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방법 논문

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57314

⸱

2018년 2월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

프로토콜은 차별화에 생체 재료의 강성 효과 확산의 조사와 펩타이드, 없이 투입 했다 다양 한 뻣 뻣 함과 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 hydrogels를 준비 하 여 줄기 세포입니다. hydrogels 강성 가교에 의해 통제 되었다.

초록

확산에 생체 재료의 강성과 줄기 세포의 분화와 같은 물리적 단서의 효과가 여러 연구자에 의해 조사 했다. 그러나,이의 대부분 polyacrylamide hydrogels 그들의 연구에서 줄기 세포 배양에 대 한 사용. 따라서, 그들의 결과 그 결과 polyacrylamide의 특정 한 특성에서와 생체 재료의 물리적 큐 (강성)에서 발생 될 수 있습니다 때문에 논란이 있습니다. 여기, 우리가 polyacrylamide, 다양 한 줄기, 인간 미 발달 줄기 (ES) 세포를 포함 하 여 셀 및 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 배양 수 있습니다 어디를 기반으로 하지 hydrogels를 준비 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 다양 한 강성과 Hydrogels 강성 가교 시간을 변경 하 여 가교 정도 의해 제어와 bioinert 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 (P-IA)에서 준비 되었다. 펩타이드 기질에서 파생 하지 않고 투입 P-IA hydrogels 줄기 세포 배양 및 분화에 대 한 미래의 플랫폼으로 조사 되었다. 문화와 액체 양수 줄기 세포, 줄기 세포 지방이 많은 파생, 인간 ES 세포, 및 인간 iPS 세포의 통로 여기에 설명 되어 있습니다. 펩타이드 P-IA hydrogels가 보였다 우수한 공연, 그들의 강성 속성에 의해 유도 했다. 이 프로토콜의 소재, 강성 속성 및 마지막으로, 이종 무료 문화 조건을 사용 하 여 줄기 세포 운명에 미치는 영향을 제어 하는 함께 그들의 표면 조작, 합성을 보고 합니다. 최근 연구를 바탕으로, 그러한 수정된 기판 지원 하 고 다른 연계; 다양 한 줄기 세포 라인의 운명을 직접 미래의 플랫폼으로 작동할 수 있다 또한, 재생성 하 고 잃어버린된 기관 또는 조직의 기능을 복원 합니다.

서론

세포와 줄기 세포, 특히 인간 유도 만능 (iPS) 세포와 인간 배아 줄기 (ES) 세포의 장기 확산의 특정 계보에 줄기 세포 분화의 운명을 억제제, 성장 요인에 의해 통제 될 것으로 알려져 고 / 또는 문화 미디어에 작은 생리 활성 분자입니다. 최근, 생체 재료, 특히 셀 문화 생체 재료의 강성의 물리적 신호 줄기 세포 확산 그리고 감 별 법1,2,의 운명을 인도 하는 중요 한 요소가 될 인정을 받고 있다 3,4,,56. 따라서, 여러 연구자 다양 한 강성과 polyacrylamide hydrogels를 사용 하 여 주로 hydrogels, 차별화에 교양 줄기 세포의 운명을 조사 하기 시작 했습니다.

생체 재료의 강성은 초점 접착, 세포 형태학, 셀 형 및 줄기 세포 접착, 2 차원 (2 차원) 재배1,2,,35에 (서) 특히 제어할 수 있습니다. 줄기 세포에 의해 생체 재료의 메카노 감지 일반적으로 초점 접착 integrin 수용 체를 통해 신호에 의해 제어 됩니다. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA 종속 수축 말라의 골격의 중요 한 역할을 2 차원 셀 재배 시스템3,,45, 에서 줄기 세포의 mechanosensing 과정에서 7,,89,,1011.

