Method Article

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 방법 sphingomyelin (SM) 질적 분석의 양적 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS/MS)에 의해 제시. SM은 일반적인 sphingolipid는 phosphorylcholine와는 세 라마 이드의 친수성 및 소수 성 구성 요소로 각각 구성. SM 종 수 sphingoid 긴 체인 베이스 (LCB) 다양 한 때문에 포유류 세포에 존재 하는 N-acyl moiety는 세 라마 이드에. 이 보고서에서는 탄소와는 LCB와 N이중 결합의 수를 추정 하는 방법을 보여 줍니다-acyl moiety MS/MS/MS (MS3) 실험에서 그들의 해당 제품 이온에 따라. 또한, 우리는 현재 정량 분석 방법 에스엠에 대 한 종을 사용 하 여 두 개의 안정적인 isotopically 레이블 SM, SM 정량에 사용 되는 범위를 결정을 용이 하 게 하. 현재 메서드는 SM 종 생물 학적 샘플 및 화장품 등 산업 제품의 다양 한 특성화에 유용할 것 이다.

Introduction

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Sphingomyelin (SM)은 포유류 세포에 있는 일반적인 sphingolipid. SM은 합성 침1 와 다른 sphingolipids에 대 한 선구자로 서 현재와 같은 면역에 중요 한 역할을가지고 있는 sphingosine 1 인산 염 및 세 라마 이드, 밀매 셀 피부 장벽 항상성, 각각2, 3. 따라서, SM 대사의 정확한 분석 elucidating sphingolipids의 생리 및 병 적인 역할에 대 한 중요 하다.

SM는 세 라마 이드와는 sphingosine와 N의 추가 구성 되는 세 라마 이드의 1 hydroxy 그룹에 연결 되는 phosphorylcholine의 구성-acyl moiety. Sphingosine N에 탄소와 이중 결합의 숫자에 다양 한-acyl moiety 세 라마 이드 (SM)의 수 종에서 결과. LC-ESI-MS/MS의 최근 발전은 SM4,5의 양적 및 질적 분석을 활성화 하 고. 질적 분석, 탄소 수와 sphingoid....

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Protocol

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사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 피부에서 파생 된 SM에 의해 샘플 오염을 최소화 하기 위해 장갑을 착용 한다. 현재 프로토콜 2 m m L10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충이 글의 최소 필수 매체에 성장 하는 HeLa 세포에 적용 했다-글루타민 1000 U/L 페니실린, 100 mg/L 스.

1입니다. 지질 샘플의 준비

참고: 모든 유리 시험관 테 플 론 늘어선 나사 모자를 포함 하 여 세제 없이 수 중요 하다.

  1. Bligh 및 염색 방법7 을 사용 하 여 셀 homogenate에서 총 지질 분수의 추출
    1. 문화를 제거 (또는 조건)-10cm 조직 문화 접시와 차가운 PBS의 6 mL로 두 번 린스에서 미디어.
    2. P1000 피펫으로 여 10 cm 조직 문화 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼와 세포를 수확 하 고 2.0 mL 시 플라스틱 튜브에 수집 합니다.
    3. 원심 분리 (1000 × g, 5 분, 4 ° C), 후에 상쾌한 P1000 피펫은 제거 합니다.

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Results

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화학적 합성 d18:1 / 24:0 SM (그림 1A)와 d18:1 / 24:0 SM HeLa 세포 (그림 1B)에서 추출한 지질 샘플에서 LC-ESI-MS3 채용 [M + HCOO]- , [M-채널3]에 의해 분석 되었다- 첫 번째 및 두 번째 선구자 이온으로 각각. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449)의 스펙트럼 강도 SM N의 그것 보다 더 큰-acyl moiety (m/z 378). 또한, [M-콜린-채널3 (sphingosine 1 인산 염)]에 해당 하는 스펙트럼에- .......

