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방법 논문

Vancomycin 치료 로드 칼슘 염 및 뼈 감염의 향상 된 토끼 모델에서 자생 뼈

9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57294

⸱

2019년 3월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Tongde Hospital of Zhejiang Province, 3Institute of Orthopaedics and Traumatology, First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 4Department of Clinical Laboratory, Tongde Hospital of Zhejiang Province

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 향상 된 토끼 선물 모델 같은 양의 골 수에서 박테리아를 차단 하 여 황색 포도상구균 에 감염. Vancomycin 로드 칼슘 염 및 자생 뼈 항생제와 뼈 복구 처리를 위해 사용 됩니다. 프로토콜 뼈 감염 및 재생을 공부에 대 한 도움이 될 수 있습니다.

초록

뼈 감염 임상, 정형 외과, 외상 외과에 치료 하기가 매우 세균성 내 습에서 유래한 다. 뼈 감염 도왔습니다, 지속적인 염증과 최종 뼈 비 조합 될 수 있습니다. 가능한, 재생 가능한 동물 모델의 설립은 뼈 감염 연구 및 항생제 치료에 중요 합니다. Vivo에서 모델로 서 토끼 모델은 뼈 감염 연구에서 널리 이용 된다. 그러나, 토끼에 대 한 이전 연구 뼈 감염 모델 박테리아의 양을 변수 되면서 감염 상태 일치 하지 했다. 이 연구는 골 수에서 박테리아를 차단 하 여, 토끼에 뼈 감염을 유도 하는 향상 된 수술 방법을 선물 한다. 다음, 다단계 평가 모델링 방법 확인 하 실행 될 수 있습니다.

일반적으로 debriding 괴 사 성 조직 및 vancomycin 로드 칼슘 염 (VCS)의 주입은 항생제 치료에 우세. VCS에 칼슘 염 혜택 크롤링 osteocyte와 새로운 뼈 성장, 비록 대규모 뼈 결함 debriding 후 발생 합니다. 자생 뼈 (AB)은 후에 회 저 성 뼈 debriding 대규모 뼈 결함의 치료에 대 한 뼈 결함을 극복 하는 매력적인 전략 이다.

이 연구에서 우리는 자생 뼈 이식 뼈 결함으로 꼬리 뼈를 사용. 뼈 수리 동물 희생 후 마이크로--단층 촬영 (마이크로 CT) 및 조직학 분석을 사용 하 여 측정 했다. 그 결과, VCS 그룹에서 뼈 비-연합 지속적으로 얻은 했다. 대조적으로, 뼈 결함 영역 VCS AB 그룹에서 크게 감소 했다. 현재 모델링 방법 뼈 감염 모델을 준비 하는 재현, 실현, 안정적인 방법 설명. VCS AB 치료 항생제 치료 후 낮은 뼈 연방 비 비율에 있는 결과. 향상 된 뼈 감염 모델 및 VCS와 자생 뼈의 조합 치료 뼈 감염 뼈 재생 관련 학 정형 응용 프로그램의 기본 메커니즘을 공부 하는 데 도움이 수 있습니다.

서론

뼈 감염 세균 이나 다른 미생물 침입 후 외상, 뼈 골절, 또는 다른 뼈 질환1에서 일반적으로 유래한 다. 뼈 감염 염증 및 뼈 조직 파괴의 높은 수준의 유도 수 있습니다. 클리닉, 황색 포도상구균 (S. 구 균)에서는 뼈 감염2,3의 주된 원인이 에이전트입니다. 뼈 감염 고통, 쇠 약, 그리고 종종 매우4치료 하기 어려운 만성 과정을 걸립니다. 현재, 회 저 성 직물의 debridement 그리고 vancomycin 로드 칼슘 (VCS) 구슬의 이식 로컬 감염5,6를 제어 하기 위한 효율적인 전략으로 확인 되었습니다 있다. 그러나, 10% ~ 15%의 환자는 항 감염 치료7후 장기간된 뼈 복구 프로세스, 지연된 연합, 또는 비-연합을 경험. 뼈의 결함의 큰 세그먼트는 정형 외과 대 한 가장 어려운 문제입니다. 자가 뼈 이식 뼈 비 조합 치료8,9에 최적의 뼈 대체를 간주 됩니다.

