Method Article

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 방법 sphingomyelin (SM) 질적 분석의 양적 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS/MS)에 의해 제시. SM은 일반적인 sphingolipid는 phosphorylcholine와는 세 라마 이드의 친수성 및 소수 성 구성 요소로 각각 구성. SM 종 수 sphingoid 긴 체인 베이스 (LCB) 다양 한 때문에 포유류 세포에 존재 하는 N-acyl moiety는 세 라마 이드에. 이 보고서에서는 탄소와는 LCB와 N이중 결합의 수를 추정 하는 방법을 보여 줍니다-acyl moiety MS/MS/MS (MS3) 실험에서 그들의 해당 제품 이온에 따라. 또한, 우리는 현재 정량 분석 방법 에스엠에 대 한 종을 사용 하 여 두 개의 안정적인 isotopically 레이블 SM, SM 정량에 사용 되는 범위를 결정을 용이 하 게 하. 현재 메서드는 SM 종 생물 학적 샘플 및 화장품 등 산업 제품의 다양 한 특성화에 유용할 것 이다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sphingomyelin (SM)은 포유류 세포에 있는 일반적인 sphingolipid. SM은 합성 침1 와 다른 sphingolipids에 대 한 선구자로 서 현재와 같은 면역에 중요 한 역할을가지고 있는 sphingosine 1 인산 염 및 세 라마 이드, 밀매 셀 피부 장벽 항상성, 각각2, 3. 따라서, SM 대사의 정확한 분석 elucidating sphingolipids의 생리 및 병 적인 역할에 대 한 중요 하다.

SM는 세 라마 이드와는 sphingosine와 N의 추가 구성 되는 세 라마 이드의 1 hydroxy 그룹에 연결 되는 phosphorylcholine의 구성-acyl moiety. Sphingosine N에 탄소와 이중 결합의 숫자에 다양 한-acyl moiety 세 라마 이드 (SM)의 수 종에서 결과. LC-ESI-MS/MS의 최근 발전은 SM4,5의 양적 및 질적 분석을 활성화 하 고. 질적 분석, 탄소 수와 sphingoid LCB의 SM의 이중 결합 LCB의 제품 이온 스펙트럼을 할당 하 여 확인 되었습니다. 그러나, N의 구조 정보-acyl moiety는 직접 얻지 못하면는 해당 제품 이온 보고 하지 않은, 때문에 그리고 그러므로 N-acyl moieties 선구자 이온 사이 차동 분석 추론 했다 고 제품 이온 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 모드4,5에 LCB에 해당. 이 보고서에서는 LCB와 N의 제품 이온을 검출 하는 방법 소개-acyl moiety 트리플 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석, 정확한 구조를 용이 하 게 하를 사용 하 여 MS3 모드에서 동시에 각 SM 종6의 추측

생물 학적 샘플 매트릭스로 인 한 이온 억제 (또는 강화) 효과 방해 LC-ESI-MS 분석, 정확한 정량화 하 고 따라서, 그것은 동일한 매트릭스에 대 한 관심의 모든 analytes에 대 한 교정 곡선을 생성 하는 것이 좋습니다. 생물 학적 샘플. 그러나,이 전략은 불가능 하기 때문에 그것은 거의 모든 SM 종 종합 분석에 특히 생물학 견본에서 준비 가능 하지. 따라서, 보정 곡선을 건설 하 고 대표적인 SM 종 생물 학적 샘플에서 아군을 사용 하 여 양적 범위를 결정 하는. 우리는 보정 곡선; 구성 두 isotopically 표시 된 SM 종 사용 하나는 내부 표준 및 표준 화합물에 대 한 다른 사용 되었다. 우리는 생물 학적 샘플에 아군 하 고 성공적으로 교정 곡선과 양적 범위6표준 화합물으로 SM 종 isotopically 표시의 작은 금액을 감지.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 피부에서 파생 된 SM에 의해 샘플 오염을 최소화 하기 위해 장갑을 착용 한다. 현재 프로토콜 2 m m L10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충이 글의 최소 필수 매체에 성장 하는 HeLa 세포에 적용 했다-글루타민 1000 U/L 페니실린, 100 mg/L 스.

