Summary
מחקר זה מציג את הארנב משופרת של מודל נגוע Staphylococcus aureus על ידי חסימת את אותה כמות של חיידקים במח העצם. סולפט סידן ואנקומיצין טעון ועצמות autogenous משמשות לטיפול ותיקון אנטיביוטיקה ועצמות. הפרוטוקול יכול להיות מועיל עבור הלומדים העצם זיהום והתחדשות.
Abstract
עצם התוצאות זיהום מפני פלישה חיידקים, אשר קשה מאוד לטפל בחדר ניתוח הקליני, אורטופדי, טראומטי. הזיהום העצם עלולה לגרום לדלקת ממושכת, דלקת עצם מוגלתית, והמעלית העצם בסופו של דבר. הקמת מודל בעלי חיים ריאלי לשחזור חשובה עצם זיהום מחקר וטיפול אנטיביוטי. כמודל ויוו, דגם ארנב נעשה שימוש נרחב במחקר זיהום של העצם. עם זאת, מחקרים קודמים על הארנב עצם מודלים זיהום כי מצב זיהום הוא לא עקבי, כמו גם כמות החיידקים משתנה. מחקר זה מציג שיטה כירורגית משופרת עבור גרימת זיהום עצם על ארנב, על ידי חסימת החיידק במח העצם. לאחר מכן, הערכות רשתי יכול להתבצע כדי לאמת את שיטת הדוגמנות.
באופן כללי, להסיר רקמות מתות רקמת נמק, השרשה של סידן טעון ואנקומיצין סולפט (VCS) הם השולט טיפול אנטיביוטי. למרות סולפט סידן ב VCS הטבות osteocyte זוחלים, צמיחת עצם חדשה, עצם מסיבית פגמים להתרחש לאחר להסיר רקמות מתות. עצם autogenous (אלב) היא אסטרטגיית מושך כדי להתגבר על עצם פגמים לטיפול של פגמים עצם מסיבית לאחר להסיר רקמות מתות נמק עצם.
במחקר זה, השתמשנו בעצם הזנב כמו עצם autogenous הושתלו בתוך עצם הפגם. עצם תיקון נמדדה באמצעות מיקרו-מחושב-טומוגרפיה (מיקרו-CT) וניתוח היסטולוגית לאחר להקריב חיה. כתוצאה מכך, בקבוצה VCS, עצם והמעלית בעקביות הושג. לעומת זאת, האזורים פגם עצם בקבוצה VCS-AB ירדו באופן משמעותי. שיטת מידול נוכח תיאר שיטה לשחזור, ריאלי, יציב כדי להכין מודל זיהום של העצם. הטיפול VCS-AB הביא נמוכים, והמעלית עצם לאחר טיפול אנטיביוטי. המודל זיהום עצם משופרת והטיפול שילוב של VCS ועצמות autogenous יכולים להיות לעזר בלימוד מנגנוני כבסיס זיהום ועצם התחדשות העצם הרלוונטי ליישומים אורתופדיים טראומה.
Introduction
דלקת העצם נובע בדרך כלל חיידקים או אחרים הפלישה מיקרואורגניזם לאחר טראומה, שבר או מחלות אחרות עצם1. עצם זיהום עלול לגרום רמה גבוהה של דלקת והרס רקמות העצם. במרפאה, Staphylococcus aureus (S. aureus) הוא סוכן סיבתי הדומיננטית של העצם זיהום2,3. הזיהום עצם מכאיב, מתישה, ולוקח בדרך כלל קורס כרונית קשה מאוד לטפל4. בזמן הנוכחי, הטריה של רקמת נמק, השתלת של סידן טעון ונקומיצין (VCS) חרוזים אושרו כמו אסטרטגיית יעיל לשליטה זיהום מקומי5,6. עם זאת, 10% עד 15% מהמטופלים חוו של תהליך התיקון עצם ממושך, מתעכב איחוד או והמעלית לאחר טיפול נגד זיהום7. קטע גדול של פגם עצם הבעיה הקשה ביותר מנתחים אורטופדיים. שתל עצם אוטולוגי נחשב התחליף האופטימלי עצם עצם הטיפול, והמעלית8,9.