Engler와 그의 동료 성인 줄기 세포, 골 수 줄기 (BMS) 세포는 특정 조직에 유사한 강성과 셀 문화 생체에 재배 등에서 유래 하는 세포로 분화 하는 경향이 있는 재미 있는 개념 개발 특정 조직5. BMS 셀 2 차원 소프트 polyacrylamide hydrogels 콜라겐 유형 I (강성 뇌 조직의 비교) 확장 미디어에 저절로 BMS 셀에 경작 하는 반면 초기 신경 혈통으로 차별화 하는 유도 했다 코팅에 인 큐베이 팅 collagenous 뼈 조직 또는 근육의 강성과 hydrogels 2 차원 polyacrylamide hydrogels3,5에 각각, myocytes 및 osteoblasts의 이른 계보에 차별화를 유도 하는 것 발견 되었다. 많은 연구 자들은 분화의 줄기 세포 운명 조사 polyacrylamide에 교양 hydrogels 콜라겐 움직일 유형 I12,,1314,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 그러나 21., 그것은 언급 한다는 몇 가지 모순 보고1,,1822,,2324 Engler에 의해 제안 하는 잘 알려진 아이디어에 대 한 존재 외. 5 이것이 Engler의 아이디어5 polyacrylamide hydrogels에 전적으로 개발 되었다 및 그들의 결과의 물리적 큐 (강성) 아니라 전적으로 및 소재 (polyacrylamide)의 특정 한 특성에서 유래 하기 때문에 소재입니다. 따라서, 그것은의 강성은 hydrogels의 가교에 의해 통제 될 수 있다, 하이드로 겔의 다른 유형을 개발 하는 것이 중요. 이 위해 bioinert hydrogels 개발 되었다는 가교 정도는 변화 가교 시간25, 이전에 의해 통제 되었다 다른 강성으로 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 (P-IA)에서 준비 했다 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 줄기 세포 nonmodified P-IA hydrogels P-IA hydrogels 세포 외 매트릭스 (ECMs)와 펩타이드 융합에 재배 될 수 있다. 이전 연구25의 경우, 인간 조 혈 줄기 세포 (hHSCs) 탯 줄 혈액에서 다른 강성 값에서 3 kPa fibronectin 또는 한 펩타이드에서 파생 된 30 kPa 저장 모듈러스와 P-IA hydrogels에 재배 했다 fibronectin (CS1, EILDVPST)는 P-IA hydrogels에 융합 되었다. HHSCs의 배 확장 높은 비보 전 P-IA hydrogels CS1 또는 30 kPa2512 kPa에서 배열 하는 중간 강성 표시 fibronectin 투입에서 관찰 되었다.

인간 iPS와 ES 세포 수 수 재배 기존의 조직 문화 폴리스 티 렌 (TCP) 요리33,34 에 인간의 ES와 iPS 세포 vitronectin 등 그들의 pluripotency를 유지 하기 위해 laminin ECMs, 특정 바인딩이 필요로 하기 때문에 중 장기적인 문화. 따라서, 최적의 강성 특성을 가진 P-IA hydrogels 펩타이드 융합의 여러 구조 설계 하 고 단일 체인, 공동 세그먼트와 단일 체인, 공동 세그먼트와 분기 종류 듀얼 체인의 형성에 체인32. 펩타이드 시퀀스 integrin glycosaminoglycan 바인딩 도메인 소프트웨어의 선정 됐다. 약 25 kPa에서 저장 탄성 률을가지고, 듀얼 체인 또는 공동 세그먼트, vitronectin에서 파생 된 펩타이드와 융합 하는 P-IA hydrogels 이종 무료 및 화학 이상 12 구절에 대 한 인간의 ES와 iPS 세포의 장기 문화 지원 정의 된 조건32. 공동 세그먼트와 듀얼 체인은 hydrogels에 세포 접착 분자 확산을 촉진 하 고 인간의 ES와 iPS의 pluripotency 세포32. 여기, (와 함께 공기에 젖은 조건 하에서 측정 되었다 30 kPa에 10 kPa의 저장 모듈러스) P-IA hydrogels를 준비 하기 위한 프로토콜 융합 펩타이드 없이 또는 소프트웨어를 설명. 문화 및 여러 줄기 세포 (를 포함 하 여 액체 양수 줄기 세포, 줄기 세포 지방이 많은 파생, 인간 ES 세포, 및 인간 iPS 세포)를 통과 하는 방법에 표시 됩니다.

