남을 수 있는 그런 심장 morphogenesis 대부분 척추 동물2가능 하지에 혈액 흐름.

Zebrafish 심장 관 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된다. 그것의 대형 조금 후에 심장 튜브 적극적으로 치고 시작 합니다. 36에 의해 hpf, 분명 수축 분리는 심 실에서 심. 수축의이 지역에서에서 호출 됩니다 것 운하 (AVC), 그리고이 지역의 변화에 셀 편평 형태학 cuboidal 형태3. Zebrafish 것 밸브 morphogenesis 시작 약 48 h 수정 게시. 5 일에 의해 게시물 수정, 두 개의 밸브 전단지는 AVC로 확장 하 고 심장 주기4안마당에는 심 실에서 혈액의 역류를 방지. AVC 및 밸브 형성 동안 셀 추적으로 심장의 빠른 박동 어려운 전통적인 시간 경과 현미경5,6을 통해 셀을 따라 도전적 이다. 말 외., 20167에서 적응이 프로토콜 Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질이 표시 됩니다를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 내 피 세포는 endocardium입니다. 약 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM)는 심장 박동, hpf, photoconverted EdCs 특정 발달 시간 점에서 고해상도 영상 36와 55 사이 EdCs의 정확한 photoconversion 수 있도록 일시적으로 중지 하는 데 사용 됩니다. 그것은 이전 보였다 EdCs photoconverted이이 메서드를 사용 하 여 photoconversion7시간 후에 5 일 이상 그들의 비전향된 이웃에서 구별할 수 유지 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoconverted EdCs 48 보다 어린 배아에서의 이미지 분석에 사용 되는 방법 내용을 hpf, 성공적으로 AVC 개발 (Boselli 외., 언론에서)9동안 조직의 움직임을 수행 하는 데 사용 되었습니다. 우리는 독자 것입니다 찾을 바랍니다이 프로토콜 유용한 AVC 및 밸브 개발 정상적인 배아, 그리고 돌연변이, morphants, 또는 약물 치료 배아 연구. Zebrafish 개발 하는 동안 photoconvertible 단백질을 사용 하 여 셀 추적에 관련 된 보다 일반적인 프로토콜 롬 바르도 외., 201210에 의해 문서를 참조 하십시오.

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프로토콜

1. 금형을 준비 하 고 장착 agarose

  1. 3D 프린터 또는 전통적인 기계 워크숍 도구를 사용 하 여 그림 1 에 표시 된 치수와 금형을 만듭니다.
  2. 35 m m 플라스틱 마운트 그릇에 녹 인된 1 %agarose 약 1.5 mL를 플라스틱. 형과 agarose 사이 트랩 공기를 피하기 위해 돌보는 액체 agarose에서 플라스틱 금형을 놓습니다. 4 ° C에서 접시를 놓고는 agarose 견고 (약 5 분이이 소요) 때까지 기다려 다음 플라스틱 몰드를 제거 합니다.
  3. 나중에 사용에 대 한 장착 접시를 저장 하는 뚜껑 접시 커버 다음 접시와 뚜껑 parafilm으로 단단히 포장. 장착 요리를 저장할 수 있습니다 다음 뚜껑 면이 아래로 최대 5 일 동안에 4 ° c.
  4. 1.5 mL에 0.7% 낮은 융 점 agarose의 1 mL aliquots Eppendorf 관 장착 당일 사용을 사전에 준비 합니다.
    참고: 장착 접시의 agarose 우물 것 이다 변형 시간이 지남에으로 물 증발 parafilm 래핑되지 않은 요리 주위 밀접 하 게 하는 경우.

