젤-seq: DNA와 RNA 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법

요약

젤-seq 연구자를 준비가 동시에 라이브러리에 대 한 두 DNA-및 RNA-seq 간단한 히드로 장치를 사용 하 여 100-1000 셀에서 시작 하는 무시할 수 추가 비용 있습니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다.

초록

능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 불행히도, 게놈 생성 또는 transcriptomic 라이브러리에 대 한 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 그리고 연구원은 특정 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 젤-seq 연구원은 DNA와 RNA 100-1000 셀 하이드로 겔 간단한 장치를 사용 하 여 시작에 대 한 라이브러리를 동시에 준비 하 여이 문제를 해결 합니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 우리 설계 젤-seq; 다른 연구자에 의해 쉽게 구현 될 수 있도록 많은 유전학 실험실 이미 젤-seq 장치 제작을 재현 하는 필요한 장비. 우리의 프로토콜 사용 하 여 두 전체 사본 증폭 (WTA)에 대 한 키트 일반적으로 사용 되 고 라이브러리 준비는 연구원에 게 이미 익숙할 것 또한 라이브러리 생성 하 게놈 그리고 transcriptomic에 정통한. 우리의 접근 연구원을 무시할 수 추가 비용와 분할 하지 않고 단일 샘플에 DNA와 RNA 시퀀싱의 힘을가지고 있습니다.

서론

차세대 시퀀싱 (NGS) 유전학 연구는 실시 방법에 깊은 영향을 했다. 연구원은 한 번 전체 종의 게놈 시퀀싱에 초점을 맞춘, 단일 종양 또는 심지어 한 실험에 있는 단일 셀의 게놈을 시퀀싱 수 지금이. ¹ NGS는 또한 했다 비용 효율적인 셀 데이터는 transcriptome로 알려진 컬렉션 내 RNA 사본 시퀀싱 하. 능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. ^{2 , 3 , 4} 는 불행 하 게도, 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 하 고 연구원은 주어진된 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 시작 샘플 충분히 큰 경우 반으로 나눌 수 있습니다. 그러나 작은 스케일에서, 샘플 분할로 인해 재료의 손실 라이브러리 품질에 영향을 하 고 셀 사이의 재미 있는 변화 밖으로 평균 수 샘플 풀링. ⁵ 또한, 연구팀은 단일 세포 또는 작은 다른 유형의 종양 생 검 등 분할 수 없는 샘플 검사에 점점 관심이 있습니다. ⁶

이 문제를 해결 하려면 세 가지 프로토콜 최근 개발 된 동일한 시작 샘플에서 DNA와 RNA 시퀀싱 하: 젤-seq⁷,⁸G & T-seq 및 박사-seq⁹. 이 문서는 젤-seq, 동시에 몇 가지 사소한 추가 비용 100 셀으로에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 독점적으로 저가 히드로 매트릭스를 사용 하 여 크기에 따라 분리 하는 기능입니다. 젤-Seq 프로토콜의 핵심 혁신은 RNA에서 DNA의 물리적 분리 이다. 이 분리 electrophoretically polyacrylamide 막이이 분자의 크기 차이 활용 하는의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 맥락에서 이러한 크기 차이 넣어, DNA와 RNA의 이미지로 어떻게 하는 것을 고려: DNA 미크론 단위에 존재 하는 동안 전통적인 현미경을 사용 하 여 볼 수 있습니다, RNA 나노미터 규모로 존재 하 고 cryo 전자 등 복잡 한 기술을 사용 하 여 촬영 해야 합니다 현미경 검사 법입니다. ¹⁰