1입니다. 지질 샘플의 준비

참고: 모든 유리 시험관 테 플 론 늘어선 나사 모자를 포함 하 여 세제 없이 수 중요 하다.

  1. Bligh 및 염색 방법7 을 사용 하 여 셀 homogenate에서 총 지질 분수의 추출
    1. 문화를 제거 (또는 조건)-10cm 조직 문화 접시와 차가운 PBS의 6 mL로 두 번 린스에서 미디어.
    2. P1000 피펫으로 여 10 cm 조직 문화 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼와 세포를 수확 하 고 2.0 mL 시 플라스틱 튜브에 수집 합니다.
    3. 원심 분리 (1000 × g, 5 분, 4 ° C), 후에 상쾌한 P1000 피펫은 제거 합니다.
    4. 메탄올의 1 mL를 추가 합니다. 소용돌이 관 짧게 고 목욕 형 sonicator에 5 분 동안 200 W sonicate.
      참고: 셀 펠 릿 효율적으로 무 균 되도록 목욕 형 sonicator의 수 위를 조정 합니다.
    5. 테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브 (13 m m x 100 m m)로 피 펫 메탄올에 셀 homogenate 전송.
    6. 메탄올, 클로 프롬, 두 배 증류수, 0.8 mL 및 50 µ L 10 µ / L 내부 표준 d18:1 /(D31)-16의의 1 mL의 1 mL를 추가: 0 각 시험관에 SM.
    7. 실 온에서 5 분 동안 적극적으로 소용돌이 테스트 튜브.
      참고:이 시점에서 단일 위상 (클로 프롬/메탄올/물 1/2/0.8 (v/v/v) =) 형성 된다.
    8. 1 mL의 클로 프롬 및 두 배 증류수의 1.0 mL를 추가 합니다.
    9. 실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 소용돌이 튜브.
      참고:이 시점에서,는 수성 (위) 및 유기 (낮은) 위상 구분 됩니다.
    10. 원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 일회용 유리 튜브 (초기 낮은 단계)로 낮은 단계를 전송.
      참고: 낮은 단계 파스퇴르 피 펫 및 안전 피 펫 필터를 사용 하 여 수집 합니다. 낮은 위상에는 피 펫의 끝을 삽입 하 고 위 위상 및 피 펫, 팁 내부의 계면 보풀을 제공 하는 'E' 밸브 옆 작은 전구를 집어넣은 다음에 피펫으로 낮은 단계를 사이 펀.
    11. 튜브 위 단계와 계면 보풀 충분히 섞어 실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 테스트 튜브, 그리고 소용돌이에 클로 프롬의 2 개 mL를 추가 합니다.
    12. 원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 수정 된 낮은 단계 단계 1.1.10에서에서 설명 된 대로 초기 낮은 단계와 일회용 유리 튜브로 전송.
    13. 질소 스트림 아래 유리 튜브를 놓고 완전히 수집된 낮은 단계에서 유기 용 매를 제거 합니다.
    14. 샘플 reconstitute 메탄올 또는 에탄올의 500 µ L, 0.02 µ m 필터, 여과-20 ° c.에 유리 튜브에 저장
  2. 보정 곡선을 건설 하 고 메서드를 유효성 검사를 위한 샘플 준비
    1. 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 또는 표준 화합물의 50 µ / L의 50 µ L를 추가 (d18:1 /(D9)-18:1 SM) 테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브로.
    2. 각 시험관에 세포 homogenate를 추가 하 고 1 mL에 메탄올을 추가.
      참고: 셀 homogenate 매트릭스로의 양은 각 실험에 따라 다릅니다. 샘플 10 cm 배양 접시에 셀에서 파생 된 SM 종 정기적으로 분석 하 고, 각 테스트 튜브에 세포 homogenate의 양을 10 cm 배양 접시에 셀의 가까이 이어야 한다.
    3. 1.1.6-1.1.14 단계에에서 설명 된 대로 총 지질 분수를 추출 합니다.
    4. 단계 1.2.1-1.2.3에서 descried로 메서드를 유효성 검사에 대 한 품질 검사 (QC) 샘플을 준비 합니다. 표준 화합물의 다른 농도와 3 QC 샘플 준비 (d18:1 /(D9)-18:1 SM): 3 표준 곡선 (QC 로우, QC L), 하나 센터 근처의 더 낮은 경계 배 내에서 (중간 품질 관리, 품질 관리-M)의 상한 근처 하나는 표준 곡선 (QC-높은, QC-H).