נכון להיום, רוב המחקרים על עצם זיהום, עצם אוטולוגי השרשה נערכו בסוגים שונים של מודלים בעלי חיים, כגון חולדות, ארנבים, כלבים, חזירים, כבשים10,11. ארנב מודלים הנפוץ ביותר ללימודים דלקת העצם, כמו הראשונה שבוצעה על-ידי נורדן, קנדי בשנת 197012,13. במחקר הקודם שלנו, השתמשנו מודלים ארנב בעקבות השיטה של נורדן, מצאנו כי הכמות של S. aureus מוזרק מח העצם יכול לא ניתן לכמת במדויק, כפי דולף הדם. מח עצם הוביל חיידקים פתרון גלישה.
מאמר זה מציג שיטה כירורגית משופרת עבור גרימת זיהום עצם על ארנבים. בסופו של ההליך, בדיקת דם לביוכימיה, בדיקה בקטריולוגית של היסטופתולוגיות בוצעו כדי לאמת את המודל זיהום של העצם. לאחר מכן, VCS הושתל לעכב זיהום, עצם autogenous הושתל לקדם התחדשות העצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ארנבים השתמשו במחקר הנוכחי טופלו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל ההליכים ניסיוני הובילו את החוקים של ביואתיקה הוועדה של ג'ה-ג'יאנג האקדמיה של הרפואה הסינית המסורתית.
1. הכנת ההשעיה חיידקי
- להמיס 0.5 מ ג של S. aureus ליופיליזציה אבקת (בקרת האוויר 6538) עם mL 0.3 לוריא-Bertani תרבות בינוני. מערבבים התלוי לחלוטין.
- צובעות את המתלים חיידקים על פלטות אגר סויה tryptic, דגירה מושבות חיידקים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
- בחר מושבת חיידקים יחיד ויוצרים יחידה (CFU) ותרבות סויה tryptic צינורות מרק עבור ה 24 בצע גלובלי עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ולקבל אמצע-לוגריתמי הצמיחה חיידקים שלב לאחר 16 עד 18 h, כאשר ערך צפיפות אופטית (OD) הוא 0.6-600 nm 14.
- העברת 1 מ"ל של השעיה חיידקים לתוך שפופרת צנטרפוגה. צנטריפוגה למשך 5 דקות-825- g ו- 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend. ולשטוף את החיידקים עם µL 100 תמיסת פוספט buffered (PBS); חזור על שלב זה 3 פעמים. לבסוף, resuspend חיידקים עם 3 מ"ל של PBS.
-
מעריכים את ריכוז החיידקים באמצעות של מקפרלנד turbidimetry15.
- העברת 100 עד 500 µL של חיידקים השעיה צינור ערכי צבע מוחלטים עד עכירות שווה מקפרלנד 0.5 סטנדרטי.
- להעריך עכירות על ידי השוואה חזותית מקפרלנד 0.5, התוכן של חיידקים מגיע כ-108 CFU/mL.
הערה: ודא כי אמצעי האחסון של חיידקים השעיה מספיקה עבור הפרוטוקולים הבאים. עבור כל ארנב, הנפח של חיידקים ההשעיה היא פחות מ 1 מ"ל.
- להעביר 0.2 מ"ל של השעיה חיידקי צלחת אגר ולהחיל אותו באופן שווה. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 ח ספירת מושבות חיידקים כדי לאמת את CFU של חיידקים השעיה.
2. הכנת מודלים זיהום עצם
- לשמור זכר בניו זילנד וארנבים לבנים, בגיל 3 חודשים, בכלובים בודדים, תחת תנאים אוויר מבוקר (20 ± 1 ° C) ו- h 12 h 12 מחזורים תאורה בהירה-כהה. מציעים דיאטה שגרתית, ברז מים מדי יום.
- להבטיח כי בזמנו של הניתוח כי הארנב שוקל יותר מ- 3 ק ג.
- להרדים ארנבים באמצעות בקרום הבטן הזרקת סודיום פנטוברביטל (3 מ ג לכל 100 גרם של משקל הגוף). ודא ארנבים הם מורדם לחלוטין על ידי כשל להגיב הפינצ כפת. לתקן את הארנבים על שולחן הניתוחים במהלך מבצע הליך.
הערה: ודא לדוגמנות משך ההליך הוא פחות מ 1 h. - גילוח באזור השוקה צינתור באמצעות מכונת גילוח חשמלית נגד כיוון צמיחת השיער. לחטא את העור על-ידי החלת פתרון povidone יוד.