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프로토콜

이 연구에서 실험 대만 Landseed 병원 (IRB-13-05)와 중앙 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 모든 실험은이 연구 기간 동안 모든 관련 및 적용 가능한 정부 및 기관 지침 및 규정에 따라 실시 했다.

1. 솔루션 및 미디어 준비

  1. 폴리머 정화
    1. P-IA carboxylic 산 그룹의 가수분해의 학위와 정화 > 96.5% 에탄올과 P-IA를 세척 하 여. 500 mL 원뿔 비 커에 200ml의 에탄올에 P-IA의 20 g을 배치 하 고 모든 8-10 h 24-30 헤 교환 신선한 에탄올 에탄올에 대 한 자력에 선동.
    2. Büchner 퍼 널을 사용 하 여 여과 하 여 에탄올에서 P-IA를 제거 합니다.
    3. 24 h에 대 한 실내 온도에서 진공 건조 하 여 P-아이오와 건조.
      참고: 것이 좋습니다 청소 함정 진공 건조 시스템에서 (에탄올의 제거)에 의해 자주, 특히 초기 몇 시간 동안 함정 많은 양의 P 아이오와에에서 에탄올의 제거 후 막힌 될 경향이 있기 때문에
  2. P i A 솔루션의 준비
    참고: 용 매 (물)에 매우 느리게 폴리머를 추가 합니다. 그것은 용 매에 P-IA를 추가 하려면 적어도 15 분 걸릴 것이 좋습니다. 용 매는 폴리머에 추가 되 면 폴리머 완전히 해산 하지 것 이다. P i A 솔루션의 폭발성 비등을 생성할 수 없는 주의 해야 합니다. 보호 안경을 사용 하 여 P-i A 솔루션의 준비 하는 동안. P i A 솔루션의 난방 과정은 결정 P-아이오와에 분해에 필수적 그것은 제안 (바람직) 가능한 경우 상대적으로 깨끗 한 실험 실에서 P i A 솔루션을 준비 하.
    1. P-IA 0.050 무게 % 농도 세포 배양 실험을 위해 또는 고분자 측정에 대 한 0.50 무게 % 농도에 순수한 물에 분해: 예를 들어 분해 세포 배양에 대 한 순수한 물 100 mL 및 100 ml의 P-IA의 500 mg에 P-IA의 50 밀리 그램 제가 측정을 위한 이온된 (DI) 물.
    2. 핫 플레이트에 1 h P-i A 솔루션을 교 반 하십시오.
      참고: 폭발성 끓는 피하기 위해, 할 열 하지 솔루션 이상 95 ° c. 높은 온도에서 폴리머 솔루션의 폭발성 비등 하는 것은 피부 화상을 생성할 수 있습니다. 따라서 매우 신중 하 게, P-IA의 난방을 수행 하 고 난방 중 P i A 솔루션의 온도 모니터링.
    3. P i A 솔루션은 주위 온도에 냉각 했다, 후 48 h. 난방, 없이 뜨거운 접시에 두고 뜨거운 P i A 솔루션에 대 한 실 온에서 P i A 솔루션을 선동 하 고 공기 방울을 20-24 h에 대 한 실 온에서 교 반 하지 않고 그것을 두고합니다 P i A 솔루션에 존재 하지.
  3. 가교 솔루션의 준비
    1. 가교 솔루션 1.0 중량 %도 25% 수성도 솔루션에서의 구성, 20.0% 나2그래서 무게 99%를 사용 하 여4 > 순도, 및 1.0 무게 % H2이렇게4. 예를 들어 1 개의 6 또는 12에 대 한 셀 문화 판 잘, 순수한 물 10 mL에도 솔루션, 나트륨 황산 염의 2 g 및 황산의 100 µ L의 100 µ L를 추가.
  4. 인간의 ES/PS 셀 문화 미디어
    참고: 사용 DMEM/F12 미디어, 필수 6 미디어와 세포 배양에 대 한 필수적인 8 미디어.
    1. 4 ° C 냉장고에 녹고 천천히 솔루션에 50 X 필수 8 보충 하룻밤 고정 반환 합니다.
    2. 50 X 필수 8 보충 필수 8 기저 미디어의 한 병으로 한 병을 추가 합니다. 100 mL 원심 분리 관에 작은 aliquots (각 50 mL)에 미디어를 분리 후-20 ° c.에 미디어를 저장