2. SM LC-ESI-MS/MS 분석

  1. 모바일 위상의 준비
    1. 혼합 용 제 (이기/메탄올/ddH2O 수성 단계와 소 프로 파 놀 유기 단계에 대 한 2/2/1 (v/v/v) =)에 유리 테 플 론 늘어선 나사 모자 병 및 목욕 형 sonicator에서 5 분 sonicate.
    2. 포 름 산 (최종 농도 26.4 mmol/L)와 NH4오 추가 (14.9 mmol/L) 각 모바일 단계에.
  2. LC-ESI-MS3 SM의 질적 분석
    1. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 활성화 하 고 모바일 단계를 포함 하는 유리 병에 넣어 입구 튜브 HPLC 라인을 제거. HPLC 시스템에 C18 HPLC 열 (1.5 m m 아이디 × 100 m m 길이, 입자 크기 3.0 µ m)를 연결, 열 오븐에서 50 ° C에 온도 유지 하 고 상태는 autosampl에서 샘플 선반에 샘플을 넣어 100 µ L/분에 수성 모바일 단계와 열 어.
    2. 3 배 4 중 극 및 4 극 자 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 MS3 분석 이온의 SM 종의 첫 번째 및 두 번째 전조 뿐만 아니라 표 1 과 표 2 에 나열 된 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 데이터 수집을 위한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, 더블 클릭 ' 하드웨어 구성 ', ' LC + QTRAP4500 + 밸브 ' 선택한 ' 활성화 프로필 '을 클릭 합니다.
      2. ' 새 하위 프로젝트 ' 및 '확인'을 클릭 하 여 새 하위 폴더를 만듭니다.
      3. '파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 10000 Da/s, 극성 '부정적'으로 그리고 '기간' 전체 시간으로 분석 된 (분)으로 속도 스캔, ' MS/MS/MS (MS3)'으로 ' 질량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 검색 범위는 '시작 (Da)'와 '정지 (다)'의 m/z 를 설정 합니다. SM 종 관심의 대상의 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 설정 합니다.
        참고: 여러 SM 종 분석, 강조는 '-MS3' 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭, '이 실험 복사' 선택 하 고 다음 다른 SM 종 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 넣어.
      4. ' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: '프로 파일', 단계 크기 0.12 (다), 해상도 q 1과 q 3로 스캔 모드 '단위'와 '조명', 각각 50 (ms), 1.5 ms로 대량 범위 사이 일시 중지도 0, 설정 시간으로 강도 임계값 선택 ' 동적 시간을 채우기 ', 8 V, 3 분기 진입 장벽 및 25 ms로 여기 시간.
      5. 'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 선택 ' 소스/가스 ' 탭 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 설정. 그런 다음 선택 '복합' 탭 declustering 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 여기 에너지, 및 충돌 에너지는 표 2에 나열 된 전파의 매개 변수 설정.
      6. ' 통합 Valco 밸브 '를 강조 하 고 ' 단계 0에 대 한 위치 이름을 ' a, 선택한 설정 'B' 총에 대 한 위치와 5.0 분 시간. 또한 'A' 총에 대 한 위치 설정 70.0 분 시간.
      7. 'Shimadzu LC 시스템'을 강조 표시 합니다. '펌프' 탭을 선택 하 고 이진 흐름, 0.28 mL/min와 최대 압력 한계 20.0 MPa로 전체 흐름으로 양수 모드를 설정 합니다. 'Autosampler' 탭을 선택 하 고 200 µ L로 헹 구는 볼륨 설정, 35 µ L/s 속도 rinsing, 샘플링 속도 5.0 µ L/s로 52 m m, 스트로크를 바늘, 25.0 분으로 시간을 제거, '전후 포부' 5 s, 그리고 린스 모드 딥 시간을 씻어.
        1. 또한, 쿨러 장치를 활성화, 쿨러 온도 4 ° C로 설정 고 제어 유리병 바늘 선 52 m m. '오븐' 탭을 선택 하는 대로 오븐을 사용 각각 오븐 온도 최고 온도 50 ° C에서 85 ° C로 설정.
