부분 Lobular Hepatectomy: Morphologic 간 재생에 대 한 수술 모델

요약

여기, 우리 신생아 (0 일) 쥐에서 왼쪽된 간 엽의 부분 절제 하는 새로운 방법을 제시. 이 새로운 프로토콜은 급성 간 상해 및 신생아 속에서 상해 응답 공부 적합 합니다.

초록

형태학 기관 재생 급성 조직 손실 다음 낮은 척추 동물 중 일반적 이지만 거의 포유류 출생 후 생활에서 관찰 됩니다. 성인 간 재생 70% 부분 hepatectomy 후 남은 엽 대사 활동의 복원 하지만 부상된 엽의 형태와 건축의 영구 손실에 일부 복제 hepatocyte 비 결과. 여기, 우리는 생리 환경 재생에 도움이 되는 신생아에서 새로운 수술 방법 선발. 이 모델 왼쪽된 엽 정점 및 후속 보수적인 관리 처방의 절단을 포함 하 고 주요 간 선박 또는 생리 환경 재생 발생할 수 있습니다 떠나는 화학 상해의 결 찰에 대 한 필요성을 결여 된다. 우리는 자르고 있는 동안 부상된 간 전환 기관 재생에서 보상 성장에 비 대에 의해 청소년 (p 7-14) 쥐에 게이 프로토콜을 확장 합니다. 제시, 짧은 30 분 프로토콜 중생, 포유류에서 그것의 나이 관련 된 감소 및 상 상속 간 줄기 또는 창시자의 특성화의 메커니즘을 연구 하는 프레임 워크를 제공 합니다.

서론

기관를 다시 생성 하거나 복원 하는 형태와 기능, 능력 주로 진화 시간이 지남에 손실 될 생각 되었다. 급성 화학 또는 물리적 손상 후 성인 포유류 간의 재생 잠재력 비 대의 파도 세포 분열, 작동 하지만에서 결과의 몇 라운드에서 발생 하는 모든 나머지 hepatocytes의 동원을 포함 발견 되었습니다. 구조적으로 다른 장기^1,2,3,,45. 최근, 연구 특성화 생활^6,,78의 첫 번째 주 내에서 부상 신생아 포유류 장기의 재생 반응 하기 시작 했다. 이러한 연구 신생아 개발 하는 동안 부상 때 특정 포유류 장기 보상 성장 또는 섬유 증^7,8대신 형태학 중생과 반응으로 나타났습니다.

최근 연구 글로벌 구조와 기능 둘 다의 재생 초기 신생아 기간^6,,78중 발생 하는 것으로 나타났습니다. 화학 상해 또는 에탄올^9,,1011, 아 세트 아미노 펜^{12,,1314,15의 설립된 간 부상 프로토콜 포함} , 사염화 탄소^16,,1718,19, 70% 부분 hepatectomy^4,,2021또는 왼쪽의 제거 및 중간로 브입니다. 화학 관리 hepatocyte 세포 죽음에 이르게 되지만 종종 마이크로 및 매크로 구조 그대로. Morphologic 재생 이러한 맥락에서로 전체 간 건축은 말소 되지 쉽게 공부 될 수 없습니다. 70% 부분 hepatectomy 봉합 결 찰, 주요 혈관의 출혈을 멈추게 하는 데 필요한는 포함 되지만 맥 관 구조의 영구 중단 하면서 비 생리 환경. 또한,이 방법은 성인 설치류에만 사용 되 고 신생아의 응용 기술적으로 매우 어렵습니다. 이 염두에서에 두고, 우리 개발 왼쪽된 엽의 꼭대기의 20-30%는 신생아 P0 마우스에서 제거 하는 방법 (그림 1A-1B). 이 메서드와 보수적인 수술, 최소 침 습, 아니라 기술적으로 도전적인, 총 체 맥 관 구조, 발생 하는 재생을 위한 공간을 떠나 결 찰 하지 않고 형태학의 손실에 지도. 아래에서 설명 하는 결과 단계별 프로토콜 출생 후 생활의 초기 단계에서 포유류 신생아 재생을 공부 하기 위하여 부분 lobular hepatectomy 신생아 쥐에 수행 하기 위해 어떤 연구원에 대 한 수 있습니다. 이 방법은 또한 있다 재생 의학 및 줄기 세포 생물학, 비교 연구 분명 응용 프로그램으로 생활의 나중 단계 동안에 사용할 수 있습니다.