- סמן את החלק העליון של עצם השוקה ואת המיקום חור הקידוח להזרקה עם S. aureus (המרחק לקצה העליון של עצם השוקה הוא 1.5 ס מ) עם עט, השליט. ודא מיקומי החורים קידוח נמצאים בליבה השוקה אופקית (איור 1א').
- שוקה העור באמצעות איזמל מס 11 גזורה עושים חתך 1 ס מ ב קרום העצם (איור 1ב, ג). פונץ ' חור בקוטר 2 מ מ עצם השוקה באמצעות יחידת מקדחה חשמלית עצם (איור 1D).
- הקש את החורים בקוטר 2 מ מ השוקה עם גליל של שעווה לאיטום של 2 מ מ קוטר וגובה 2 מ מ (איור 1E). הסר את השעווה חילוף עצם לאורך מישור אופקי השוקה (איור 1F). בדוק החור 2 מ מ מלא שעווה לאיטום (איור 1G).
הערה: להבטיח כי החורים מלאים של שעווה לאיטום בבדיקת החור עם או בלי דם גלישה. - לתפור קרום העצם, עור בעל תפירה שנספג בתפר המזרן אנכי כדי למנוע את החיה לועס את התפרים (איור 1H).
- להזריק עונה 1 פרק 10-8 CFU/mL של S. aureus פתרונות (30 µL לכל 100 גרם של משקל הגוף) עם מזרק asepsis 1 מ"ל (איור 1אני). ודא המחטים לחדור את השעווה עצם להזריק את הפתרון S. aureus לתוך מח עצם לאט.
- שמור את החיה בתנאים חמים ונקיים כדי למנוע איבוד חום לאחר דוגמנות. לפקח על קצב הנשימה וקצב הלב. לאחר, מתעוררת בית הארנבים בכלובים בודדים עם גישה חופשית מזון ומים.
3. הערכה של מודל זיהום עצם
- ימים 7, 14, 21, 28 לאחר ההדבקה, למקם ארנבים המתקנת ארנב עם ראשו ועל אוזנו מחוץ המתקנת.
-
לצייר 2 מ"ל של דם מן הורידים אזני אל גורם מכיל של dipotassium ethylenediaminetetraacetic קרישה דם (EDTA-K2) חומצה. צייר 1 מ"ל של דם מן כלי דם לתוך מיכל דם. Centrifuge את הנסיוב 10 דקות עם מהירות של x 651 g בטמפרטורת החדר.
- לקבוע בספירת תאי הדם הלבנים (WBC) בדם שלם באמצעות מנתח הביוכימי דם, חלבון מגיב C (חלבון) מאת מקושרים-אנזים immunosorbent assay שיטה (אליסה)16.
- ימים 7, 14, 21, 28 לאחר ההדבקה להרדים אחד דגם ארנב עם סודיום פנטוברביטל במינון של 3 מ"ג לכל 100 גרם במשקל הגוף. שוקה העור באמצעות איזמל מס 11 גזורה עושים חתך 2 ס מ ב קרום העצם (איור 2א).
- שעווה לאיטום נקי. הרקמה המתה נמק עצם באמצעות חבטות שני חורים בקוטר של מ מ 4.8 סמוכים, באמצעות יחידת מקדחה חשמלית עצם (איור 2B). הרקמה המתה נמק במח העצם ואת רקמות פרור באמצעות כפית עצם (איור 2C).
הערה: רקמת העצם נקייה במהלך הטריה להימנע רקמת העצם שנותרה במח העצם. - לגרד ולנקות את רקמת העצם בין שני החורים (איור 2D).
- מורחים 1 מ"ל של מח העצם על פלטות אגר דם כבשים. דגירה צלחות בן לילה ב 37 º C. בחר צלחות של המושבות 30-300, לחשב את מספר מושבות.
- בקצה של 28 יום לאחר ההדבקה, לחלץ שוקה דגימות בשולי המפרקים בברך ובקרסול. לתקן את דגימות שוקה ב 4% paraformaldehyde עבור ה 24 Decalcify דגימות שוקה EDTA 10% למשך 8 שבועות.
- מייבשים את דגימות שוקה בסדרה מדורגת של אתנול דילולים ולאחר מכן הטבע בפרפין. חותכים 4 ברציפות 5 מיקרומטר סעיפים מן המטוסים הילתית. כתם מקטעים עם hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת ערכת.