이 프로토콜에서 DNA와 RNA를 분리 하는 접근 방식은 그림 1에 표시 됩니다. 왼쪽된 패널 DNA와 RNA 무료 솔루션 막 근처에 떠 있는 것을 보여줍니다. 전기 분야 적용, 오른쪽 패널에 표시 된 것 처럼, DNA와 RNA는 세포 막을 통해 마이그레이션 유도 전기 이동 힘 경험. 막 속성을 조정 하 여 우리는 RNA에서 DNA를 분리 하는 반 투과성 막을 만들었습니다. DNA 분자는 멤브레인에 대 한 적용 됩니다 하지만 그들의 큰 크기 때문에 가장자리에 얽히게 된다. 작은 RNA 분자, 다른 한편으로, 재구성 고 막 통해 그들의 방법을 짜 다 수 있습니다. Reptation로 알려진이 프로세스는 잔디를 통해 뱀 이동 방법와 비슷합니다. 결국 이러한 RNA 분자는 너무 어려운 작은 고분자에 대 한 두 번째, 고밀도 막 중단 되었습니다 (> 200 기본적인 쌍)을 통해 몸부림. 일단 물리적으로 분리, DNA와 RNA 복구 고 게놈 및 transcriptome에 대 한 정보를 생성 하는 처리. 우리는 DNA와 RNA를 분리할 수 있습니다, 하는 동안 우리는 RNA는 역방향 분리 전에 cDNA를 복사할 경우 더 나은 결과 얻을 수 있습니다 나타났습니다. CDNA/RNA 하이브리드 RNA 혼자 보다 더 안정 되며 저밀도 멤브레인 통해 전달할 수 있습니다.

그림 1 . 젤-seq 운영 원칙. 육체적으로 DNA와 RNA를 분리 하는 데 사용 하는 기본 원리. 적용 된 전기 분야에서 작은 RNA 분자는 저밀도 막 통해 마이그레이션할 하지만 큰 DNA 분자 표면에 갇혀 있다. 이 그림은 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 종이 젤-seq 장치 제조 자세히 설명 하 고 생성 하는 생물 학적 프로토콜 결합 DNA와 RNA 라이브러리. 둘 다에 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다. 장치는 레이어 링 3 개의 서로 다른 밀도 polyacrylamide 젤 서로 표준 스태킹 젤을 만드는 유사한 과정에 의해 조작 됩니다. ¹¹ 생물 학적 프로토콜 100-1000 셀 PBS에 정지로 시작 합니다. 셀 lysed 고 RNA cDNA/RNA 하이브리드에서 게놈 DNA를 분리 하는 장치를 사용 하기 전에 cDNA로 변환 됩니다. 분리 및 복구, 게놈 및 transcriptomic 후 라이브러리 표준 전체 게놈 라이브러리 준비 키트 프로토콜을 다음과 밀접 하 게 하는 프로세스를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 칩 게시 에 실험실에서 개발 및 젤-seq의 유효성 검사에 대 한 추가 세부 정보를 읽을 수 있습니다 "젤-seq: 전체 게놈 및 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 사용 하 여 반 투과성 히드로 장벽을 transcriptome 시퀀싱 ." ⁷

그림 2 . 젤-seq 프로토콜. 젤-seq 장치 및 생성 된 쌍을 이루는 DNA와 RNA 라이브러리에 프로토콜을 조작 하는 단계의 개요입니다. 이 그림의 일부는 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단일 세포에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하기 위해 연구원은 G & T-seq 또는 박사가 G & T-Seq, 젤-seq 같은 사용 하 여 고려해 야, genomic DNA에서 RNA의 물리적 분리에 의존. 메신저 RNA (mRNA)에 의존 하는이 방법은 3 ' polyadenylated 꼬리 풀 다운 대상으로. mRNA에 자석 구슬을 biotinylated 올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여 캡처됩니다. 일단는 mRNA를 캡처한 구슬 자석와 장소에서 개최 되 고 게놈 DNA를 포함 하는 상쾌한 수 있습니다 제거 하 고 다른 튜브로 전송. 이 물리적 분리 완료 되 면 DNA와 mRNA에서 별도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. ^{그러나 8} 이 이렇게 잘 관심의 RNA는 polyadenylated, 그것은 사용할 수 없습니다 ribosomal RNA, tRNA, 또는 RNA 원핵생물에서 같은 비-polyadenylated 증명서를 공부 하 작동 합니다.

박사-seq 같은 튜브에 DNA와 RNA에서 파생 하는 cDNA 증폭 됩니다 사전 증폭 단계에 의존 합니다. 샘플은 다음 둘 하 고 DNA와 RNA seq 라이브러리를 준비 하는 동시에 처리. 게놈 DNA와 RNA에서 파생 된 cDNA 사이 구별, 박사-seq 전산 접근을 걸립니다. 그 중 DNA 또는 RNA에서 유래 수로 exons는 현재 시퀀스 계산 genomic DNA 데이터에 억제 됩니다. ⁹ 는이 방법의 장점은 그 DNA 및 cDNA/RNA 필요 하지 물리적으로 분리 될 젤-seq와 G & T이 이루어집니다. 그러나, 단점은 박사-seq 게놈 및 (즉, introns 대 exons), transcriptome 선험적 지식이 필요 하 고 이상적인 시퀀싱의 핵, 없는 많은 증명서는 아직 완벽 하 게 되지 않을 수도 있습니다. 접합 하 고 여전히 introns를 포함. ¹²

젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 크기에 독점적으로 기반으로 셀의 수백에서 분리 하는 기능입니다. 이 메서드는 선험적 지식이 게놈 또는 transcriptome, 불완전 한 접합에 대 한 강력한 이며 폴 리 adenylated 증명서에 국한 되지 않습니다 필요 합니다. 애플리케이션에 연구원 적어도 100 셀 시작할 수 젤-seq 저렴 하 고 널리 사용 가능한 재료를 사용 하 여 간단한 접근을 제공 합니다.

프로토콜

1. 화학 솔루션 준비

참고: 다음 단계는 이후 단계에서 필요한 화학 솔루션을 준비. 이러한 대량에서 만든 고 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다.

1. 시작 하려면, 어떤 오염 DNA 중화 15 분 (15 mJ/cm² 총 노출) 254 nm 자외선 가교 오븐에 살 균 하 여 정화, 이온 물 50 mL를 준비 합니다. 다음 단계에 사용 하기 위해 37 ° C에가 열.
2. 총 40% (T) 및 3.3 %crosslinker (C) (29: 1) 10 mL를 만들기 polyacrylamide 전조가 솔루션. 아크릴 모노 머의와 비스 아크릴 아 미드 단위체의 0.133 g 3.867 g 무게. 결합 하 고 볼륨을가지고 최대 10 mL 따뜻한 물 정화와 소용돌이 녹아 때까지. 스토어 실 온에서 빛 으로부터 보호입니다.
   참고: Premixed 40 %T, 3.3 %C (29: 1) polyacrylamide 솔루션 구입하실 수 있습니다 상업적으로.
3. 50 %T, 5 %C 젤 솔루션의 10 mL를 확인 합니다. 아크릴 모노 머의와 비스 아크릴 아 미드 단위체의 0.250 g 4.750 g 무게. 결합 하 고 볼륨을가지고 따뜻한 물 정화 및 해산 때까지 소용돌이 사용 하 여 최대 10 mL. 스토어 실 온에서 빛 으로부터 보호입니다.
4. 50% (w/v) 자당 솔루션의 10 mL를 확인 합니다. 5 g 자당 졸업된 실린더를 추가 하 고 10 ml 전체 볼륨까지 따뜻한 물 정화를 추가. 해산 때까지 소용돌이 고 실내 온도에 상점.
5. 10%의 10 mL 확인 APS (w/v). 졸업된 실린더를 암모늄 persulfate (AP)의 1 g을 추가 합니다. 감기 (~ 4 ° C) 정화 추가 물 10 mL 및 해산 때까지 소용돌이의 총 볼륨까지. 즉시 200 µ L의 aliquots에 고정 합니다.

2. 젤-seq 카세트 제작

참고: 젤-seq 똑바로 카세트 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조); 원래 개발 되었다 그러나,이 프로토콜은 모든 표준 젤 전기 이동 법 카세트와 함께 작동 하도록 적용할 수 있습니다.

1. 표 1에서에서 아래와 같이 시 약을 추가 하 여 3 개의 별도 플라스틱 튜브에 젤 선구자를 준비 합니다. 하지 않습니다 AP 또는 Tetramethylethylenediamine (TEMED) 다음 단계에서 지시 될 때까지 추가. 소용돌이 철저 하 게 혼합 재료.

필러 젤 전조		고밀도 젤 전조		낮은 밀도 젤 전조
40 %T, 3.3%C 아크릴 Bisacrylamide 솔루션	1.6 mL	50 %T, 5 %C 아크릴 Bisacrylamide 솔루션	2.4 mL	40 %T, 3.3%C 아크릴 Bisacrylamide 솔루션	0.6 mL
이온된 수	10.2 mL	이온된 수	1.0 mL	이온된 수	4.8 mL
자당 솔루션 (50 %w / v)	2.6 mL	자당 솔루션 (50 %w / v)	0.6 mL
10 X 트리 스-Borate-EDTA	1.6 mL			10 X 트리 스-Borate-EDTA	0.6 mL
암모늄 persulfate (10 %w / v)	104.0 Μ L	암모늄 persulfate (10 %w / v)	50.0 Μ L	암모늄 persulfate (10 %w / v)	39.0 Μ L
TEMED	6.0 Μ L	TEMED	1.0 Μ L	TEMED	2.2 Μ L
총 볼륨	16.1 mL	총 볼륨	4.1 mL	총 볼륨	6.0 mL