가장 일반적인 급성 간 상해 연구는 화학적으로 유도 된 손상, 성인 간 절단, 또는 70% 부분 hepatectomy. 화학 손상 자주 아 세트 아미노 펜, 사염화 탄소, 또는 에탄올, 정 맥, 복 또는 구두 관리를 포함 하 고 비교적 간단 하 고 비-침략 적 부상 모델 이다. 이전, 화학 손상 결과를 hepatocyte 세포 죽음, 하지만 종종 잎 기질 및 실질 구조 그대로, morphologic 중생에 대 한 주장을 하 고 어려운 논의 했다. 화학 손상 종종 간장 혈관에 센터 공부 사이트와 셀 관련 부상, 유용한 기술 하기가 하지만 또한 어려운가, 전체 기관 수준에서 다른 인구는 선박에서 놓일 수 고를 수 있습니다. 재생에 기여 한다. 이러한 제한에도 불구 하 고 화학 손상에 유용 하 고 매우 순수 관련 부상 모델 아직도 남아 있다.

성인 70% 부분 hepatectomy 결 찰 간 맥 관 구조에 따라 왼쪽과 중간 엽의 제거를 포함. 응답 hepatectomy로 잘 특징 되었습니다: 절단된 간 게시물 70% 부분 hepatectomy 나머지 오른쪽 고 꼬리가 돌출부의 hepatocytes로 원래 손상된 엽의 조잡 한 다른 아키텍처를 개발 하는 14 일 비 대 및 세포 분열^4,5의 몇 라운드를 받 다. 이 분실 된 질량와 기능, 하지만 두 절단된 돌출부를 다시 생성 실패 하 고 따라서 총 형태를 대체 하지 않습니다. 그 결과, 70% 부분 hepatectomy 부상 응답 제한 재생으로 보상 성장 메커니즘 연구 유용 합니다.

여기, 우리는 완전히 신생아 부분 lobular hepatectomy에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 절차에는 적절 한 동물 선택 및 준비, 수술 필드 준비, 수술, 및 복구 포함 한다. 각이 단계 적응과 최적화 프로토콜의 다른 응용 프로그램에 대 한 필요할 수 있습니다.

그러나, 다른 세포 인구와 재생성의 메커니즘 연구, 우리 또한 사용 다양 한 Cre를 은닉 하는 쥐를 포함 하 여 다양 한 유전자 변형 동물, 우리는 광범위 하 게 수행 하 고 야생 유형 C57BL/6J 강아지 (잭 스 000664)에이 프로토콜을 최적화 하 고 CreERT2 transgenes 또는 노크 기능 (잭 스Axin2^CreERT2 018867, 및 Sox9^CreERT2 잭 스 018829) 무지개 및 mTmG 시스템 (R26^VT2/GK3, 같은 형광 기자와 함께 R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. 우리 발견 다른 마우스 변종에 대 한이 방법론을 변경할 필요가 없습니다 생존 결과 또는 재생 잠재력에 차이가 관찰 했다.

다른 동물 긴장을 사용 하 여, 우리는 또한 4-hydroxy-tamoxifen 등 5-ethynyl-2-deoxyuridine (듀) 작은 분자 치료 신생아 쥐에 부분 lobular hepatectomies 수행. 옥수수 기름은 사망률의 중요 한 원인 발견으로 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 에탄올 용 매로 사용 되었다. 우리는 그렇지 않으면 작은 분자의 복 관리 생존 또는 재생 결과 미치지 않았다 것을 발견. 우리는이 프로토콜 중생의 다양 한 측면이 다른 작은 분자와 함께 사용 하기 위해 적용할 것 이다 예측.