        2. '컨트롤러' 탭을 선택 하 고 확인란을 '에 힘'. ' 시간 프로그램 ' 탭을 선택 하 고 용 매 기울기를 다음과 같이 설정: 용 매 A / 5 분 동안 100/0 비율로 B 80/20을 선형 변경 프로그램 35/65 4 분 이상 50 분 이상 및 25/75 이상 1 분 후 25/75 10 분 동안 다음 선형 100/0에서 그들을 잡고 4 분 이상. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.
    3. 배치 파일 만들기
      1. ' 건설 인수 일괄 ' 아이콘 더블 클릭, 클릭 ' 추가 설정 ', ' 추가 샘플 ', 새로운 샘플 수를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.
      2. ' 기가 ' 버튼을 클릭 하 고 사용할 방법을 선택 합니다. 여러 메서드 한 배치 파일에 사용 되는 경우 ' 여러 방법을 사용 '의 상자를 확인 하 고 각 샘플에 대 한 수집 방법을 선택 합니다. ' 샘플 이름 ' 이름 바꾸기 ' 유리병 위치 '에 대 한 적절 한 번호를 설정 하 고 주입 볼륨의 금액을 넣어. 다음 배치 파일을 저장 합니다.
    4. LC-ESI-MS3 분석에 의해 MS3 제품의 SM 종의 이온 스펙트럼을 얻기
      1. 배치 파일에서 '제출' 탭을 선택 하 고, 분석 샘플의 줄을 강조 표시 '제출' 버튼을 클릭 합니다.
      2. 클릭은 ' 보기 Quene' 아이콘 '평형' 아이콘을 선택 인수 메서드를 사용할 수 1 분으로 시간을 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.
      3. 해당 아이콘을 클릭 하 여 ' 튜닝에 대 한 예비 악기 '를 비활성화 합니다. 다음 ' 시작 샘플 ' 아이콘을 클릭 하 여 일괄 처리 시퀀스를 실행 합니다.
    5. 질량 이온 스펙트럼 제품의 비 (m/z)를 충전 하 고는 sphingoid의 정확한 질량을 비교 하 여 각 MS3 SM의 제품 이온 스펙트럼 할당 LCB와 N-acyl moiety 관심의. LCB와 N은 sphingoid에서 탄소 이중 수 채권 확인-해당 제품 이온에 따라 acyl moiety.
      1. 적절 한 하위 프로젝트 폴더 선택 되어 있는지 확인, 다음 ' 데이터 파일 열기 ' 아이콘을 두 번 클릭 하 고 샘플 분석을 선택 합니다. SM 종 각 대상에 대 한 크로마에 피크를 끌어서 다음 두 번 클릭 합니다. 드래그 영역 내에서 얻은 MS3 제품 이온 스펙트럼 표시 됩니다.
  3. LC-ESI-MS/MS에 의해 SM의 정량 분석
    1. 2.1 및 2.2.1 단계에서 설명한 대로 모바일 단계 및 HPLC 열을 설정 합니다.
    2. 3 배 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 모니터링 (MRM) 분석 표 1 과 표 2에 나열 된 여러 반응의 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 2.2.2.1 및 2.2.2.2 단계에서 설명한 대로 절차를 수행 합니다.
      2. '파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 'MRM', '긍정적'으로 극성으로 ' 대량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 전체 시간 분석을 '기간'을 설정 합니다. [M + H]+ 의 m/z 와 184 ' 1 분기 질량 (Da)'와 ' 3 분기 질량 (다)'의 대상 이자, SM 종으로 각각 설정. 10 ms 및 SM 종 대상의 이름으로 ' ID' '시간'을 설정 합니다.
      3. ' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: 해상도 1 분기의 모두 3 분기 단위로' ', 강도 임계값 0으로 시간 (ms), 0으로 설정 하 고 5 ms로 대량 범위 사이의 일시 중지.
      4. 'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 넣어 ' 소스/가스 ' 탭을 선택 합니다. 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 그리고 충돌 세포 출구 잠재적인 표 2에 나열 된 declustering의 매개 변수를 넣어 '컴파운드' 탭을 선택 합니다.
      5. 2.2.2.6 단계에서 설명한 대로 밸브를 설정 합니다.
      6. 2.2.2.7 단계에서 설명한 대로 액정 상태를 설정 합니다. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.