2.는 Photoconversion에 대 한 배아를 얻기

  1. Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) 라인과 28.5 ° c.에 어둠 속에서 배아 중간에 약 200 배아를 성장 제 브라 라인을 교차 하는 방법에 자세한 내용은 정돈 과학 교육 데이터베이스11를 참조 하십시오.
  2. 5 h 후만 24 시간 전에 치료 1-페 닐-2-thiourea 색소 형성을 방지 (PTU)와 태아 (0.003% 배아 중간에 통해).
  3. 약 1 h photoconversion, 형광 stereoscope 아래 화면 배아 및 선택 5 건강 한 배아의 시작 하기 전에 나타나는 밝은 녹색 형광을 표현 하. 낮은-강도 빛 머릿속 배아 때의 사용은 photoconverting가 아닌 특정 셀에 피하기 위하여 주변광을 배아의 노출을 피하기 위해 권장 됩니다.

3. 포함

  1. 설치 미디어의 10 mL를 준비: 0.02 %tricaine 및 50 mM BDM 배아 매체에.
  2. 장착 접시를 장착 중간의 2 개 mL를 추가 하 고 솔루션은 agarose로 확산을 위한 15-30 분을 허용.
  3. 한편, 약 5 분 동안 70 ° C 열 블록에 튜브를 삽입 하 여 0.7% 낮은 녹는점 (LMP) agarose의 약 1 mL 수를 녹여.
    1. 약간, 냉각 LMP agarose 기다립니다 다음 낮은 융 점 agarose의 튜브에 8mg/mL tricaine 솔루션의 25 µ L와 1m BDM 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 아래로, pipetting으로 혼합 튜브 LMP agarose 액체 상태로 유지 하는 38 ° C 열 블록에 다음 전송.
  4. 페 트리에서 배아 매체, 신중 하 게 dechorionate와 접시는 배아를 손상 하지 않도록 주의 복용 집게를 사용 하 여 stereomicroscope에서 미리 선택 된 배아.
  5. 미디어를 마운트의 2 개 mL를 포함 하는 별도 접시에는 배아를 전송 합니다.
    1. 배아의 마음은 중지 하는 경우 (약 5-10 분 소요), 장착에 태아 요리 하 고 그들은 25도 각도로 거짓말 집게를 사용 하 우물에 배아 전송 잘 향하도록 노른자위의 더 깊은 부분 쪽으로 향하고 꼬리.
    2. 배아 약 미디어를 제거 하는 장소에, tricaine 및 BDM, 0.7% LMP agarose의 ~ 200 µ L에 배아를 포함 하 고, 태아의 위치를 재조정 왼쪽 이나 오른쪽 필요에 따라 배아를 기울이기.
  6. LMP agarose 세트 (약 5 분 소요)까지 기다려 접시에 장착 매체를 추가 합니다. 배아는 이제 photoconverted 될 준비가.
    참고:는 tricaine와는 BDM 사용 됩니다 anesthetize 배아와 태아의 심장, 각각 중지. 설치 미디어 영상, 전날 준비 될 수 있다 그러나 빛에서 미디어를 보호 하기 위해 확인 한다.
    참고: 태아의 정확한 위치는 하나 photoconvert을 하고자 하는 셀에 대 한 명확한 레이저 경로 허용 해야 합니다. 레이저 광은 태아를 도달 하는 멀리 여행 하지 않아도 고 배아 수 쉽게 탑재 photoconversion 후 태아의 머리 우물의 시작 가까이 위치.