2. P-IA 히드로 요리 준비

  1. P-아이오와 영화 준비
    1. 35mm TCP 접시 P i A 솔루션의 약 1 mL 수를 주입 하 고 건조 한 깨끗 한 벤치에 P-IA 필름 생산을 2 일 동안 45 ° C 오븐에서 요리.
  2. P-IA 히드로 요리의 가교
    1. 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 및 48 h에 대 한 수성 가교 솔루션으로 P-IA 영화를 담가.
      참고: ' P-아이오와-X' (예를 들어, P-아이오와-12 h) X 높이 (예를 들어, 12 h)에 대 한 P i A 히드로 가교 화를 말합니다.
    2. 가교, 후 주위 온도에서 순수한 물 P-IA hydrogels 린스 하 고 깨끗 한 벤치에 주위 온도에서 순수한 물에 hydrogels를 유지 합니다.
    3. 1 분 동안 75.0 volume/volume% 에탄올 솔루션에 집중 하 여 P-IA hydrogels 소독, 린스 순수한 물 P-IA hydrogels 6 번, 그리고 P-IA hydrogels 순수한 물 세포 배양을 위해 사용 될 때까지 계속.
  3. P-IA 히드로 요리 펩타이드 또는 ECM 투입 준비
    1. 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl)-를 포함 하는 수성 해결책의 1 mL에 침수를 통해 P-IA hydrogels 활성화N'-ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 10 mg/mL N-hydroxysuccinimide (NHS) 37 ° C 또는 4 h h 1에 대 한 4 ° c.에
    2. 린스 1 mL의 인산 염과 P-IA hydrogels 버퍼링 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 3 번 4 ° c.에 24 h에 대 한 펩타이드 (100-1500 µ g/mL) 또는 ECM (10-100 µ g/mL) 1 mL를 포함 하는 PBS 솔루션에 P-IA hydrogels 젖어
      참고: 펩타이드 시퀀스 및 ECMs 줄기 세포 배양에 사용 되는 표 1에 요약 됩니다.
    3. 펩타이드 또는 ECM을 접목, 후 P-IA hydrogels 순수한 물으로 3 회 세척.
      참고: P-IA hydrogels Y µ g/mL의 펩타이드 또는 ECM (Z)와 융합이 라고도 P-아이오와-Xh-Z 또는P-아이오와-Xh-Z-Y여기서 X _ 가교 시간 (h), Y 를 나타냅니다의 펩타이드 또는 ECM, 농도 Z 는 다른 펩타이드 또는 ECM를 나타냅니다.