날짜 하려면, 뼈에 대 한 연구의 대부분 감염 및 자가 뼈 이식 동물 모델, 쥐, 토끼, 개, 돼지 및 양10,11의 다양 한 종류에서 실시 되었습니다. 토끼 모델으로 뼈 감염 연구, 가장 많이 사용 되 첫번째 197012,13Norden와 케네디에 의해 수행. 우리의 이전 연구에서 우리 Norden의 방법을, 토끼 모델을 사용 하 고 우리는 S. 구 균 골 수 주입의 수량 수 없습니다 측정할 수 정확 하 게,로 골 수에서 혈액 새 박테리아 솔루션 오버플로 발견.

이 문서에 토끼 뼈 감염 유도 대 한 향상 된 수술 방법을 제공 합니다. 프로시저의 끝에, 혈액 생화학 검사, 세균 검사 및 조직 검사는 뼈 감염 모델을 확인 하려면 수행 했다. 그리고, VCS, 감염을 억제 하기 위해 이식 했다 자생 뼈 뼈 재생 촉진 이식 했다.

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프로토콜

현재 연구에 사용 된 토끼는 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 취급 했다. 모든 실험 절차 규칙의 생명 윤리 위원회의 절 강 아카데미의 전통 중국 의학 순 이었다.

1입니다. 세균 현 탁 액의 준비

  1. S. 구 균 동결 분말 (ATCC 6538)와 Luria Bertani 문화 매체의 0.3 mL의 0.5 mg을 디졸브. 완전히 정지를 혼합.
  2. 줄무늬가 tryptic 간장 한 천 격판덮개에 박테리아 중단 하 고 16 h 37 ° C에서 세균성 식민지를 품 어.
  3. 단일 세균성 식민지 형성 단위 (CFU)과 tryptic 간장 국물 관 24 h. 수행 37 ° C에서 약 24 h에 대 한 하위 문화를 선택 하 고 얻을 중반 대 수 성장 단계 박테리아 후 16 ~ 18 h, 광학 밀도 (OD) 값이 600에서 0.6 nm 14.
  4. 원심 분리기 튜브로 박테리아 서 스 펜 션의 1 mL를 전송 합니다. 825 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. Resuspend 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS);의 100 µ L로 박테리아를 씻어 3 번이이 단계를 반복 합니다. 마지막으로, PBS의 3 mL와 박테리아 resuspend.
  5. 맥 팔 랜드의 turbidimetry15를 사용 하 여 박테리아 농도 견적 한다.
    1. 탁도 0.5 맥 팔 랜드 표준에 해당 될 때까지 100 ~ 500 µ L 세균 현 탁 액의 색도계 튜브를 전송 합니다.
    2. 박테리아의 콘텐츠는 약 10에 도달 하면 0.5 맥 팔 랜드에 시각적인 비교 하 여 탁도 평가8 CFU/mL.
      참고: 박테리아 서 스 펜 션의 볼륨은 다음 프로토콜에 대 한 충분 한 다는 것을 확인 하십시오. 모든 토끼 박테리아 서 스 펜 션의 볼륨 1 mL 미만입니다.
  6. 한 천 배지 세균 현 탁 액의 0.2 mL를 전송 하 고 그것을 균등 하 게 적용. 박테리아 식민지 박테리아 서 스 펜 션의 CFU를 확인 하려면 16 헤 수 37 ° C에서 접시를 품 어.