신생아 마우스 수술 기술적으로 도전적 일 수 있다 고 동물 처리 및 해 부 현미경에서 특별 한 전문성을 요구할 수 있습니다. 축산 전문 산 모 식인 풍습을 방지 해야 하는 수술 하 고 즉각적인 복구 기간 동안.

프로토콜

모든 동물 실험 평가 및 인증의 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC) 및 스탠포드 대학 행정 패널 실험실 동물에 대 한 협회에 의해 명시 된 지침에 따라 실시 했다 케어 (APLAC), (프로토콜 번호 #10266) 미국, 또는 유럽 동물 복지 행위, 지침 2010/63/유럽에서. 프로토콜과 정부 바바리아, 독일의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 더 허가 받았다: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. 동물 준비

1. 생리대에 적절 한 침구와 빈 케이지를 준비 합니다.
2. 장갑과 동물을 만지고, 전에 어머니의 침구는 장갑에 문질러.
3. 빈으로 그들의 어머니와 장소에서 모든 강아지를 제거 합니다. 어머니의 침구의 일부를 제거 하 고 강아지와 함께 빈 감 금 소에.
4. 외과 분야에서 별도 깨끗 하 고 건조 장에 어머니를 놓습니다.
5. 외과 분야 준비 전에 돈 새로운, 깨끗 한 멸 균 장갑.

2. 외과 분야 준비

1. 10 mL 피 펫을 사용 하 여, 10 cm 배양 접시를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 10 mL를 추가 합니다.
2. 10 cm 배양 접시에 betadine 또는 반 발효 솔루션의 2 개 mL 플라스틱
3. 외과 분야에 해 범위를 놓습니다. 해 부 범위 램프 켜고 외과 의사의 편안 함에 빛의 레벨을 조정. 강아지 해 범위 램프 아래 수술 필드에 배치할 수 있습니다. 강아지의 복 부 표면에 그림자의 부재에 의해 적절 한 빛을 확인할 수 있습니다.
4. Isoflurane 마 취 챔버 준비 ( 재료의 표참조) 코 콘. 챔버는 소변 또는 대변의 증거 없이 청소 되어야 한다. 외과 분야에서 해 범위에서 코 콘과 연결 된 튜브를 놓습니다. 산소와 isoflurane 원뿔을 전적으로의 흐름을 전환 하 고
5. 약 37 ° c.에가 열 패드와 함께 수술 복구 영역 준비 수술 복구는 난방 패드 위에 거 즈의 4 조각으로 이루어져 있어야 한다. 만약에 가능 하다 면, 어머니의 침구, 대변, 및 소변 어머니의 향기를 보존 하기 위해 거 즈 패드를 문질러.
   참고: 그것은 경솔한 열 램프를 사용 하 여 온도 제어 하기 어렵습니다. 높은 온도 신생아 쥐의 죽음에서 발생 합니다.
6. 준비 하 고 압력솥으로 모든 수술 기구를 소독. 필요한 도구를 포함: 마이크로 해 부가 위, 집게를 마이크로 해 부, 거 즈, hemostat, 및 어떤 6-0 monofilament 비 흡수 봉합 사. 수술 악기 모든 유리 구슬 소독 기를 resterilzed 될 수 있습니다.

