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방법 논문

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

8.6K 조회수

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DOI:

10.3791/57314

⸱

2018년 2월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

프로토콜은 차별화에 생체 재료의 강성 효과 확산의 조사와 펩타이드, 없이 투입 했다 다양 한 뻣 뻣 함과 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 hydrogels를 준비 하 여 줄기 세포입니다. hydrogels 강성 가교에 의해 통제 되었다.

초록

확산에 생체 재료의 강성과 줄기 세포의 분화와 같은 물리적 단서의 효과가 여러 연구자에 의해 조사 했다. 그러나,이의 대부분 polyacrylamide hydrogels 그들의 연구에서 줄기 세포 배양에 대 한 사용. 따라서, 그들의 결과 그 결과 polyacrylamide의 특정 한 특성에서와 생체 재료의 물리적 큐 (강성)에서 발생 될 수 있습니다 때문에 논란이 있습니다. 여기, 우리가 polyacrylamide, 다양 한 줄기, 인간 미 발달 줄기 (ES) 세포를 포함 하 여 셀 및 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 배양 수 있습니다 어디를 기반으로 하지 hydrogels를 준비 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 다양 한 강성과 Hydrogels 강성 가교 시간을 변경 하 여 가교 정도 의해 제어와 bioinert 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 (P-IA)에서 준비 되었다. 펩타이드 기질에서 파생 하지 않고 투입 P-IA hydrogels 줄기 세포 배양 및 분화에 대 한 미래의 플랫폼으로 조사 되었다. 문화와 액체 양수 줄기 세포, 줄기 세포 지방이 많은 파생, 인간 ES 세포, 및 인간 iPS 세포의 통로 여기에 설명 되어 있습니다. 펩타이드 P-IA hydrogels가 보였다 우수한 공연, 그들의 강성 속성에 의해 유도 했다. 이 프로토콜의 소재, 강성 속성 및 마지막으로, 이종 무료 문화 조건을 사용 하 여 줄기 세포 운명에 미치는 영향을 제어 하는 함께 그들의 표면 조작, 합성을 보고 합니다. 최근 연구를 바탕으로, 그러한 수정된 기판 지원 하 고 다른 연계; 다양 한 줄기 세포 라인의 운명을 직접 미래의 플랫폼으로 작동할 수 있다 또한, 재생성 하 고 잃어버린된 기관 또는 조직의 기능을 복원 합니다.

서론

세포와 줄기 세포, 특히 인간 유도 만능 (iPS) 세포와 인간 배아 줄기 (ES) 세포의 장기 확산의 특정 계보에 줄기 세포 분화의 운명을 억제제, 성장 요인에 의해 통제 될 것으로 알려져 고 / 또는 문화 미디어에 작은 생리 활성 분자입니다. 최근, 생체 재료, 특히 셀 문화 생체 재료의 강성의 물리적 신호 줄기 세포 확산 그리고 감 별 법1,2,의 운명을 인도 하는 중요 한 요소가 될 인정을 받고 있다 3,4,,56. 따라서, 여러 연구자 다양 한 강성과 polyacrylamide hydrogels를 사용 하 여 주로 hydrogels, 차별화에 교양 줄기 세포의 운명을 조사 하기 시작 했습니다.

생체 재료의 강성은 초점 접착, 세포 형태학, 셀 형 및 줄기 세포 접착, 2 차원 (2 차원) 재배1,

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프로토콜

이 연구에서 실험 대만 Landseed 병원 (IRB-13-05)와 중앙 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 모든 실험은이 연구 기간 동안 모든 관련 및 적용 가능한 정부 및 기관 지침 및 규정에 따라 실시 했다.

1. 솔루션 및 미디어 준비

  1. 폴리머 정화
    1. P-IA carboxylic 산 그룹의 가수분해의 학위와 정화 > 96.5% 에탄올과 P-IA를 세척 하 여. 500 mL 원뿔 비 커에 200ml의 에탄올에 P-IA의 20 g을 배치 하 고 모든 8-10 h 24-30 헤 교환 신선한 에탄올 에탄올에 대 한 자력에 선동.
    2. Büchner 퍼 널을 사용 하 여 여과 하 여 에탄올에서 P-IA를 제거 합니다.
    3. 24 h에 대 한 실내 온도에서 진공 건조 하 여 P-아이오와 건조.
      참고: 것이 좋습니다 청소 함정 진공 건조 시스템에서 (에탄올의 제거)에 의해 자주, 특히 초기 몇 시간 동안 함정 많은 양의 P 아이오와에에서 에탄올의 제거 후 막힌 될 경향이 있기 때문에
  2. P i A 솔루션의 준비
    참고: 용 매 (물)에 매우 느리게 폴리머를 추가 합니다. ....

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결과

P-IA hydrogels ECM 파생 된 펩타이드 (oligoECM)로 융합 또는 다른 신축성으로 ECM 준비 반응 체계에 따라 그림 1A에서 보이는 것과 같이 oligoECM (그림 1B)의 다른 종류를 사용 하 여. hydrogels의 신축성은 적용된 가교 강도 (시간) (그림 1C)에 의해 규제 했다. P-IA hydrogels 25.3 kPa (24 h 가교 시간)의 저장 탄성 률이 vitronectin에서 파생 된 펩타이드와 융합 지원 인간 iPS와 이상에 대 한 ES 세포의 장기 문화 10-20 구절. 특히, 공동 세그먼트 (P-i A-24 h-VN1G)와 P-IA hydrogels 투입 또는 듀얼 체인 (P-i A-24 h-VN2G) 인간 iPS와 P-아이오와-VN1 보다 oligoECM (200-.......