2입니다. 뼈 감염 모델의 준비

  1. 남성 뉴질랜드 백색 토끼, 세 공기 제어 조건 (20 ± 1 ° C) 및 12 h/12 h 빛 어두운 조명 사이클에서 개별 장에 3 개월 유지. 일상적인 식단을 제공 하 고 매일 수돗물.
  2. 되도록 수술의 때에 토끼 3 kg 이상의 무게.
  3. Pentobarbital 나트륨 (체중 100 g 당 3 밀리 그램)와 복 주사로 토끼를 anaesthetize. 토끼는 발 핀치에 응답 하는 실패에 의해 anesthetized 완전히 다는 것을 확인 하십시오. 작업 절차 동안 운영 테이블에 토끼를 수정.
    참고: 되도록 모델링 절차 기간은 1 시간 미만.
  4. 머리 성장의 방향에 대 한 전기 면도기를 사용 하 여 근 위 경골 영역을 면도. Povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 피부를 소독.
  5. 펜 및 통치자 S. 구 균 (경골의 위쪽 끝 까지의 거리는 1.5 cm)로 분사에 대 한 드릴링 구멍 위치와 경골의 위쪽 끝을 표시 합니다. 드릴링 구멍 위치는 tibial 고원 중간 수평 다는 것을 확인 (그림 1A).
  6. 11 호 메스를 사용 하 여 경골 피부를 잘라내어 (그림 1B, C)과에 1 cm 절 개를 하 게. 전기 뼈 드릴 단위 (그림 1D)를 사용 하 여 경골에 2 m m 직경 구멍 펀치.
  7. 2mm 직경 및 높이 2 m m (그림 1E)의 뼈 왁 스의 실린더와 tibial 고원에서 2 m m 직경 구멍을 누릅니다. (그림 1F) tibial 고원의 수평 평면 여분의 뼈 왁 스를 제거 합니다. 2 m m 구멍 뼈 왁 스 (그림 1G)의 가득 차 있는지 확인 합니다.
    참고: 또는 혈액 오버플로 없이 구멍을 선택 하 여 구멍 뼈 왁 스의 전체 인지 확인 합니다.
  8. 과을 꿰 매십시오와 씹는 봉합 (그림 1H)에서 동물을 방지 하기 위해 수직 매트리스 봉합에 흡수 되기 쉬운 외과 봉합 사를 피부.
  9. (그림 1나) 1 mL 무 균 상태 인젝터와 1 x 108 미 균 솔루션 (체중 100 g 당 30 µ L)의 CFU/mL를 주사. 바늘 뼈 왁 스를 관통 하 고 주입 S. 구 균 솔루션 골 천천히 다는 것을 확인 하십시오.
  10. 모델링 후 열 손실을 피하기 위해 따뜻하고 깨끗 한 상황에서 동물을 유지. 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다. 일어나, 후 음식과 물에 대 한 무료 액세스와 개별 장에 토끼 집.

3입니다. 뼈 감염 모델의 평가

  1. 7, 14, 21, 감염 후 28 일, 토끼 토끼 위해 머리와 귀를 위해 밖으로 장소.
  2. Dipotassium ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA-K2) 항 응 혈 약 혈액 용기에 귀의 정 맥에서 혈액의 2 개 mL를 그립니다. 혈액 용기에 혈관에서 혈액의 1 mL를 그립니다. 실 온에서 651 x g 의 속도와 10 분 동안 혈 청 원심
    1. C-반응성 단백질 (CRP)에 의해 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 방법16및 혈액 생화학 분석기를 사용 하 여 전체 혈액에서 백혈구 (WBC)을 결정 합니다.
  3. 7, 14, 21, 감염 후 28 일, 한 모델 토끼 pentobarbital 나트륨 100 g 체중 당 3 밀리 그램의 복용량에서 anaesthetize. 11 호 메스를 사용 하 여 경골 피부 고과 (그림 2A)에서 2 cm 절 개를 하 게.
  4. 본 왁 스 청소. 전기 뼈 드릴 단위 (그림 2B)를 사용 하 여 두 개의 인접 한 4.8 m m 직경 구멍을 펀칭으로 회 저 성 뼈를 debride. Debride 회 저 성 골 수 및 알갱이 만듦 조직 뼈 숟가락 (그림 2C)를 사용 하 여.
    참고: 골 수에 남아 있는 뼈 조직을 피하려고 debridement 동안 뼈 조직을 청소.
  5. 긁 고 두 구멍 (그림 2D) 사이의 뼈 조직의 청소.
  6. 양 혈액 한 천 배지 위에 골의 1 mL를 확산. 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어 30-300 식민지의 접시를 선택 하 고 식민지의 수를 계산 합니다.
  7. 감염 후 28 하루의 끝에, 무릎 및 발목 관절의 가장자리를 따라 경골 표본 추출. 수정 24 h. Decalcify에 대 한 4 %paraformaldehyde 경골 표본 경골 표본 10 %EDTA 8 주 동안.
  8. 에탄올 희석의 등급된 시리즈에 경골 표본 탈수 하 고 후 파라핀 왁 스에 포함. 코로나 비행기에서 4 연속 5 µ m 단면을 잘라. 섹션 장비로 hematoxylin과 오신 (H & E) 얼룩 얼룩.
  9. 현미경을 사용 하 여 스테인드 섹션 보기와 기록 표준 소프트웨어로 가벼운 이미지를 전송.

