CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Weijun Feng; Lena Herbst; Peter Lichter; Stefan M. Pfister; Hai-Kun Liu; Daisuke Kawauchi

doi:10.3791/57311

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방법 논문

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

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DOI:

10.3791/57311

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2018년 6월 9일

Weijun Feng^*¹ , Lena Herbst^*² , Peter Lichter² , Stefan M. Pfister³^,⁴^,⁵ , Hai-Kun Liu¹ , Daisuke Kawauchi³^,⁴

¹Division of Molecular Neurogenetics, German Cancer Research Center (DKFZ), DKFZ-ZMBH Alliance, ²Division of Molecular Genetics, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), ³Hopp-Children's Cancer Center at the NCT Heidelberg (KiTZ), ⁴Division of Pediatric Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), ⁵Department of Pediatric Hematology and Oncology, Heidelberg University Hospital

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

녹아웃 동물을 사용 하 여 유전자의 손실의 기능 연구를 기존의 자주 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. CRISPR 중재 체세포 mutagenesis Electroporation 기반 유전자에 vivo기능을 이해 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 소 뇌의 세포 증식에 녹아웃 고기를 분석 하는 방법을 보고 합니다.

초록

뇌 기형은 유전자 변이 의해 발생 합니다. 환자 유래 조직에 돌연변이 해독 하는 것은 질병의 잠재적인 원인이 되는 요인을 확인 했다. 질병 발전에 돌연변이 유전자의 기능 장애의 기여의 유효성을 검사 하는 돌연변이 운반 하는 동물 모델의 생성 한 명백한 접근 이다. 생식 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)는 인기 생물 학적 도구 및 재현성 결과 전시, 시간 및 비용에 의해 제한 된다. 한편, 비 생식 GEMMs 종종 더 실현 가능한 방식으로 탐험 유전자 함수를 사용합니다. 이후 일부 뇌 질환 (예, 뇌종양) 체세포에서 발생할 나타나지만 하지 생식 돌연변이, 비 생식 공상 마우스 모델, 정상 및 비정상 세포가 공존, 질병 관련 분석에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 소 뇌에 체세포 돌연변이 CRISPR 중재의 유도 하는 방법을 보고합니다. 특히, 우리는 조건부 노크에 마우스는 Cas9 그리고 GFP 는 만성 활성화 CAG (CMV 증강/치킨 ß-말라) 발기인 Cre후 활용-중재 하는 게놈의 재결합. 자체 디자인된 단일-가이드 RNAs (sgRNAs)와 모두 단일 플라스 미드 구문에서 인코딩된 Cre recombinase 시퀀스, electroporation utero에서 를 사용 하 여 배아 단계에서 소 뇌 줄기/시 조 세포로 전달 되었다. 따라서, transfected 세포와 딸 세포 그들의 phenotypic 분석 더 촉진 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 했다. 따라서,이 방법은 뿐만 아니라 보여주는 electroporation 기반 유전자 배아 소 뇌 세포로 전달 하지만 CRISPR 중재 기능 손실 고기를 평가 하는 새로운 양적 접근 방식을 제안.

서론

뇌 질환 가장 무서운 인간의 질병 중 하나입니다. 그들은 유전자 변이 후속 dysregulation에서 수시로 유래한 다. 뇌 질환의 분자 메커니즘을 이해 하기 인간의 환자의 게놈 해독 영원한 노력 잠재적인 원인이 유전자의 수를 발견 했습니다. 지금까지 생식 유전자 조작 동물 모델 vivo에서 이득-의-(GOF) 기능과 같은 후보 유전자의 기능 손실 (LOF) 분석에 대 한 이용 되어 있다. 기능 유효성 검사 연구의 가속된 발달 때문에 더 가능 하 고 유연한 vivo에서 유전자 분석 결과 대 한 시스템 유전자 기능을 공부 하 고 바람직합니다.

개발 쥐의 뇌에는 vivo에서 유전자 electroporation 기반 전송 시스템의 응용 프로그램은이 목적에 적합 합니다. 사실, electroporation utero에서 를 사용 하 여 여러 연구 개발 두뇌¹^,²^,³기능 분석을 그들의 잠재력을 보여왔다. 사실, 마우스 뇌의 대뇌 피 질⁴, 망막^5<....