표 1입니다. 합성 시 약 젤. Polyacrylamide 젤 선구자 약 2 카세트의 제작에 대 한 충분 한

2. 튜브의 모자를 통해 바늘을 삽입 하 고이 바늘 집 진공 라인에 연결 하 여 탈 가스 젤 단위체 솔루션. 높은 초음파 목욕 세트에이 어셈블리를 잠수함과 거품 액체에서 다음 단계로 이동 하기 전에 신흥 중지 될 때까지 기다립니다 (~ 60 초 / 튜브).
   참고: 진공의 질 및 초음파 목욕의 아니다 중요 한 너무 오랫동안 솔루션에서 신흥 거품을 볼 수 있다.
3. 추가 APS와 TEMED 필러 젤 전조와 소용돌이를 짧게 합니다. 즉시 솔루션 카세트의 상단에 pipetting 여 각 젤 카세트 필러 젤 전조의 6 mL를 추가 합니다. 사용 하 여 1 mL micropipette 흘리 고 피하기 위해 6 단위로 전조를 추가. 이 단계에 대 한 총 시간 3 분 미만 이어야 한다.
4. 액체는 카세트를 레벨 테이블에 똑바로 배치 하 여 수준 인지 확인 합니다. 이온, degassed 물으로 카세트의 나머지를 채우십시오. 다시 사용 하 여 1 mL 씩, 천천히 혼합을 최소화 하기 위해 카세트의 센터에 물, 플라스틱 폴리머 하룻밤에 최대 1 시간 이상에 대 한 치료를 하실 수 있습니다.
5. 폴리머는 치료 후 물 층을 제거 하는 위에 젤 카세트를 반전. 부드럽게 인터페이스 6 인치의 거리에서 카세트의 상단 개방을 통해 공기를 불어 건조 압축 공기 총을 사용할 수 있습니다.
6. 추가 APS와 TEMED 고밀도 젤 전조와 소용돌이를 짧게 합니다. 즉시 다시 1 mL 피 펫을 사용 하 여 카세트를 고밀도 전조의 320 µ L를 추가 합니다. 액체는 균등 하 게 락 카세트와 약 3 시간 여 필러 젤 레이어 코트 확인 합니다. 이 단계는 3 분 미만 소요 됩니다.
7. 이온, degassed 물으로 카세트의 나머지를 채우십시오. 천천히 혼합을 최소화 하기 위해 카세트의 중앙에 1 mL 피 펫과 플라스틱. 폴리머 적어도 15 분, 가급적 이면 한 시간에 대 한 치료를 하실 수 있습니다.
8. 다시, 반전 물 오버레이 제거 하 젤 카세트. 압축 공기는 부드럽게 건조 인터페이스를 사용할 수 있습니다. 추가 APS와 TEMED 저밀도 젤 전조와 소용돌이를 짧게 합니다. 즉시 저밀도 젤 전조와 카세트 (~1.65 mL)의 나머지를 작성 하 고 젤 빗을 삽입.
9. 플라스틱 빗의 상단에서 보유 전조의 과잉으로 중 합 하는 동안 흡수 될 것 이다. 폴리머 적어도 4 시간, 가급적 이면 밤새 껏 치료를 하실 수 있습니다. 젤 트리 스-붕 산 염-Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (TBE 버퍼) 버퍼에 1 주일 이상 저장할 수 있습니다.