4입니다. VCS 구슬의 준비

  1. 의료 학년 칼슘 염의 9.5 g vancomycin 염 산 염 분말 1 g을 추가 하 고 혼합된 힘에 정상적인 염 분의 3 mL를 추가 합니다. 믹스 그들을 철저 하 게 30-45에 대 한 주걱으로 s.
  2. 유연한 실리 카 젤 금형 (4.8 m m 직경 4.8 m m 높이의 실린더), 혼합된 제품을 놓고 금형을 flexing 하 여 VCS 비즈를 제거 하는 15 분 동안 실 온에서 건조 합니다.

5. 항생제 치료 및 자생 뼈의 이식

  1. 감염 후 28일 하루에 체중 100 g 당 3 밀리 그램의 복용량에서 pentobarbital 나트륨과 모델 토끼를 anaesthetize. 면도 전기 면도기를 사용 하 여 근 위 경골 지역. Povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 피부를 소독.
    참고: 모델링 절차 1 시간 미만 있는지 확인 합니다.
  2. 면도 전기 면도기를 사용 하 여 꼬리 영역 고 povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 꼬리를 소독.
  3. 수술가 위를 사용 하 여 꼬리를 줄이려고. 11 호 메스를 사용 하 여 꼬리 피부를 잘라내어 꼬리 뼈를 공개. 흡수 수술 봉합은 봉합을 씹는에서 동물을 방지 하기 위해 수직 매트리스 봉합 꼬리 지역에서 피부를 바느질.
  4. 모든 근육, 연 조직 및과 제거 합니다. 각 합동에 꼬리 뼈를 분리 하 고 메 마른 염 분을 포함 하는 100 m m 플라스틱 접시 뼈 조각을 전송.
  5. 곡선된 핀셋 (그림 2E)를 사용 하 여 골 수 구멍에 VCS 구슬 (4.8 m m 직경 및 높이 4.8 m m, 구슬의 조각 당 1.25 mg vancomycin의 실린더)의 4 개를 이식.
  6. 뼈 결함을 채우기 자생 뼈의 8 조각으로 핀셋 (그림 2E) 곡선 (2 mm 직경 및 각 작품 당 4 m m 높이의 실린더)를 사용 하 여.
  7. 과을 꿰 매십시오와 매트리스 봉합 방식 (그림 2F) 흡수 수술 봉합 피부.
    참고: 수술 하는 동안 25 ° C에 온도 유지.
  8. 수술 후 열 손실을 피하기 위해 따뜻하고 깨끗 한 상황에서 동물을 유지. 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다. 일어나, 후 음식과 물에 대 한 무료 액세스와 개별 장에 토끼 집.

6입니다. 항생제 활동의 평가

  1. 토끼 해결사에 토끼를 넣고 2, 4, 6, 8 주 치료 후에 머리와 귀를 위해 외부 장소.
  2. K2 EDTA 항 응 혈 약 혈관과 귀의 정 맥에서 혈액을 그립니다. 혈액 용기에 혈관에서 혈액의 1 mL를 그립니다. 실 온에서 651 x g 의 속도와 10 분 동안 혈 청 원심
  3. ELISA 방법16혈액 생화학 분석기와 C-반응성 단백질 (CRP)를 사용 하 여 전체 혈액에는 백혈구 (WBC)를 결정 합니다.

7입니다. 뼈 재생의 평가

  1. 이상으로 주입 하 여 토끼를 안락사 pentobarbital 나트륨, 8 또는 12 주 치료 후의 끝의 복용량.
  2. 무릎과 발목 관절의 가장자리를 따라 경골 표본 추출. 근육과 fascial 레이어 debride.
  3. 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)를 사용 하 여 경골의 구조를 분석 합니다. 선택 타원형 지역 4.8 m m 직경 9.6 m m 만큼 관심 (ROI)의 지역. 비트맵 데이터를 사용 하 여 3D 모델 이미지를 재구성 합니다.
  4. 뼈 볼륨/조직 볼륨 (BV/TV), 배수 두께 (Tb.Th)의 비율의 점수를 선택 trabecula 번호 (Tb.N)와 배수 분리 (뼈 재생을 평가 하기 위해 Tb.Sp)from the3D 모델.