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Discussion

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현재 질적 방법에서 우리가 MS3 는 SPC와 N의 제품 이온을 얻은-acyl moiety. 제대로 SPC와 N을 할당 하는 것이 중요-acyl moiety. 이 위해, 그것은 다른 phosphorylcholine 포함 된 분자 또한 MS3 제품 이온으로 검출 될 수 있습니다 주목 해야한다. Diacyl-phosphatidylcholine (PC)와 plasmalogen-PC는 포유류 세포에 풍부 하 게 존재 이며 그들의 hydrophobicity SM 비슷합니다. 따라서, diacyl-PC와 동위 원소 (보통 13C) plasmalogen-PC 감지할 수 있습니다 이론적으로 동시에 SM으로. 우리의 실험에서 plasmalogen PC의 MS3 제품 이온 동시에 SM 분석에서 관찰 되었다. 그것은 제대로 SPC의 스펙트럼 강도 인지 SM N보다 큰 에스엠의 MS3 제품 이온을 선택 하.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품에서 교육 과학기술부, 문화, 스포츠, 과학 및 기술의 일본 (KAKENHI) 경호 (#15 K 01691)를, Y.F. (#15 K 08625), 부장 (#26461532), 및의 사역에서 다루기 힘든 질병 프로젝트의 연구에 대 한 부여 연구 보조금에 의해 지원 되었다 건강, 노동 및 복지 (부장 #201510032A) 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac) 감사 합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSThermoFisher10010023
100mm 조직 배양 접시IWAKI3020-100
셀 스크레이퍼IWAKI9000-220
실리콘화 2.0mL 튜브Fisher Scientific02-681-321
시험관IWAKITST SCR 16-100
테프론 라이닝 나사 캡IWAKI9998CAP415-15
일회용 유리관IWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 &마이크로; m 1.5 mm I.D. x 100 mm시세이도92223가드 카트리지를 카트리지 홀더에 삽입하고 C18 열
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm 가드 카트리지시세이도12197
카트리지 홀더시세이도12415
아세토니트릴Wako018-19853
2-프로판올(이소프로필 알코올)Wako161-09163
메탄올Wako134-14523
포름산Wako066-00466
28 % 암모니아 물Wako016-03146
초음파 발생기 (목욕 유형)SHARPUT-206H
유리 시험관 용 소용돌이 믹서TAITECMix-EVR
1.4 mL 유리 바이알Tomsic500-1982샘플은 나사 캡으로 밀봉 된 1.4 mL 유리 바이알에 보관하고 -20 °C에서 8mm 격막을 보관합니다. C
8 mm 격막Tomsic200-3322시료 분석 시 나사 캡을 슬릿 격막이 있는 나사 캡으로 교체
1.4mm 유리 바이알용 나사 캡Tomsic500-2762
슬릿 격막이 있는 나사 캡ShimadzuGLC GLCTV-803
PVDF 0.22 µ m 필터MilliporeSLGVR04NL
삼중 사중극자 및 사중극자 선형 이온 트랩 질량 분석기SCIEXQTRAP4500
제품 이온 스펙트럼의 데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어SCIEXAnalyst
정량 분석의 데이터 통합을 위한 소프트웨어SCIEXMultiQuant
HPLC 시스템ShimadzuNexera
유리 병Sansyo85-0002
d18:1/24:0 스핑고미엘린Avanti 극지 지질860592P
스핑고실포스포릴콜린머크567735
태아 소 세럼ThermoFisher 
L-글루타민써모피셔 
페니실린과 스트렙토마이신시그마P4333
Eagle' s 최소 필수 매체시그마M4655
2614007925030081

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

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Sphingomyelin AnalysisLC MS MS MethodStable Isotope LabelingLipid ExtractionMobile Phase PreparationTriple Quadrupole MSProduct Ion SpectraStandard Curve ConstructionHeLa Cell SamplesCosmetic Lipid Characterization

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