3. 샘플 준비 및 전사 역

1. 관심, 셀의 서 스 펜 션으로 시작 하 고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 층 류 두건에서 셀 농도 계산 하는 hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) µ L 당 100 ~ 1000 셀의 농도에 세포를 희석.
   참고:이 프로토콜 PC3, 헬러, 그리고 마우스 간 세포를 포함 하 여 셀의 범위에서 검증 되었습니다.
2. WTA는에서 제공 하는 시 약을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조), 혼합 세포의 용 해 버퍼의 19 µ L 그리고 10 배 준비 RNase 억제제의 1 µ L 주식 반응 버퍼의 솔루션. 반응 버퍼의 0.5 µ L 각 샘플에 대 한 무료 물 nuclease 2.75 µ L을 포함 하는 충분 한 양의 세포 마스터 믹스를 만듭니다.
3. 다시 정착된 셀을 일시 중단 하 고 다음 200 µ L nuclease 무료 스트립 튜브 자외선에 의해 소독으로 샘플의 1 µ L를 플라스틱을 5 번 위아래로 세포 현 탁 액 플라스틱 샘플의 번호에 따라 필요한 만큼 반복 합니다. 하나의 반응에 대 한 셀 대신 nuclease 무료 물 pipetting 1 µ L에 의해 부정적인 제어를 포함 해야 합니다. 다음, 각 샘플에 세포 마스터 믹스의 3.25 µ L을 추가 하 고 부드럽게 5 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
4. 72 ° c (온수 뚜껑)와 열 cycler 예 열 각 샘플에 WTA 어댑터 (5 '-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3) RT 뇌관의 1 µ L와 20 µ M 임의의 hexamer의 1 µ L를 추가 합니다. GDNA 라이브러리 준비에 대 한 긍정적인 제어로 적어도 1 개의 관을 보유 하 고 뇌관 대신 물 2 µ L를 추가 합니다.
   참고: WTA 어댑터와 무작위 hexamer 선택적 이며 시퀀싱 결과에 미치는 영향을 최소화 했다.
5. 세포를 lyse에 3 분 데워 열 cycler에 72 ° C에서 샘플을 품 어. 2 분 동안 얼음에 장소와 열 cycler에서 셀을 제거 합니다. 5 단계까지 4 ° C에서 긍정적인 컨트롤을 저장 합니다.
6. 셀 lysing는 하는 동안 다음 시 비율을 포함 하는 모든 RNA 샘플에 대 한 반전 녹음 방송 마스터 믹스의 충분 한 볼륨 작성: 첫 번째 가닥 버퍼의 2 µ L, 0.5 µ L 서식 파일 스위치 oligonucleotide (TSO), 0.25 µ L의 RNase 억제제, 및의 1 µ L의 역전사 (100 U / µ L)
7. 42 ° c 열 cycler 예 열 반전 녹음 방송 마스터 믹스의 3.75 µ L 10 µ L. 총 샘플 볼륨을 데리고 나머지 샘플에 추가 5 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
8. 반전 녹음 방송 즉시 데워 열 cycler에서 샘플을 배치 하 여 수행 합니다. 다음 프로그램 실행: 90 분, 10 분, 4 ° C 영원히 70 ° C에 대 한 42 ° C. 이것은 안전 정지 지점 이다.