- השתמש במיקרוסקופ כדי להציג את סעיפים מוכתמים ולהקליט המשודרת אור תמונות עם תוכנה סטנדרטית.
4. הכנת חרוזים VCS
- להוסיף 1 גר' אבקה הידרוכלוריד ואנקומיצין 9.5 גר' סולפט סידן יש לזה סיווג רפואי, ולאחר מכן להוסיף 3 מ"ל של תמיסת מלח אל הכוח מעורבת. לערבב אותם ביסודיות עם מרית במשך 30 עד 45 s.
- מקם את המוצר מעורב לתוך תבנית גמישה סיליקה ג'ל (גליל של 4.8 מ"מ קוטר וגובה 4.8 מ"מ) ולאחר יבש בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות להסיר את החרוזים VCS על ידי כיפוף העובש.
5. השרשה של עצם Autogenous וטיפול אנטיביוטי
- להרדים דגם ארנבים עם סודיום פנטוברביטל במינון של 3 מ"ג לכל 100 גרם משקל ביוםה 28 לאחר ההדבקה. גילוח באזור השוקה צינתור באמצעות מכונת גילוח חשמלית. לחטא את העור על-ידי החלת הפתרון povidone יוד.
הערה: ודא כי הנוהל הדוגמנות אינו פחות מ 1 h. - גילוח באזור הזנב באמצעות מכונת גילוח חשמלית ולחטא את הזנב על-ידי החלת הפתרון povidone יוד.
- לחתוך את הזנב באמצעות מספריים כירורגיים. לחתוך את הזנב העור באמצעות איזמל מס 11 ולחשוף את עצם הזנב. . אתפור את העור-באזור הזנב בתפרים נספגים כירורגי בתפר המזרן אנכי כדי למנוע את החיה לועס את התפרים.
- הסר כל שריר, רקמות רכות, קרום העצם. לנתק את עצם הזנב כל מפרק ולהעביר שהרסיס צלחת פלסטיק 100 מ מ המכילה מלח סטרילית.
- שתל 4 חתיכות של VCS חרוזים (גליל של 4.8 מ"מ קוטר וגובה 4.8 מ"מ, 1.25 מ ג ונקומיצין לכל פיסת חרוז) לתוך חלל מוח באמצעות פינצטה מעוקל (איור 2E).
- למלא את הפגם עצם עם 8 חתיכות של עצמות autogenous (גליל בקוטר 2 מ מ, גובה 4 מ מ לכל כל חתיכה) באמצעות מעוקל פינצטה (איור 2E).
- לתפור קרום העצם, עור בעל כירורגי נספגים בצורה תפר המזרן (איור 2F).
הערה: לשמור על הטמפרטורה 25 ° C במהלך הניתוח. - שמור את החיה בתנאים חמים ונקיים כדי למנוע איבוד חום לאחר ניתוח. לפקח על קצב הנשימה וקצב הלב. לאחר, מתעוררת בית הארנבים בכלובים בודדים עם גישה חופשית מזון ומים.
6. הערכות של פעילות לאנטיביוטיקה
- מכניסים ארנבונים מתקן ארנב, ולמקם את ראשו ועל אוזנו מחוץ המתקנת 2, 4, 6 ו- 8 שבועות לאחר הטיפול.
- דם מן הוורידים אוריקולארית עם EDTA-K2 כלי דם קרישה. צייר 1 מ"ל של דם מן כלי דם לתוך מיכל דם. Centrifuge את הנסיוב 10 דקות עם מהירות של x 651 g בטמפרטורת החדר.
- לקבוע את ספירת תאי הדם הלבנים (WBC) בדם שלם באמצעות מנתח הביוכימי דם, חלבון מגיב C (חלבון) על-ידי מטוס בשיטת ELISA16.
7. הערכות של התחדשות העצם
- המתת חסד ארנבים באמצעות הזרקת עם מעל במינונים של סודיום פנטוברביטל, בקצה של 8 או 12 שבועות לאחר הטיפול.
- תמצית דגימות השוקה, בשולי המפרקים בברך ובקרסול. הרקמה המתה השרירים ושכבות fascial.
- ניתוח המבנה של שוקה באמצעות טומוגרפיה שחושב מיקרו (מיקרו-CT). לבחור של אזור אליפטי 4.8 מ"מ קוטר של 9.6 ארוך אזור בעל עניין (ROI). לשחזר תמונות דגם התלת-ממד באמצעות מפת סיביות נתונים.