    3. 2.2.3 단계에서 설명한 대로 배치 파일을 만듭니다.
    4. LC-ESI-MS/MS 분석 단계 2.2.4에에서 설명 된 대로 각 SM의 MRM 데이터를 가져옵니다.
    5. 데이터 통합 소프트웨어를 사용 하 여 MRM 데이터를 처리 하 고 SM 종 각의 추출된 이온 크로마 피크 영역 데이터를 가져옵니다.
      1. 정량 분석에서 데이터 통합에 대 한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, '편집' 탭을 클릭 하 고 사용자 통합 기본값을 선택 합니다. 1.0 점으로 가우스 부드러운 너비를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다. '편집' 탭을 클릭 하 고 ' 새 결과 테이블 '을 선택 합니다. 샘플 통합, 화살표 단추를 누르고 '다음'을 선택 합니다. ' 만들 새로운 방법 '을 선택, 메서드의 이름을 설정 하 고 '다음'을 클릭 합니다. '다음'을 클릭 하 고 d18:1 /(D31)-16의 확인란: 0 그대로 SM '다음'을 클릭 하 고 '마침'을 클릭 합니다.
      2. '피크 검토 표시'를 클릭 하 고 크로마 봉우리는 적절 하 게 인식 하는 확인 하십시오. 주목 해야 한다 그 d18:1 /(D31)-16의 보존 기간: 0 SM에 의해 일반적으로 작습니다 ~ 34-1 SM 중에 비해 0.3 분 (d18:1 / 16:0 SM에 일반적으로 구성 됩니다).
    6. D18:1 /(D31)-16에 SM 종 각의 피크의 비율에 따라 각 SM 종 계량: 0 SM 내부 표준.
      1. '파일' 탭을 클릭, '내보내기', ' 결과 테이블 ', 'MultiQuant', '모든 열 수출' 열으로 포맷을 확인, '그 명시적으로 숨겨진 제외 하 고 모든 행을 내보내려면', 그리고 '확인'을 클릭 행.
      2. Excel 소프트웨어에서 내보낸된 파일을 엽니다. IS의 영역 SM 종 대상의 영역을 정상화 (d18:1 /(D31)-16:0 SM). 다음 대상 SM 종 주입 된 샘플에서의 양을 계산 하 주입된 샘플에 IS의 이론적인 금액을 곱하십시오.
  4. 표준 곡선을 건설
    1. D18:1 /(D9)-18의 MRM 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 LC-ESI-MS/MS 분석 하 여 표준 곡선을 만들기 위한 샘플에 SM.
    2. D18:1 /(D9)-18의 피크 면적의 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 SM 2.3.5 단계에서 설명한 대로.
    3. D18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.6으로 주입 된 샘플에서 SM.
    4. /(D9)-18 명목 금액 및 d18:1의 계산 된 금액으로 x 축과 y 축을 설정 하 여 추세선을 구성: 1 SM 추세선 수식의 얻을.
  5. 양적 방법 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 유효성 검사
    1. 방법의 유효성 검사에 대 한 d18:1 /(D9)-18의 양을 계량: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16: 0는 QC에 SM 샘플링 각 QC를 분석 하 여 1 일에 세 번 이상 샘플 및 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 최소 3 일을 반복.
    2. 피크 지역 데이터를 가져오고 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.5 2.3.6으로 삽입 된 샘플에 SM.
    3. 얻은 보정 곡선에 따라 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1 삽입 된 샘플에서 SM.
    4. 정밀 평가
      1. 평균 및 표준 편차 d18:1 /(D9)-18의 금액의 계산: 1 SM 2.5.3-하루의 데이터 집합에 단계에서 얻은 및 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 간 일.
      2. 2.5.4.1 단계에서 얻은 평균 표준 편차로 나눈 값 이며, %로 표시.
    5. 정확도의 평가
      1. 다음과 같이 각 데이터의 정확도 계산.
        [(계산된 양 단계 2.5.3에서에서 얻은입니다.) / (명목 금액)-1] × 100(%)
      2. 하루 간 날의 dataset에 정확도의 절대 값의 평균을 계산 합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