4. 젤 분리 하 고 복구

1. 신중 하 게 DNA 제거 제품을 사용 하는 젤 전기 이동 법 실 청소. 챔버의 모든 표면에 걸쳐 일회용 보풀 무료 지우기 및 지우기 액체 세정제의 몇 mL를 적용 하 고 다음 깨끗 한 0.5와 챔버를 입력 x TBE. 최적의 결과 얻으려면 전체 기구 254 nm 자외선 가교 오븐에 놓고 15 분 (15 mJ/cm²)에 대 한 소독 합니다.
2. 젤 전기 이동 법 챔버로 젤-seq 카세트를 삽입 하 고 제자리에 고정. 천천히 위로 젤 빗을 제거 합니다. 천천히 찢 어 젤 또는 팔의 리핑 방지 하려면 이동 합니다.
3. 얼음에 3 단계에서 샘플을 유지, cDNA 라이브러리 생성을 위한 긍정적인 컨트롤 하나 이상의 샘플을 보유 합니다. 6 단계까지 4 ° C에서이 컨트롤을 저장 합니다. 나머지 샘플 염료 로드 X 6의 2 µ L을 추가, 5 번 위아래로 pipetting으로 샘플을 섞어 데 총 볼륨 ~ 12 µ L. 철저 하 게.
4. DNA 사다리의 1 µ L 2 µ L 로드 염료 및 물 7 µ L x 6의 결합. 전기 이동 법 컨트롤로 젤-seq 카세트의 1 차선으로이 혼합물을 플라스틱. 젤-seq 카세트의 별도 차선에 이전 단계에서 샘플 플라스틱 피펫으로 각 잘 완전히 삽입만 수직 모션을 사용 하 여 그것을 제거 하 여 우물 사이 오염을 방지 하기 위해 주의 해야 합니다.
5. 젤-seq 카세트에서 cDNA/RNA 하이브리드는 gDNA를 분리 하는 30 분 동안에 걸쳐 250 V의 전기 분야를 적용 표준 젤 전기 이동 법 전원 공급 장치를 사용 하 여. 분리 된, 일단 젤 전기 이동 법 상공에서 젤 seq 카세트를 제거 하 고 근 근이 살아가고 도구 가장자리를 캐 고 하 여 카세트의 두 반쪽을 엽니다.
6. 메스를 사용 하 여 고밀도 레이어 바로 아래 절반에 젤을 잘라. 반 장갑 낀 손으로 그것을 선택 하 여 필러 젤 포함 된을 삭제 합니다. 부드럽게 페인트 스 크레이 퍼 또는 기타 유사한 도구와 된다고 하 여 카세트의 나머지 젤 껍질. 0.5 ~ 30 mL를 포함 하는 접시에 젤의이 섹션을 배치 젤 얼룩의 3 µ L 함께 x TBE.
7. Photobleaching를 최소화 하 고 부드럽게 5 분에 대 한 컨테이너를 떨고 있는 동안 젤 담가를 컨테이너 커버. 플라스틱 포장에 젤을 놓고 (추가 세부 사항 참고. 13 참조)에 대 한 젤 문서 시스템을 사용 하 여 자외선 이미지. 30 초 노출은 일반적으로 투명 한 이미지를 생성합니다. 분리 되었음을 확인 합니다.
8. 핵 산의 시각화를 촉진 하기 위하여 UV transilluminator 젤을 이동 합니다. 적절 한 자외선 안경 착용, 젤 설명서 시스템에서 결과 확인 합니다. gDNA 저밀도 젤과 저밀도 및 고밀도 지역의 인터페이스에서 cDNA의 시작에 위치 해야 합니다.
9. 메스를 사용 하 여, 포함 하는 cDNA 및 gDNA 젤의 영역 밖으로 잘라. 샘플 10 m m 젤;의 직사각형 섹션 4 m m 절단 하 여 최고의 복구 그러나, 정확한 형상 사용 젤 전기 이동 법 체계에 따라 달라 집니다. 도 부정적인 컨트롤 로드 레인을 기억 하십시오.
10. 각 장소는 무뚝뚝한 끝 핀셋의 쌍을 사용 하 여 스트립 튜브로 젤의 섹션 excised. 너무 많은 힘을 적용 하지 않도록 주의 하십시오 또는 젤 여러 조각으로 분할 합니다. 해야이 일이, 단순히 각 조각을 데리 고 튜브에 추가.
11. 튜브의 하단에 원형 패션에 피 펫 팁을 이동 하 여 피 펫 (200 µ L 피 펫 팁 잘 작동)의 팁을 사용 하 여 각 튜브에 젤을 갈기. 샘플 손실을 최소화 하기 위해 젤을 사용 하는 피 펫 팁을 제거 하기 전에 각 튜브를 nuclease 무료 물 (gDNA 샘플에 40 µ L 및 cDNA 샘플으로 80 µ L)를 추가 합니다.
12. 37 ° C 배양 기 안에 소용돌이 믹서를 스트립 튜브를 놓고 8-12 시간 동안 흔들어. 이 젤 확산 핵 산을 허용 하 고는 자연 정지점이 멀티 하루 프로토콜에 대 한.
13. 샘플 8 µ m 메쉬 필터 플레이트에 플라스틱 하 고 젤 조각 밖으로 스트레인에 5 분 동안 2600 x g에서 접시를 회전. 메쉬 필터 플레이트 주택 플레이트에서 들어올린 새로운 200 µ L 스트립 관으로 물이 젤 무료 샘플을 플라스틱.
14. 프로 테아 제 (0.9 AU/mL)의 1 µ L gDNA를 위아래로 pipetting으로 잘 혼합을 포함 하는 각 샘플을 추가 하 고 15 분 뒤에 15 분 동안 70 ° C에서 열 비활성화 50 ° C에서 품 어. 이 단계 nucleosomes를 없애고 중요 고는 gDNA를 후속 반응 단계에 액세스할 수 있습니다.
15. 18 게이지 바늘을 사용 하 여, 모든 샘플 튜브의 뚜껑에 구멍 구멍. 액체 볼륨을 줄이기 위해 vacufuge에서 샘플을 놓습니다. gDNA 샘플 5 µ L 및 cDNA 샘플 10 µ L로 감소 감소 되어야 한다.
16. Vacufuge 샘플 수에 따라, 총 증발 시간 30 분에서 60 분 사이의 달라질 수 있습니다. 샘플 볼륨 대상 볼륨 미만으로 떨어지면, nuclease 무료 물 샘플 볼륨을 추가 하면 됩니다.