- בחרו עשרות רבות של היחס בין נפח אחסון/רקמות עצם (BV/טלוויזיה), עובי trabecular (Tb.Th), trabecula (Tb.N) ומספר ההפרדה trabecular (Tb.Sp)from the3D מודלים להערכת התחדשות העצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה של מודל זיהום עצם
לאחר זיהום עם S. aureus, ביטויים פתולוגיים ארנבים היו הדומה הסימפטום הייצוגי ביותר של דלקת עצם מוגלתית כרונית במרפאה. במחקר שלנו, ארנבים 30 היו נגועים, נתון כקבוצה מודל, ונחשפו ארנבים 10 היו כמו חיות בקרת. כל הארנבונים דגם יש נגוע הסינוסים של האתר המקומי השוקה, עם מוגלה צהוב ולבן זרימת מ הסינוסים (איור 3א). התוצאות של צביעת המטוקסילין מצביעים על כך אגרגטים חיידקי ממוקמים סביב עצם מת בקבוצה מודל, אין אפשרות לזהות את osteocytes רגילה. רמות ה-CRP, WBC גבוהים בקבוצה מודל מאשר קבוצת הביקורת (איור 3ב). Lysates עם נמק מח העצם הם רץ בעירום על פלטות אגר, אשר לגרום עלייה במספר מושבות עבור קבוצת מודל לאחר ההדבקה (איור 3ג'). בסוף דוגמנות, היו ארנבים 3 מת בגלל זיהום רציני. הארנבים נגוע הנותרים זוהו כמודל זיהום עצם, חולקו 3 קבוצות: מודל, VCS קבוצה, וקבוצת VCS-AB.
הערכות של התחדשות העצם ופעילות לאנטיביוטיקה
2, 4, 6, ו- 8 שבועות לאחר הטיפול עם VCS או VCS-AB, רמות ה-CRP, WBC מופחתים בצורה משמעותית (איור 4א). לאחר 12 שבועות של השרשת VCS ו להשתלת עצם הטיביאלי פגמים של קבוצת VCS-AB נראה coalescent באופן מלא. משטחים השוקה של קבוצת VCS-AB הם שטוח יותר מזה של הקבוצה VCS. 2D שחזור תמונות מצביעים על עלייה פרוגרסיבית בכרך העצם במהלך תקופת 12 בשבוע לאחר הטיפול עם VCS-AB ו- VCS, תוך איבוד העצם הוא משמעותי בקבוצה מודל (איור 4B). כדי לנתח את האינדקסים כמותית של התחדשות העצם, אזור אליפטי 4.8 מ"מ קוטר, 9.6 מ מ אורך נבחר אזור בעל עניין (ROI) (איור 4C), דגם התלת-ממד תמונות שוחזרו בעזרת מפת סיביות נתונים. האינדקסים של מיקרו-CT BV/טלוויזיה בקבוצה מודל היו נמוכים משמעותית מאשר כי VCS ו VCS-AB קבוצות. הציונים Tb.N ו- Tb.Th בקבוצה VCS-AB היו גבוהות באופן משמעותי מאלה מודל ו VCS קבוצה. יתר על כן, התוצאות Tb.Sp בקבוצה VCS-AB הם נמוך במידה ניכרת מזה מודל וקבוצת VCS (איור 4D).
תוצאות אלו מציע הזיהום הזה עם הגדלת WBC ה-CRP בקבוצה מודל, הניתנות להפחתה באמצעות VCS את גורם S. aureus . ההשתלה של VCS נחשב טיפול אנטיביוטי אופטימלית. אולם, עצם הפגם הוא מקהים קבוצת VCS. VCS וטיפול עצם autogenous להגביר את עובי trabeculae ומספר trabeculae ולהחליש את ההפרדה trabecular. הטיפול VCS-AB הראה יכולת לקדם ריפוי עצם.