4입니다. Photoconversion

  1. 직 립 confocal 현미경 (Leica SP8) 같은 장비는 405에 nm, 488 nm 및 561 nm 레이저 소스를 찾아 태아의 백색 광 (명시)와 목표 렌즈 전송 심장 사용 하 여 (같은 Leica HCX IRAPO L, 25 × 없음 0.95 목표). 빨간 데 형광 561 nm 레이저 (즉, 561 DPSS 레이저, ~ 5% 강도로, 검출기 589-728 nm에서 설정)를 사용 하 여 확인 합니다. 그런 다음, 488 nm 레이저 (즉, 30 mW 여러 줄 아르곤 레이저 ~ 5% 강도로, 검출기 502-556 nm에서 설정)를 사용 하 여는 endocardium 시각화.
  2. 현미경 수집 소프트웨어에 "FRAP" 모드를 입력 합니다. 선택 ~ 1% 레이저 전원 모두 488 nm 및 561 nm 레이저.
  3. 관심의 비행기에 초점을, 관심 (ROI)의 영역을 선택 하는 다음 25% 레이저 전력, 투자 수익을 통해 세 번 검사에서 405 nm 다이오드를 사용 하 여 photoconvert 셀 레이저. 부족 한 데는 투자 수익에서 photoconverted 해야, 스캔 405 nm 레이저 지역 세 번 다시. 모든 ROIs에 대해이 단계를 반복 합니다.
  4. 소프트웨어에 "TCS SP8" 모드를 반환 하 고 인수는 561를 사용 하 여 z-스택, nm, 488 nm 레이저 순차적으로. 이미지 속도 높이기 위해 '양방향' 옵션을 선택 해야 합니다.
    참고: 얼마나 오래 걸리는 photoconvert 및 이미지 각 배아 다릅니다. 심장 박동은 정상적인 심장 밸브 개발에 대 한 중요 한, 그래서 하지 않은 시간 photoconvert 모든 5 배아 의미 하는 경우에 30 분 이상 중단 마음을 유지 하지 마십시오으로 알려져 있다.
    참고: photoconversion 과정, 사용 PMT 검출기, photoconversion, 후 그것 것이 좋습니다 '계산' 모드를 설정 하는 하이브리드 감지기를 사용 하 여. 이 때문에 하이브리드 감지기 더 민감합니다와 더 나은 품질의 이미지를 생산 할 수 있다 하지만 노출 과도 의해 쉽게 손상 됩니다.

5. photoconverted 배아를 마운트 해제

  1. Photoconversion, 후 유리 피 펫을 사용 하 여 약간 LMP agarose 휴식 후 부드럽게 빨 아 태아 태아의 머리 위에 눌러.
    1. PTU (를 포함 하는 중간은 BDM 씻어)와 배아 매체를 포함 하는 35 mm 페 트리 접시에 유리 피 펫에서 배아를 꺼냅니다.
    2. PTU와 배아 매체를 포함 하는 6-잘 접시에 잘에 배아를 전송. 이 단계는 배아의 메모를 계속 확인이 필수적인 나중 발달 단계에서 photoconverted 셀의 위치를 연결 하는 잘로 들어간다.
  2. 이제는 배아 BDM 포함 매체에서 제거 됩니다, 그들의 마음 반환 배아 배아 정상적으로 개발을 계속 있도록 28.5 ° C에서 어둠 속에 약 5 분에서 다시 치고 시작 해야 한다.

6. 배아 단계 나중에 photoconverted 세포 이미징

  1. 원하는 단계에서 마음을 중지 하 고 다시이 프로토콜의 3 단계 같은 배아 배아 배아를 추적 하려면 별도, 표시 된 요리에서 BDM으로 대우 되어야 하는 중요 한 차이점으로 포함 합니다.
  2. 62까지 배아에 대 한 hpf, z-스택 endocardium 561를 사용 하 여의 획득 nm, 488 nm 빨강 및 녹색 형광을 위한 신호를, 각각. 62 보다 오래 된 단계에서 태아에 대 한 hpf, 다 사용 하 여 레이저 세트 940 nm 녹색가 488 nm 레이저 대신 이미지.

7. 이미지 분석 배아 미만 48 hpf

참고:는 AVC의 조직 움직임 때문에 그것의 복잡 한 3 차원 구조 분석 하기 어려울 수 있습니다. 두 비 photoconverted 지역 또는 비 photoconverted 지역 두 photoconverted 지역 간의 AVC에의 길이 사이 AVC에서 photoconverted 영역의 길이 계량 수에 3 차원 구조를 지도 하는 2 차원 지도입니다. Photoconverted 배아의 이미지 48 전에 얻은 hpf는 다음 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있다.