3. 인간의 ES/iPS 세포 배양

  1. 통로 및 undifferentiated 인간의 ES와 iPS 세포의 유지 관리 방법
    1. 인간의 ES (예를 들어, WA09 또는 H9) 유지 셀 또는 인간의 Ip (예, HS0077) 6 cm 요리 표준 인간의 ES/Ip를 사용 하 여 필수 8 미디어에서 Matrigel 셀 세포 문화 프로토콜28,32.
    2. 8-10 분 동안 37 ° C에서 DMEM/F-12 미디어에서 2.0 mg/mL dispase II와 합칠 근처 인간의 ES/iPS 세포를 품 어 그리고 두 번 DMEM/F12 매체와 인간의 ES/iPS 세포를 씻어.
    3. 인간의 ES/iPS 세포 문화 요리 DMEM/F-12 미디어의 2 mL의 추가 약하게 부착 식민지 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 분리 후 또는 pipetting으로.
    4. 15 mL 원심 분리 관으로 인간의 ES/iPS 세포를 수집 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 160 × g에서 인간의 ES/iPS 세포를 원심
    5. 원심, 후 DMEM/f12 키를 삭제 하 고 E8 미디어의 1 mL에 인간의 ES/iPS 세포를 일시 중단 한 다음 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 계산.
    6. 새로운 문화 요리 (P-IA hydrogels 펩타이드 또는 ECM 투입)에 적절 한 밀도 조정 (1-5 cm2 뿌리고 또는 표시 된 당 104 셀 배) 후 ES/iPS 세포를 접종.