איור 1 . הכנה כירורגי של המודל זיהום עצם. (א) מראה חבטות למקם על עצם השוקה. המרחק בין המיקום חור הקידוח הזרקת עם S. aureus לקצה העליון של שוקה הוא כ- 1.5 ס מ. (B) החתך עשוי בעור לחשוף קרום העצם. (ג) מראה חתך שנעשה דרך קרום העצם כדי לחשוף את עצם השוקה. ניקוב (D) חור בקוטר 2-מ מ עצם השוקה. (E) מילוי הבור בקוטר 2 מ מ מלא שעווה לאיטום. (F) חתוך שעווה לאיטום חילוף. (G) הצג השעווה עצם מילוי עצם הפגם. (H) לתפור את קרום העצם ואת העור. (אני) הכנס עם פתרון S. aureus . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . הכנת להשתלת עצם וטיפול אנטיביוטי. (א) חתך שנעשה על העור כדי לחשוף את קרום העצם. (B) אגרוף שני חורים בקוטר מ מ 4.8 סמוכים. (ג) הרקמה המתה נמק עצם, מח עצם דלקתיות. שריטה (D) ולנקות את רקמת העצם בין שני החורים לעשות מעגל ארוך של 4.8 מ"מ קוטר 9.6 מ מ אורך. (E) למלא החור עם VCS ו להשתלת עצם. (F) לתפור את קרום העצם ואת העור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . הערכה של העצם זיהום דגם- (א) תכונות המראה של הרגליים ארנב נגוע S. aureus, ותמונות histopathology אופייני של עצם השוקה ארנב בקבוצות דגם ושליטה. החץ הכחול: osteocyte; חץ ורוד: עצם trabeculae; חץ צהוב: אגרגטים חיידקי; החץ הירוק: עצם מת. (B) WBC של ה-CRP תוצאות הסרום ארנב בנקודות זמן של לפני דוגמנות, 7, 14, 21, 28 ימים לאחר ההדבקה. העמודות מייצגות את ±SE מתכוון, *p < 0.05 לעומת קבוצת הביקורת. (ג) מספר מושבות חיידקים במח שוקה בספירה בעקבות דגירה בין לילה. העמודות מייצגות את ±SE מתכוון, *p < 0.05 לעומת המושבה לספירה בכל יום 0. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הערכות של התחדשות העצם ופעילות לאנטיביוטיקה. (א) התוצאות של WBC, ה-CRP בנסיוב ארנב בנקודות זמן של 2, 4, 6 ו- 8 שבועות לאחר ההשתלה של VCS ו VCS-AB, הנקודות מייצגות של ±SE מתכוון, #p < 0.05 ו *p < 0.05 לעומת הקבוצה מודל. (B) המקטע הילתית תמונות של שוקה נותחו על ידי מיקרו-טי (C) המיקום של רועי. נפח אחסון/רקמות (D) המופע היסטוגרמות העצם (BV/טלוויזיה), עובי trabecular (Tb.Th), trabecula (Tb.N) ומספר עשרות ההפרדה trabecular (Tb.Sp) רועי החל הארנבונים חמישה לכל קבוצה. העמודות מייצגות את ±SE מתכוון, *p < 0.05 לעומת קבוצת הביקורת או קבוצת מודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . ציר הזמן של כל ההליכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקרים קודמים, נבנו סוגים שונים של מודלים בעלי חיים כדי ללמוד הן זיהום אקוטי וכרוני העצם; עם זאת, חפש את המודל האידיאלי עדיין נמשכת17,18. בנוסף, המודל זיהום עצם אידיאלי צפוי לדמות את מאפייני פתולוגי של העצם זיהום בסביבה קלינית, תוך התקופות הדוגמנות, להישאר זולה וקלה לביצוע. עד כה, המודל זיהום של העצם ארנב הוא המודל הנפוץ ביותר במחקר מחלת עצם דלקתיות, כמו הארנבים הם זמינים, ריאלי וזולה. במחקר הקודם שלנו, השווינו את שיעור התמותה ואת שיעור ההידבקות ארנבים עם משקולות בדרגות שונות של הגוף. התוצאות הראו כי משקל הגוף צריך להיות יותר מ 3 ק ג; אחרת, יהיה שיעור המוות גבוה או ששכיחות haematosepsis, שיעור תמותה גבוה יותר לאחר הניתוח.