3. 부분 Lobular Hepatectomy

1. 그것의 다시 그리고 부드럽게 녹화 장소에는 손과 발에 코 콘에 그것을 배치 하 여 강아지를 anesthetize. 강아지 산소 5 %isoflurane 받게 될 해야 합니다.
   1. 발가락 꼬 집 음 시험에 의해 확인 될 수 있는 5 분 또는 때까지 적절 하 게 취, 앉아 강아지를 허용 합니다.
   2. 절 개 전에 피하 carprofen의 5 mg/kg을 주사.
      참고: 전체 수술이 해야한다 더 이상 보다 30 분 가난한 결과 신생아 30 분 이상 전신 마 취 아래에서 관찰 될 수 없습니다. 주의 필드에 철저 한 준비를 통해 수술의 길이 봉합 유발 피부 눈물을 최소화 하기 위해 폐쇄 전에 피부 젖 음을 최소화 하기 위해.
2. 부드럽게 betadine와 젖은 작은 거 즈 패드와 후부 복 벽을 청소. 1 분 동안 건조 betadine 허용.
3. 마이크로 해 부가 위 집게와 바로 흉 곽 아래 왼쪽된 중간 clavicular 0.5 c m 절 개를 확인 합니다. 부드럽게 집게를 사용 하 여 피부를 분리 하 고 두 번째 깊은 절 개 복 막 구멍 (참조 그림 1 c, 왼쪽과 가운데)에
4. 부드럽게 복 막 구멍에서 왼쪽된 엽의 꼭대기를 강제로 뒤로, 마이크로 해 부가 위, 집게의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 복 부의 양쪽에서 옆 압력을 적용. 왼쪽된 엽의 왼쪽된 꼭대기 해야 쉽게 시각된 (그림 1C, 오른쪽).
5. 정점에서 절단 하 고 제거할 조직의 양을 무게.
   1. 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 부드럽게 원하는 양의 왼쪽된 엽의 꼭대기에서 조직 절단.
   2. 장소는 1.5 mL 튜브에 절단된 조직 PBS 가득합니다. 분석 균형을 사용 하 여 절단된 조직 무게 ( 재료의 표참조).
      참고: 균형에서 거 즈 또는 종이의 조각을 놓고 그것을 포장. 그런 다음 절단된 조직 거 즈 또는 종이에 놓고 질량을 측정 합니다.
   3. 드라이 아이스 냉동된 섹션 분석을 통해 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 1 시간 실 온에서 2 %paraformaldehyde 절단된 지역 및 장소를 수정. 모든 표준 cryostat를 사용 하 여 절단 7-10 µ m 섹션에서 얼어붙은 섹션을 분석 합니다.
6. 부드럽게 장착 사용 하 여 거 즈의 압 연된 조각, 복 막 구멍 왼쪽된 엽. 출혈이 중지까지 구멍에 거 즈를 둡니다.
7. 거 즈를 제거 하 고 젖은 외과 사이트와 주변 지역 PBS로 적셔 거 즈로.
8. 6-0 monofilament 외과 사이트, 실행 스티치와 비 흡수 봉합을 닫습니다. 복 막과 피부는 별도로 마감 한다.
   참고: PBS로 적셔 거 즈로 피부를 부드럽게 일로 봉합 유도 눈물 최소화할 수 있습니다.
9. 부드럽게 하지만 철저 하 게 PBS와 젖은 거 즈로 강아지를 깨끗 하 고 아무 혈액 또는 betadine 남아 보장. 젖은 거 즈 패드를 롤 하 고 어떤 혈액 또는 betadine 청소 상처 기호에 부드럽게 문질러.
   참고: 이것은 그들이 부적당 하 게 청소 하는 경우 어머니는 새끼를 빼어 수 있습니다 특히 중요입니다.
10. 코 콘에서 강아지를 제거 하 고 어머니의 대변과 소변에 노출 거 즈 패드를 포함 하는 복구 영역에 배치. 일단 강아지 복구, 어머니의 침구와 빈 감 금 소에 강아지를 교체 합니다.
    참고: 열 램프를 사용 하지 마십시오. 열 램프를 사용 하 여 과열 신생아를 발생할 수 있습니다.
11. 강아지의 원하는 수에 절차를 반복 합니다. 모든 강아지를 사용할 수 있지만 일반적으로 운영된 강아지 함께 교체에 운영 하지 않는 몇 가지 새끼를 두고 적당 하다.
12. 어머니의 감 금 소에 있는 그들의 어머니의 침구와 동시에 모든 새끼를 교체 합니다.