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결과

뼈 감염 모델의 평가
S. 구 균감염, 후 토끼의 병 적인 발현 클리닉에서 만성 도왔습니다의 대표적인 증상에 유사 했다. 우리의 연구에서 30 토끼 했다 감염, 모델 그룹, 대상 및 10 토끼 제어 동물으로 복종 되었다. 모든 모델 토끼는 sinuses(그림 3)에서 흐름 흰색과 노란색 고름으로 경골 로컬 사이트의 sinuses 감염. H & E 염색의 결과 세균성 집계 모델 그룹에서 죽은 뼈 주위에 있는 정상적인 osteocytes 식별할 수 없는 나타냅니다. CRP와 WBC의 수준을 모델 그룹에서 제어 그룹 (그림 3B) 보다 높다. 회 저 성 골 lysates 모델 그룹에 대 한 식민지의 수를 증가 (그림 3

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토론

이전 연구에서 다양 한 종류의 동물 모델 둘 다 급성과 만성 뼈 감염; 공부 건설 되었다 그러나, 이상적인 모델에 대 한 검색은 여전히17,18을 지속합니다. 또한, 이상적인 뼈 감염 모델 예상 시뮬레이션 모델링 기간 동안 임상 설정에서 뼈 감염의 병 적인 특성, 유지 수행 하기 쉽고 저렴 한 비용. 지금까지, 토끼 뼈 감염 모델은 염증 성 뼈 질병 연구에 가장 일반적인 모델으로 토끼 사용할 수 있고, 가능한 저렴 한. 우리의 이전 연구에서 우리는 사망률 및 다양 한 몸 무게와 토끼의 감염 속도 비교. 체중 3 kg 이상; 해야 했다 결과 그렇지 않으면, 있을 것입니다 높은 사망률 또는 haematosepsis 및 더 높은 사망 율의 발생률이 높은 수술 후.

이전 연구와는 달리 토끼 뼈 감염 모델 및 우리의 연구에서 항생제 치료는 인간의 질병과 수술 치료의 병 적인 특성으로 ...

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공개 사항

저자는이 작품에 관심의 없습니다 충돌 보고합니다.

감사의 글

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81803808, 81873062), 절 강 지방 의료 및 건강 과학 및 기술 기금 (2017KY271)는 과학 및 기술 프로젝트의 강성 (2017C 37181)에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수성 외과 봉합사Jinghuan18S0604A
무균 인젝터Jinglong20170501
뼈 왁스ETHICONJH5CQLM
CCD 카메라올림푸스DP72
EDTA-K2 항응고제 혈관XINGE20170802
전기 뼈 드릴 유닛Bao KangBKZ-1
전기 면도기Codos3800
유연한 실리카 겔 몰드 WRIGHT1527745
Hematoxylin 및 Eosin 염색 키트Beyotime20170523
Luria-Bertani 배양 매체Baisi Biothchnology20170306
의료용 칼슘 황산염WRIGHT1527745
마이크로컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT)BrukerSkyScan 1172 
현미경OlympusCX41
뉴질랜드 흰 토끼Zhejiang Experimental Animal Center SCXK 2014-0047
No. 11 메스 Yuanlikang20170604
생리식염수Mingsheng20170903
PBS TBD(Jingyi)20170703-0592
펜토바르비탈 나트륨Merk2070124
포비돈-요오드 용액Lierkang20170114
S. aureus 동결 건조 분말중국 일반 미생물 문화 수집 센터ATCC 6538
양 혈액 한천HuanKai 미생물 3103210
트립 간장 한천 플레이트HuanKai 미생물3105697
트립 콩 국물 튜브HuanKai 미생물3104260
VancomycinLillyC599180

참고문헌

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  14. Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612(2014).
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  16. Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
  17. Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152(2016).
  18. Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251(2016).
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  23. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
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