בניגוד מחקרים מוקדמים יותר, ארנב העצם זיהום מודלים של טיפול אנטיביוטי במחקר שלנו הם עקביים עם מאפיינים פתולוגיים של הטיפול הכירורגי של האדם. במחקר הקודם, חיות מוזרק עם נתרן morrhuate ו S. aureus לא היה מצב פיפטות יותר מ- 60 יום. יתר על כן, שיעור התמותה היה יותר מ- 20%12,19. העודפים S. aureus פתרון עצם פגמים הוכחו לזירוז קצב זיהום נמוכה. אנחנו פעם שעווה לאיטום כדי למלא את החור 2 מ מ על עצם השוקה, כדי לחסום את הפתרון S. aureus במח העצם, ומבטיחים כי החורים היו מלאות שעווה לאיטום בבדיקת החור עם או בלי דם גלישה. כמו העובי של השוקה הארנב היה 2 מ מ, צעדנו גליל של 2 מ מ קוטר, 2 מ מ גובה עצם שעווה לתוך החורים בקוטר 2 מ מ, אשר הבטיחו את השעווה עצם מילא את החלל, לא יכול לחדור מח העצם. יתר על כן, כמו שעווה העצם היה גמיש ויציב, זה מלא החורים ולא יכול להמיס או להגיב עם מח עצם. במחקר שלנו, ביום ה-28 לאחר ההדבקה, שעווה עצם עדיין היה שלם, מלא מלא החורים. כפי המשקולות של ארנבים היו יותר מ- 3 ק ג פחות 3.2 ק ג, הנפח של חיידקים הבולם היה µL 900 כדי 960 µL. בגלל המהירות האיטית של הזרקת ותפקוד חסימה של שעווה לאיטום, אמצעי אחסון זה של חיידקים השעיה יכול להיות מוזרק מח העצם ללא לחץ גבוה. התוצאות הראו כי פרוטוקול זה מבטיח את הכמות של S. aureus נגוע במח העצם. חור בקוטר 2 מ מ היה אגרוף את שוקה כדי להבטיח כי המרחק לקצה העליון של עצם השוקה הוא 1.5 ס מ, אשר מאתרת את החור-השוקה, ולהבטיח מספיק שטח הרקמה המתה של שתל VCS חרוזים ועצמות autogenous בטיפול הבא. במהלך תהליך דוגמנות, ארנבים 3 מתו בגלל זיהום רציני. הארנבים נשארו מזוהה העצם זיהום ארנבים, שיעור הזיהום ב הארנבים הנותרים היה 100%. לעומת פרוטוקולים זיהום עצם אחרים, כגון ההשתלה של ספוגים ספוגה S. aureus או ההשתלה של חומר זר, שלנו מקרוב לדמות עצם זיהום בסביבה קלינית ומנהלי יש השפעה קטנה על נהלים, כזה להסיר רקמות מתות נמק עצם, טיפול אנטיביוטי.
אבחון דלקת העצם הוא אתגר המנתחים. תוצאות הבדיקה מעבדה, כולל זיהוי סמן לדלקת סרום, מיקרוביולוגיה ניתוח וניתוח histopathology שימשו כדי להעריך את העצם זיהום קליני הגדרות20. בנוסף, אבחון והדמיה, כמו אולטרסאונד, רדיולוגיה, טומוגרפיה, דימות תהודה מגנטית או ספקטרוסקופיית ראמאן הוחלו לזהות העצם זיהום21. למרבה הצער, אבחון דלקת עצם מוגלתית באמצעות שיטות הדמיה לעיתים קרובות מתעכב בגלל נמק עצם difficult לזהות על-ידי רדיוגרפיה רגיל עד שבוע 3 של זיהום. במחקר שלנו, השתמשנו סרום דלקת סמן זיהוי ו histopathology ניתוח כדי להעריך את העצם זיהום מודלים, כמו שיטות אלה היו יעיל, ניתן לנתח האינדקסים היו רגישים. הבאים היו הצעדים החשובים ביותר של הליך כירורגי כדי ליצור מודל זיהום עצם במחקר שלנו. בחר את הארנבים עם משקל הגוף המתאים כדי לבצע את הניתוח והטיפול. לשמור על סביבה נקייה במהלך ההליך העלאת וכירורגי ולהבטיח בתנאים חמים בעקבות פרוטוקול הליך כירורגי. חור בקוטר 2 מ מ בעצם השוקה, להבטיח, שהמרחק לקצה העליון של עצם השוקה הוא כ- 1.5 ס מ. למלא החור עם שעווה לאיטום ו לתפור את קרום העצם ואת העור כדי לחסום את הפתרון חיידקים. להלן הצעדים החשובים ביותר של טיפול אנטיביוטי. ודא זיהום עצם פתולוגי של הארנבים על ידי גילוי WBC דם ואת ה-CRP של הנסיוב. הרקמה המתה נמק עצם לחלוטין, אגרוף שני חורים בקוטר מ מ 4.8 סמוכים, לגרד ולנקות את רקמת העצם בין החורים 2. שתל 4 חתיכות של חרוזים VCS ו- 8 פיסות עצם autogenous לתוך מוח העצם ועל עצם הפגם.