4. 인간의 ES/iPS 셀 특성의 특성

  1. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 활동의 평가
    1. 표준 알칼리 성 인산 가수분해 효소 라이브 얼룩을 사용 하 여 인간의 ES/iPS 세포의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 활동을 측정 합니다.
  2. Immunostaining
    1. Tra-1-81, SSEA 4, Sox2와 Oct3/4 immunostaining pluripotency 기존의 프로토콜28,32다음 조사를 hES와 엉덩이 셀에 수행 합니다.
    2. 있는 인간의 ES/iPS 세포 경작, 되었고 그 후, 셀을 해결 하기 위해 4 ° C에서 15 분 동안 요리를 품 어 각 24 잘 접시에 4% (볼륨/볼륨) paraformaldehyde 양의 0.5 mL를 추가 합니다.
    3. 각 우물에서 paraformaldehyde 솔루션 발음 그런 다음, 잘 당 1 mL의 PBS 추가 하 고 셀 린스를 PBS 발음. 3 번 헹 구는 과정을 수행 합니다.
    4. 0.3% (볼륨/볼륨) 실 온에서 30 분 PBS에서 트리톤 X 100 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 여 세포 막 permeabilize.
    5. 트리톤 X 100 솔루션 발음 및 각 음에 PBS (버퍼 차단)에 2% (무게/볼륨) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 300 µ L을 추가 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    6. Pipetting에 의해 블로킹 버퍼를 제거 하 고 그 후, 원하는 기본 항 체를 추가 (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200), 그리고 피 펫, 여 Tra-1-81(1:200) 표 2참조) 어디 1: 200의 항 체 희석 했다 나타냅니다. 각 음에 PBS와 200-fold 및 4 ° c.에 1 일 동안 incubated
    7. 1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 0.05%의 300 µ L로 세포 세척 3 번 실 온에서 PBS 솔루션에서 트윈 20.
    8. 이차 항 체의 300 µ L를 추가 (1: 200, 표 2참조), 기본 IgG 하위 형식에, 각 2% (무게/볼륨) BSA 솔루션에 잘 그리고 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 품 어.
    9. 0.05%의 300 µ L로 세포 세척 어둠 속에서 실 온에서 3 회 PBS 솔루션에서 트윈 20.
    10. Confocal 현미경 검사 법 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 스테인드 세포 분석.
  3. Embryoid 몸 형성
    1. 10과 20 구절에서 embryoid 몸 (EB) 형성에 의해 인간의 ES/iPS 세포의 pluripotency를 조사 합니다.
      참고: 80%에 가까운 6 잘 플레이트에 합류 EB 형성의 준비를 위해 충분 하다.
    2. 인간의 ES 또는 DMEM/F-12 미디어의 2 mL와 iPS 세포를 두 번, 린스 하 고 필수 6 미디어의 1.5 ml에서 셀을 담가.
    3. 80 %confluent 인간의 ES 또는 iPS 셀 근처 200 µ L 팁을 사용 하 여 약 32 조각으로 잘라. 다음으로, 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 요리에서 세포를 분리 합니다.
    4. 6 잘 ultralow 첨부 파일 접시에 인간의 ES/iPS 세포 및 전송을 수집 합니다.
    5. 필수 6 미디어를 오래 된 미디어를 pipetting 추가 신선한 미디어 2 일 마다 교환 합니다.
      참고: 5% CO2와 37 ° C에서 2 주 동안에 세포 문화.
    6. EBs homogenously 필수 6 미디어에서 중단 되었다, 후 EBs 0.1 중량 % 젤라틴 코팅 24 잘 TCP 요리 문화를 전송 및 추가로 1 주일에 대 한 필수 6 미디어 셀 문화.
    7. 3 개의 미 발달 생식 층에서 파생 된 세포의 표식에 대 한 항 체와 세포 얼룩 [AFP (endoderm), 연 면적 (ectoderm), β III-Tubulin (ectoderm)와 SMA (mesoderm)] 위에서 설명한 immunostaining 메서드에서 셀 평가 및.
  4. 기형종 형성
    1. 10과 20 구절에서 기형종 형성에 의해 인간의 ES/iPS 세포의 pluripotency를 조사 합니다.
      참고: 6 잘 플레이트에 80% 합류 근처의 5 요리는 기형종 형성에 대 한 충분 한 (적어도 3 x 106 세포가 기형종 형성 실험에 필요한).
    2. 2 mL DMEM/F-12 미디어와 셀을 두 번, 린스 하 고 셀 문화 요리 1.5 mL DMEM/F-12 미디어를 추가 합니다.
    3. 200 µ L 팁을 사용 하 여 거의 80 %confluent 인간의 ES 또는 iPS 셀 약 32 조각으로 잘라. 다음으로, 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 요리에서 세포를 분리 합니다.
    4. 15 mL 원심 분리 관으로 인간의 ES/iPS 세포를 수집 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 160 × g에서 세포를 원심
    5. 원심, 후 100 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 DMEM/F12, 그리고 다음 믹스 100 µ L로 알 약을 셀 Matrigel (볼륨 1:1 비율).
    6. -20 ° C 중 냉각된 주사기로 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 총, 적어도 3 × 10에에서6 셀 피하에 주사 남성 끄 덕-SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdascid/JNarl) 마우스 (5-8 주).
    7. 5-8 주 후, teratomas를 해 부, 4.0% (무게/볼륨) paraformaldehyde 솔루션을 수정 하 고 4 ° c.에 저장
    8. 파라핀은 기형종 해결, 파라핀 끼워 넣어진 teratomas 슬라이스와 hematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩 표준 프로토콜28,32를 사용 하 여.
      참고: 연구원 고정된 기형종 조직 파라핀, 파라핀 끼워 넣어진 슬라이스 teratomas는 teratomas 해결 얼룩 H & E, 병원에서 병 리과에서 일반적으로 사용 되는 샘플을 회사에 보낼 수 있습니다.
  5. 인간 지방이 많은 파생 된 줄기 (광고) 세포 배양
    1. 따뜻한 문화 미디어 (DMEM 1 %antimycotic 항생제와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함), 사용 하기 물 목욕 전에에서 37 ° C에 트립 신-EDTA, 그리고 PBS의 0.25%.
    2. 인간의 광고 셀 셀 교양 있는 각 6 cm 문화 접시에 pipetting 10 mL의 PBS로 세척.
    3. 6 cm 문화 요리에 트립 신-EDTA 용액 (0.25%)의 1 mL을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 솔루션을 품 어.
    4. 셀 분리 되 확인 현미경 아래 6 cm 문화 요리에 세포를 관찰 합니다.
    5. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 하 고 문화 미디어의 동일한 볼륨을 추가 (DMEM 1 %antimycotic 항생제 및 10 %FBS) 트립 신-EDTA 무력화 원심 분리기 관으로.
    6. 37 ° c.에 5 분 동안 250 × g에서 세포를 원심
    7. 원심, 후 pipetting 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 여는 상쾌한을 신중 하 게 삭제 합니다.
    8. 문화 미디어에 셀 resuspend 그리고 새로운 문화 요리 (P-IA hydrogels 펩타이드와 ECM 없이 투입)에 적절 한 밀도 (5-10 cm2 뿌리고 또는 표시 된 당 103 셀 배)에서 세포를 시드하십시오.
  6. 인간의 양수 줄기 세포 배양 (AFS)
    1. 재배 미디어 (DMEM/MCDB 201 (2:3) 포함 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5 ng/mL bFGF와 1 %antimycotic 항생제), 따뜻한 물 목욕 전에 사용에서 37 ° C에 트립 신-EDTA, 그리고 PBS의 0.25%.
    2. 인간의 AFS 셀 셀 교양 있는 각 6 cm 문화 접시에 PBS의 pipetting 10 mL로 씻어.
    3. 6 cm 문화 요리에 트립 신-EDTA 용액 (0.25%)의 1 mL을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
    4. 셀을 확인 하는 현미경 아래 6 cm 문화 요리에 셀 분리 관찰 합니다.
    5. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 하 고 트립 신-EDTA 무력화 원심 분리기 관으로 문화 미디어 (DMEM/MCDB 201 (2:3) 포함 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5 ng/mL bFGF와 1 %antimycotic 항생제)의 동일한 볼륨을 추가.
    6. 37 ° c.에 5 분 동안 250 × g에서 세포를 원심
    7. 원심, 후 pipetting으로 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 신중 하 게 삭제.
    8. 재배 미디어에 셀 resuspend 하 고 새로운 문화 요리 (P-IA hydrogels 펩타이드와 ECM 없이 투입)에 적절 한 밀도 (5-10 cm2 뿌리고 또는 표시 된 당 103 셀 배)에서 세포를 시드하십시오.