4. 복구 및 분석

1. 후속 쥐에 매일.
   1. 상처 폐쇄 남아 확인 하 고 있는 경우 모든 죽은 새끼를 제거.
   2. 상처는 다시, 이전 기술, 및 반복 단계 3.8 3.12로 외과 사이트 및 복구 영역을 준비 합니다.
   3. Carpofen 피하 24 및 48 h 절차의 5 mg/kg을 주사.
   4. 56 일 이상 새끼를 따릅니다.
2. 이산화탄소 (CO₂) 노출 및 자 궁 경부 전위에 의해 원하는 양의 수술 일 후 동물을 안락사.
   1. 유도에 마우스를 놓습니다 / 안락사 챔버와 마우스까지 CO₂ 차례 호흡을 중지.
   2. 자 궁 경부 전위에 의해 안락사를 확인 합니다. 앞-손가락 및 엄지를 사용 하 여 마우스의 등 쪽 목에 밀어 하 고 꼬리에 다른 손을 사용 하 여, 풀 다운.
3. 전체 간 일괄적 으로 제거 하 고 그것의 무게.
   1. 신중 하 게 각 엽 하 고 별도로 무게 합니다.
      참고: 조심 해 부 횡 경 막과 키 모 포털 혈관의 여 간을 제거 합니다. 신중 하 게 각 엽 근 위 첨부 파일에서을 해 부하 여 서로 돌출부를 구분 합니다.
4. 전체 간의 질량에 절단된 왼쪽된 엽의 질량을 비교 하 여 중생의 범위를 결정 합니다. 손상 되지 않은 왼쪽된 엽 전체 간의 대략 30% 이다.

결과

그림 1A ( 그림 1B에서 도식), 신생아 부분 lobular hepatectomy의 일반적인 타임 라인과 재생 관찰 될 때까지 대기 하는 시간의 예상된 길이 자세히 설명 합니다. 왼쪽된 엽의 미묘한 재생 관찰된 7-14 일 게시물 수술 수 있습니다. 전체 재생 56 일 게시물 수술 후에 종종 관찰 되었다. 마우스는 수술 후 생리 이상이의 흔적을 표시 합니다.

마우스 부분 lobular hepatectomies를 겪고 2, 7, 14, 35, 복구 및 56 일 허용 되었다. 되며과 복구 후 이러한 마우스에서 다친된 왼쪽된 돌출부의 오신 (H & E)은 그림 2에 표시 됩니다. 특히, 56 일 후 ...

토론

급성 간 상해는 전통적으로 화학 (아 세트 아미노 펜, 에탄올, 사염화 탄소), 또는 외과 모델 (70% 부분 hepatectomy)를 사용 하 여 연구 되었습니다. 재생 반응 후 70% 부분 hepatectomy 글로벌 hepatocyte 비 그리고 세포 분열^4,5의 여러 라운드 특징 되었습니다. 그러나 출혈을 중지 하,이 모델은 제한으로 주요 혈관 재생에 대 한 비정상적인 환경을 떠나 출혈 해야 합니다. 많은 연구 결과 따라서 장소에서 발생 하는 재생에 대 한 총 건축을 떠나는 화학 손상을 통해 급성 상해의 다른 보다 적게 침략 적 모델을 고용 했다. 최근, Porrello 그 외 여러분 및 장 외 , 자리 팁, 마음과 귀^7,8에 급성 부상 후 현저 하 게 다른 신생아 재생 응답을 증명...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)대
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm 스트레이트 스프링 마이크로 가위	Vannas	72932-01
5SF 집게	Dumont	11252-00
스트레이트 켈리 집게	Grainger	17-050G
가열 패드	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
설치류 마취 시스템	Kent Scientific	1205S
거즈, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri	dish Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, 일반, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME 분석 저울	Fisher Scientific	01-912-402
저비용 인덕션 챔버	Kent Scientific	SOMNO-0730