화학적 합성 d18:1 / 24:0 SM (그림 1A)와 d18:1 / 24:0 SM HeLa 세포 (그림 1B)에서 추출한 지질 샘플에서 LC-ESI-MS3 채용 [M + HCOO]- , [M-채널3]에 의해 분석 되었다- 첫 번째 및 두 번째 선구자 이온으로 각각. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449)의 스펙트럼 강도 SM N의 그것 보다 더 큰-acyl moiety (m/z 378). 또한, [M-콜린-채널3 (sphingosine 1 인산 염)]에 해당 하는 스펙트럼에- ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 질적 방법에서 우리가 MS3 는 SPC와 N의 제품 이온을 얻은-acyl moiety. 제대로 SPC와 N을 할당 하는 것이 중요-acyl moiety. 이 위해, 그것은 다른 phosphorylcholine 포함 된 분자 또한 MS3 제품 이온으로 검출 될 수 있습니다 주목 해야한다. Diacyl-phosphatidylcholine (PC)와 plasmalogen-PC는 포유류 세포에 풍부 하 게 존재 이며 그들의 hydrophobicity SM 비슷합니다. 따라서, diacyl-PC와 동위 원소 (보통 13C) plasmalogen-PC 감지할 수 있습니다 이론적으로 동시에 SM으로. 우리의 실험에서 plasmalogen PC의 MS3 제품 이온 동시에 SM 분석에서 관찰 되었다. 그것은 제대로 SPC의 스펙트럼 강도 인지 SM N보다 큰 에스엠의 MS3 제품 이온을 선택 하...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품에서 교육 과학기술부, 문화, 스포츠, 과학 및 기술의 일본 (KAKENHI) 경호 (#15 K 01691)를, Y.F. (#15 K 08625), 부장 (#26461532), 및의 사역에서 다루기 힘든 질병 프로젝트의 연구에 대 한 부여 연구 보조금에 의해 지원 되었다 건강, 노동 및 복지 (부장 #201510032A) 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac) 감사 합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSThermoFisher10010023
100mm 조직 배양 접시IWAKI3020-100
셀 스크레이퍼IWAKI9000-220
실리콘화 2.0mL 튜브Fisher Scientific02-681-321
시험관IWAKITST SCR 16-100
테프론 라이닝 나사 캡IWAKI9998CAP415-15
일회용 유리관IWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 &마이크로; m 1.5 mm I.D. x 100 mm시세이도92223가드 카트리지를 카트리지 홀더에 삽입하고 C18 열
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm 가드 카트리지시세이도12197
카트리지 홀더시세이도12415
아세토니트릴Wako018-19853
2-프로판올(이소프로필 알코올)Wako161-09163
메탄올Wako134-14523
포름산Wako066-00466
28 % 암모니아 물Wako016-03146
초음파 발생기 (목욕 유형)SHARPUT-206H
유리 시험관 용 소용돌이 믹서TAITECMix-EVR
1.4 mL 유리 바이알Tomsic500-1982샘플은 나사 캡으로 밀봉 된 1.4 mL 유리 바이알에 보관하고 -20 °C에서 8mm 격막을 보관합니다. C
8 mm 격막Tomsic200-3322시료 분석 시 나사 캡을 슬릿 격막이 있는 나사 캡으로 교체
1.4mm 유리 바이알용 나사 캡Tomsic500-2762
슬릿 격막이 있는 나사 캡ShimadzuGLC GLCTV-803
PVDF 0.22 µ m 필터MilliporeSLGVR04NL
삼중 사중극자 및 사중극자 선형 이온 트랩 질량 분석기SCIEXQTRAP4500
제품 이온 스펙트럼의 데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어SCIEXAnalyst
정량 분석의 데이터 통합을 위한 소프트웨어SCIEXMultiQuant
HPLC 시스템ShimadzuNexera
유리 병Sansyo85-0002
d18:1/24:0 스핑고미엘린Avanti 극지 지질860592P
스핑고실포스포릴콜린머크567735
태아 소 세럼ThermoFisher 
L-글루타민써모피셔 
페니실린과 스트렙토마이신시그마P4333
Eagle' s 최소 필수 매체시그마M4655
2614007925030081

References

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