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결과

P-IA hydrogels ECM 파생 된 펩타이드 (oligoECM)로 융합 또는 다른 신축성으로 ECM 준비 반응 체계에 따라 그림 1A에서 보이는 것과 같이 oligoECM (그림 1B)의 다른 종류를 사용 하 여. hydrogels의 신축성은 적용된 가교 강도 (시간) (그림 1C)에 의해 규제 했다. P-IA hydrogels 25.3 kPa (24 h 가교 시간)의 저장 탄성 률이 vitronectin에서 파생 된 펩타이드와 융합 지원 인간 iPS와 이상에 대 한 ES 세포의 장기 문화 10-20 구절. 특히, 공동 세그먼트 (P-i A-24 h-VN1G)와 P-IA hydrogels 투입 또는 듀얼 체인 (P-i A-24 h-VN2G) 인간 iPS와 P-아이오와-VN1 보다 oligoECM (200-...

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토론

P-i A-oligoECM 및 다양 한 강성과 P-아이오와-ECM hydrogels 인간의 ES와 이종 무료 조건에 이상 10 구절 뿐만 아니라 인간의 AFS 셀, 광고 셀의 문화에 대 한 그들의 pluripotency를 유지 하는 iPS 세포의 장기 확장을 위해 개발 되었다 그리고 조 혈 줄기 세포25,,2832. P-IA hydrogels oligoECM와 함께 움직일 수는 차별화의 운명과 기본 세포로 서 줄기 세포의 다양 한 종류의 확산에 셀 문화 자료의 효과 조사 하기 위해 세포 배양 재료에 대 한 훌륭한 후보와 암 세포입니다.