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토론

P-i A-oligoECM 및 다양 한 강성과 P-아이오와-ECM hydrogels 인간의 ES와 이종 무료 조건에 이상 10 구절 뿐만 아니라 인간의 AFS 셀, 광고 셀의 문화에 대 한 그들의 pluripotency를 유지 하는 iPS 세포의 장기 확장을 위해 개발 되었다 그리고 조 혈 줄기 세포25,,2832. P-IA hydrogels oligoECM와 함께 움직일 수는 차별화의 운명과 기본 세포로 서 줄기 세포의 다양 한 종류의 확산에 셀 문화 자료의 효과 조사 하기 위해 세포 배양 재료에 대 한 훌륭한 후보와 암 세포입니다.

P i A 솔루션 P i A 솔루션 요리에 캐스팅은 투명 해야 합니다. 가교 시간 P-IA hydrogels의 가교 강도 결정합니다. 24 h P-IA hydrogels의 가교 인간.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 부분적으로 부여 번호 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006, 104-2221-E-008-107-MY3 아래 과학과 기술, 대만 의해 지원 됩니다. 이 연구는 대만 Landseed 병원 프로젝트 (NCU-LSH-105-A-001)에 의해 또한 지원 되었다. 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본에서 과학 연구 (숫자 15 K 06591)에 대 한 특정도 인정 했다. A. 히구치 대학원 및 연구, 킹 사우드 대학, 리야드 11451, 사우디아라비아 왕국에 대 한 국제 과학 파트너십 프로그램 (ISPP-0062) 부회장 Rectorate에 대 한 인정 하 고 싶습니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GTPGPQGIAGQRGVVPH 일본없음사양: Oligopeptide
약어: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH 일본없음 사양: Oligopeptide
약어: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH 일본없음사양: Oligopeptide
약어: CS1
EILDVPSTPH 일본없음사양 : Oligopeptide
약어 : VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH 일본없음사양 : Oligopeptide
약어 : HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH Japan없음사양 : Oligopeptide
약어 : HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH 일본없음사양 : Oligopeptide
약어 : VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH 일본없음사양: Oligopeptide
약어: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH 일본없음사양: Extracellular matrix
약어: rVN
VitronectinThermo Fisher scientificA14700사양: Extracellular matrix
약어: FN
FibronectinSigma-AldrichF2006사양 : 상업적으로 이용 가능한 코팅 재료
약어 : Synthemax II
Synthemax IICorning3535사양 : 고분자
폴리 비닐 알코올 - 코 이타콘산일본 VAM & PovalAF-17사양 : 화학
글루 타르 알데히드시그마 - 알드리치G5882사양 : 화학
물질 Na2< / sub>SO 4< / sub>Aldrich239313사양 : 화학
물질 H2< / sub >SO4 < / sub>Sigma-Aldrich339741사양 : 화학 < br / > 약어 : EDC
N- (3- 디메틸 아미노 프로필) -N'- 에틸 카르 보디 이미드 염산염시그마 - 알드리치E7750사양 : 화학 < br / > 약어 : NHS
N- 하이드 록시 숙신이 미드시그마 - 알드리치56480사양 : 화학
파라 포름 알데히드시그마 - 알드리치P6148사양 : 화학
트리톤 -X100시그마 알드리치T8787사양: Cell culture consumable
Cell scraperCorning3008사양: Cell culture consumable
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693사양: Cell culture medium
Essential 6Thermo Fisher scientificA1516401사양: Cell culture medium
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001사양: 세포 배양 배지
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032사양: 세포 배양 배지
DMEMThermo Fisher scientific12800-017사양: 세포 배양 배지
MCDB 201Sigma-AldrichM6770사양: ES cell
Human ES cellWiCell Research Institute, Inc..WA09사양 : iPS 세포
인간 iPS 세포Riken 세포 은행HS0077사양 : 35 mm
약어 : TCP
TCP 접시코닝353001사양 : 60 mm
약어 : TCP
TCP 접시코닝353002사양 : 24 잘
접시 24 잘 접시코닝353047사양 : 차단 제제
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA8806사양: 검출 시약
알칼리성 인산가수분해효소 라이브 스테Thermo Fisher ScientificA14353사양: 검출 시약
Hematoxylin & eosinSigma-Aldrich1.05175사양: EB 형성 접시
6웰 초저 부착 접시Corning3471사양: 코팅 재료
젤라틴Sigma-AldrichG9391사양: 코팅 재료
MatrigelCorning354230사양: 마우스
NOD-SCID 마우스National Applied Research Laboratories없음사양: 혈청
태아 소 혈청생물학 산업04-001-1A사양: 항생제
항진균성 항생제Thermo Fisher Scientific15240-062사양:
NanogInvitrogenMA1-017사양:
SSEA4Abcamab16287사양:
OCT3/4InvitrogenPA5-27438사양:
Sox2용Invitrogen48-1400사양:
평활근 ActinInvitrogenPA5-19465사양:
AFPInvitrogenPA5-21004사양: 항체
항체 GFAPInvitrogenMA5-15086사양:
항체 Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse 항체InvitrogenA-21422사양: 항체
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit 항체InvitrogenA-11008사양: 항체
인 용 항체 용 항체 용 항체 항체용 항체 용 항체

참고문헌

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. ....

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