  1. Matlab 또는 유사한 소프트웨어에 인수 이미지를 가져옵니다.
  2. 투자 수익, 즉 endocardium, 수동으로 delimitate 고이 지역 밖에 서 신호를 제거 하는 마스크를 적용 합니다.
  3. 이미지는 endocardium에 포인트를 확인 하 고 3 차원에서 플롯를 강도 임계값을 적용 합니다. 안마당에는 소프트웨어에서 지우기 명령을 사용 하 여 심 실 관심의 포인트를 수동으로 지우기 여는 AVC의 좁은 하 고 가장 직선 부분에 해당 하는 포인트를 격리 합니다.
  4. 그래서 얻은 AVC를 나타내는 포인트에 맞게 실린더를 사용 합니다.
  5. 여러 샘플을 비교 하는 참조 시스템을 정의 합니다. 예를 들어 참조 시스템의 기원과 z 축으로 장착 되어 실린더의 축으로 AVC 포인트의 질량 중심을 채택 한다.
    1. 긍정적인 z-위치 (심 실 또는 atrial) 심장의 같은 쪽에 항상 해당 하는 다는 것을 확인 하십시오.
    2. X-y 평면에서 AVC 포인트 프로젝트 고 그들을 맞는 타원을 사용 합니다.
    3. 타원의 주요 축과 레퍼런스 시스템의 y는 병렬 하 고 태아에 관하여 AVC의 내부 측면에 해당 하는 긍정적인 y-값 endocardial 포인트 z 축 주위를 회전 합니다.
  6. 세그먼트는 AVC, 3 차원 데이터 집합 반 비행기를 회전 하 여 얻은 몇 가지 평면 컷 {y = 0, x > 0} z-방향에서.
    1. 이 비행기에 인접 픽셀의 농도 프로젝트 하 고 일관 된 방식에서 endothelium을 정의 합니다. 예를 들어 수동으로 선을 그립니다는 심에서 endothelium의 절반 두께에서 AVC의 심 실 쪽으로.
    2. 보간 스플라인 도구 상자를 사용 하 여 표면으로 AVC를 대표 하는 3 차원 스플라인 endothelium을 대표 하는 라인의 포인트.
      참고: 절단 평면 수 세그먼트화의 정확도이 단계 시간 소비를 모두 결정합니다. 일반적으로, 8 비행기 좋은 결과 달성 하기에 충분 하다.
  7. 원통형 좌표를 사용 하 여 AVC 표면에 각 점의 방위 위치를 정의 합니다.
    1. 각 방위 위치에 연속 점 사이의 표면에 아크 길이 계산 하 여는 AVC의 표면 따라 파라메트릭 커브를 정의 합니다.
    2. 각 매개 변수 곡선 지점을 정의 합니다 0 AVC의 센터에 가장 가까운 곡선에. AVC의 포인트는 따라서 완전히 기술 그들의 방위 위치 및 그들의 위치에 의해 파라메트릭 커브에.
  8. 포인트의 파라메트릭 위치를 사용 하 여 2 차원 이미지에는 AVC를 전개.
  9. 바이너리 이미지 임계 처리의 모서리는 photoconverted 농도 비 photoconverted 채널 사이의 비율 척도를 영역의 가장자리를 찾아. 필요한 경우 수동으로 결과 수정.
  10. 방위 위치의 기능으로 직물의 길이 계산 하기 위해 가장자리 사이의 아크 길이 계산 합니다.

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결과

48에서 태아 photoconverted의 예로 hpf 80에서 다시 몇 군데와 hpf 영화 1 , 2, 그림 2에 표시 됩니다. 그들의 차동 색깔을 녹색 또는 그들의 빨간 양식으로 따라야 하는 셀의 동작을 사용 하면 형광등 빨간 형태, 그것의 형광 녹색 양식에서 단백질에서 변환 존중 레스터가 405 nm 빛에 노출 밸브 형성 동안 이웃입니다. 그것은 48 hpf AVC의 몇 photoconverted 셀 나중 확산 및 밸브 전단의 1 개의 측에 나중에 주로 살고 볼 수 있습니다.