P i A 솔루션 P i A 솔루션 요리에 캐스팅은 투명 해야 합니다. 가교 시간 P-IA hydrogels의 가교 강도 결정합니다. 24 h P-IA hydrogels의 가교 인간...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 부분적으로 부여 번호 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006, 104-2221-E-008-107-MY3 아래 과학과 기술, 대만 의해 지원 됩니다. 이 연구는 대만 Landseed 병원 프로젝트 (NCU-LSH-105-A-001)에 의해 또한 지원 되었다. 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본에서 과학 연구 (숫자 15 K 06591)에 대 한 특정도 인정 했다. A. 히구치 대학원 및 연구, 킹 사우드 대학, 리야드 11451, 사우디아라비아 왕국에 대 한 국제 과학 파트너십 프로그램 (ISPP-0062) 부회장 Rectorate에 대 한 인정 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GTPGPQGIAGQRGVVPH 일본없음사양: Oligopeptide
약어: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH 일본없음 사양: Oligopeptide
약어: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH 일본없음사양: Oligopeptide
약어: CS1
EILDVPSTPH 일본없음사양 : Oligopeptide
약어 : VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH 일본없음사양 : Oligopeptide
약어 : HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH Japan없음사양 : Oligopeptide
약어 : HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH 일본없음사양 : Oligopeptide
약어 : VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH 일본없음사양: Oligopeptide
약어: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH 일본없음사양: Extracellular matrix
약어: rVN
VitronectinThermo Fisher scientificA14700사양: Extracellular matrix
약어: FN
FibronectinSigma-AldrichF2006사양 : 상업적으로 이용 가능한 코팅 재료
약어 : Synthemax II
Synthemax IICorning3535사양 : 고분자
폴리 비닐 알코올 - 코 이타콘산일본 VAM & PovalAF-17사양 : 화학
글루 타르 알데히드시그마 - 알드리치G5882사양 : 화학
물질 Na2< / sub>SO 4< / sub>Aldrich239313사양 : 화학
물질 H2< / sub >SO4 < / sub>Sigma-Aldrich339741사양 : 화학 < br / > 약어 : EDC
N- (3- 디메틸 아미노 프로필) -N'- 에틸 카르 보디 이미드 염산염시그마 - 알드리치E7750사양 : 화학 < br / > 약어 : NHS
N- 하이드 록시 숙신이 미드시그마 - 알드리치56480사양 : 화학
파라 포름 알데히드시그마 - 알드리치P6148사양 : 화학
트리톤 -X100시그마 알드리치T8787사양: Cell culture consumable
Cell scraperCorning3008사양: Cell culture consumable
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693사양: Cell culture medium
Essential 6Thermo Fisher scientificA1516401사양: Cell culture medium
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001사양: 세포 배양 배지
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032사양: 세포 배양 배지
DMEMThermo Fisher scientific12800-017사양: 세포 배양 배지
MCDB 201Sigma-AldrichM6770사양: ES cell
Human ES cellWiCell Research Institute, Inc..WA09사양 : iPS 세포
인간 iPS 세포Riken 세포 은행HS0077사양 : 35 mm
약어 : TCP
TCP 접시코닝353001사양 : 60 mm
약어 : TCP
TCP 접시코닝353002사양 : 24 잘
접시 24 잘 접시코닝353047사양 : 차단 제제
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA8806사양: 검출 시약
알칼리성 인산가수분해효소 라이브 스테Thermo Fisher ScientificA14353사양: 검출 시약
Hematoxylin & eosinSigma-Aldrich1.05175사양: EB 형성 접시
6웰 초저 부착 접시Corning3471사양: 코팅 재료
젤라틴Sigma-AldrichG9391사양: 코팅 재료
MatrigelCorning354230사양: 마우스
NOD-SCID 마우스National Applied Research Laboratories없음사양: 혈청
태아 소 혈청생물학 산업04-001-1A사양: 항생제
항진균성 항생제Thermo Fisher Scientific15240-062사양:
NanogInvitrogenMA1-017사양:
SSEA4Abcamab16287사양:
OCT3/4InvitrogenPA5-27438사양:
Sox2용Invitrogen48-1400사양:
평활근 ActinInvitrogenPA5-19465사양:
AFPInvitrogenPA5-21004사양: 항체
항체 GFAPInvitrogenMA5-15086사양:
항체 Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse 항체InvitrogenA-21422사양: 항체
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit 항체InvitrogenA-11008사양: 항체
인 용 항체 용 항체 용 항체 항체용 항체 용 항체

참고문헌

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493(2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778(2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312(2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136(2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647(2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146(2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

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