לאחר טיפול אנטיביוטי, הבחנו כי הארנבים בקבוצה VCS-AB היה פוטנציאל osteogenic גבוה יותר בקבוצה VCS. ייתכן כי עצם autogenous מכיל osteocytes מופעל ועצמות עצם היווצרות גורמי גדילה, אשר מייצרים מטריצת העצם לאורך פני השטח של השתל, ואילו השפלה של VCS גורם נדיר מטריקס-האזור פגם. התוצאות שלנו מציינים כי עצם autogenous יש את היכולת osteogenic מעולה. למרות קצירת עצם autogenous מוגבל נפח, כרוך התחלואה באזור התורם, החשיבות של עצם autogenous אינו זניח22,23,24. במחקר שלנו, עצם autogenous נרכשה מעצם הזנב, אשר מונע פגיעה מערכתית, הקטנת שיעור המוות בהשוואה צובר autogenous עצם מעצמות iliac. בשתל עצם בעצם הזנב הוא עשוי להיות החומר grafting מועדף המחקר בבעלי חיים של העצם זיהום.
לסיכום, דגם משופר הארנב של העצם זיהום הוקמה במחקר זה. דלקת אינדקסים ואינדקסים הביוכימי בדם שימשו כדי להעריך את המודל זיהום של העצם. כמו כן, לאחר טיפול אנטיביוטי, ניתוחים רב ברמת בוצעו כדי לזהות פעילות לאנטיביוטיקה ויכולת התחדשות העצם. דוגמנות, הליכי טיפול ושיטות הערכה הם ריאלי ואמין. מחקרים נוספים יתרכז ניצול של ריבוי מודאליות התקנים חזותי לעקוב אחר התהליך פיפטות של העצם זיהום ואת תהליך התיקון העצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים בעבודה זו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81803808, 81873062), ג'ג'יאנג המחוז רפואי, מדע הבריאות בטכנולוגיית קרן (2017KY271) ו המדע ואת הטכנולוגיה פרוייקט של בפרובינצית ג'ה-ג'יאנג (2017C 37181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absorbable surgical suture | Jinghuan | 18S0604A | |
| asepsis injector | Jinglong | 20170501 | |
| bone wax | ETHICON | JH5CQLM | |
| CCD camera | Olympus | DP72 | |
| EDTA-K2 anticoagulant blood vessel | XINGE | 20170802 | |
| Electric bone drill unit | Bao Kang | BKZ-1 | |
| Electric shaver | Codos | 3800 | |
| flexible silica gel mold | WRIGHT | 1527745 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime | 20170523 | |
| Luria-Bertani culture medium | Baisi Biothchnology | 20170306 | |
| Medical-grade calcium sulphate | WRIGHT | 1527745 | |
| microcomputed tomography (micro-CT) | Bruker | SkyScan 1172 | |
| Microscope | Olympus | CX41 | |
| New Zealand white rabbits | Zhejiang Experimental Animal Center | SCXK 2014-0047 | |
| No. 11 scalpel | Yuanlikang | 20170604 | |
| normal saline | Mingsheng | 20170903 | |
| PBS | TBD(Jingyi) | 20170703-0592 | |
| pentobarbital sodium | Merk | 2070124 | |
| povidone-iodinesolution | Lierkang | 20170114 | |
| S. aureus freeze drying powder | China General Microbiological Culture Collection Center | ATCC 6538 | |
| sheep blood agar | HuanKai Microbial | 3103210 | |
| tryptic soy agar plates | HuanKai Microbial | 3105697 | |
| tryptic soy broth tubes | HuanKai Microbial | 3104260 | |
| Vancomycin | Lilly | C599180 |
References
- Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
- Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
- Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
- Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
- Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
- Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
- Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
- Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
- Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
- Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
- de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
- Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
- Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
- Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
- Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
- Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
- Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
- Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
- Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
- Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
- Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
- Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).