그림 3에서 볼 수 photoconverting EdCs 안마당에는 심 실에서 후 36 hpf 배아에 설명 하는 이미지...

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토론

Photoconversion의 타이밍: 비록가 남아 96 에서도 EdCs에 밝게 표현 hpf, 그 태아 성장 함에 따라 레이저 광 확산 더 장난의 한정 된 photoconversion를 더 어렵게 만드는 AVC에 도달 하기 전에 주목 해야 한다. At 배아 단계 55 보다 나중 hpf, 열기구는 심 실 및 아 트리 움의 의미 photoconversion 용 바이올렛 레이저 빔 AVC 셀 심 방 또는 심 실 첫 번째 통과 없이 연결할 수 없습니다. 55 이상 즉 hpf, photoconvert는 AVC의 EdCs 순서로 하나 해야 합니다 또한 photoconvert 추가 EdCs 심 방 및 심 실.

BDM과 tricaine: EdCs의 정확한 photoconversion 심장 박동에서 일시적으로 중지 해야 합니다. BDM (2, 3 butanedione monoxime)는 잘 알려진 심장 근육 수축12를 억...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언.

감사의 글

우리 앤 Laure Duchemin, 데니스 Duchemin, 나탈리 Faggianelli 및 바 실 Gurchenkov 디자인 하 고 만들어서 형이이 프로토콜에서 설명 하는 데 도움 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 유럽 공동체, ERC 장부 N ° 682938, EMBO 젊은 조사 프로그램, ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553)에 의해 지원 되었다 Evalve 그랜트 ANR-10-LABX-0030-INRT에 의해 프랑스 국가 기금에 의해 관리 ANR-10-IDEX-0002-02 프레임 프로그램 Investissements d'Avenir에서 직원 회 드 라 검색 표시.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
재료
물고기를 기르고 알을 모으는 데 필요한 장비(자세한 내용은 Zebrafish Book22 참조).
실체현미경
정립 컨포칼 현미경(488nm, 561nm 및 405nm에서 작동하는 레이저, 조정 가능한 다광자 레이저 및 Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 대물렌즈 장착)LeicaLeica SP8
Heatblock ThermoScientific88870001
35mm x 10mm 조직 배양 접시Falcon353001
6 웰 플레이트Falcon353046
Petri 접시
집게
유리 피펫
금형
<강력한>시약
8 mg/mL 트리카인 재고 용액 
1 M BDM 원액
UltraPure 저융점 아가로스Invitrogen16520-050
아가로스Lonza50004
PTU (1-페닐-2-티오우레아)시그마 AldrichP7629
배아 배지: 30x 원액
<강력한>소프트웨어 이미지 분석, 곡선 피팅, 바이오 형식 도구 상자 MathWorks8 mg/mL 트리카인 원액200 mg 트리카인 분말(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설폰산)이 장착된 strong>
Matlab Sigma-AldrichE10521
pH 7로 조정하고 부분 표본을 추출하여 -20°C에서 보관하십시오. 씨 
1 M BDM 원액
1 g BDMSigma-Aldrich112135
10 mL ddH2O
부분 표본 및 -20°°C에서 보관 C
Embryo medium: 30x 스톡 용액
50.7 g NaClSigma-Aldrich7647-14-5
0.78 g KClSigma-Aldrich7447-40-7
1.47 g 마그네슘 설페이Sigma-Aldrich  7487-88-9
2.1g 칼슘 아질산염 사수화물Sigma-Aldrich13477-34-4
19.52g HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산)시그마 알드리치7365-45-9
pH 7.2로 조정하고 실온
<강>곰팡이< / 강>
PlasCLEAR 수지에 보관하십시오.아시가
플러스 39  자유형 Pico 3D 프린터Asiga
25 mL Danieau 트

참고문헌

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