5입니다. gDNA 라이브러리 준비

1. Using fluorometer 또는 유사 기술, 각 gDNA 샘플 4 단계에서 3 단계에서 긍정적인 통제에 DNA 농도 계량. 자세한 프로토콜에 대 한 fluorometer 참조 설명서를 참조 하십시오. ¹⁴
2. DNA의 0.2 ng / µ L의 샘플을 희석. 시작 셀 형식을 요구 하는 결과의 품질에 따라, 낮은 농도 아직도 가능한 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 일부 실험 해야 합니다; 그러나, 저자 낮은 0.1 ng / µ L로 라이브러리와 함께 성공을 했다.
3. 7 단계에서에서 라이브러리 준비 절반 반응 볼륨 프로토콜 따라 gDNA 라이브러리 준비를 완료 합니다.

6입니다. cDNA 라이브러리 준비

1. 10 µ L cDNA 샘플 및 4 단계에서 긍정적인 통제를 시작으로, 2 X qPCR 믹스, 0.5 µ L cDNA PCR 뇌관, 및 2 µ L nuclease 무료 물 12.5 µ L를 추가 합니다.
2. 다음 프로토콜을 사용 하 여 실시간 thermocycler PCR 수행: 10 98 ° C의 20-30 사이클 뒤 3 분 동안 95 ° C에서 핫 스타트 s, 65 ° C 30 s, 및 72 ° C에 대 일 분 총 샘플 볼륨은 25 µ L. 반응 곡선을 모니터링 그리고 일 전에 증폭을 중지 e 반응 PCR 유물 때문에 overamplification 피하기 위하여 지 수 단계 (주기 수 대 선형 신호 증가)를 둡니다. 에 대 한 자세한 overamplification를 피하고,이 종이 뿐만 아니라 참고 15의 토론 섹션 참조.
3. 증폭 후 단단한 단계의 가역 immobilization (SPRI) 구슬 다음 8 단계에서 프로토콜을 사용 하 여 제품을 청소. 일단 마무리 되 면 다음 단계를 진행 합니다.
4. Using fluorometer 또는 유사 기술, 각 cDNA 샘플 4 단계에서 긍정적인 통제에 DNA 농도 계량. DNA의 약 0.2 ng / µ L을 포함 하는 데 필요한 경우 샘플을 희석. 약간 낮은 농도 여전히 가능한 라이브러리를 생성합니다. 그러나 일부 실험 저자 라이브러리 0.1 ng / µ L로 낮은 성공 했다, 있을 것입니다.
5. 선택적 단계: 각 라이브러리 생성 반응의 유효성을 검사 하는 정량 제품 일의 1-2 µ L에 표준 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 별거를 수행. 성공적인 결과의 샘플 이미지는 그림 4에 표시 됩니다. Polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 수행 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 참고 16 참조.
6. 7 단계에서에서 라이브러리 준비 키트 절반 볼륨 반응 프로토콜을 따라 cDNA 라이브러리 준비를 완료 합니다.

7. 라이브러리 준비 절반 볼륨 반응

1. 라이브러리 준비 절반 볼륨 반응을 사용 하 여 라이브러리 준비 키트 프로토콜을 따릅니다. ¹⁷ 프로토콜의이 섹션에서 참조 하는 모든 시 약은 라이브러리 준비에서 키트 ( 재료의 표참조). UV 스트립 튜브 샘플 수에 대 한 충분 한 수를 살 균 처리 하 여 시작 합니다.
2. Transposase 반응 분석 결과에서 사용 될 각 스트립 튜브를 5 µ L transposase 버퍼를 추가 하 여 수행 합니다. 뒤에 2.5 µ L transposase 0.2 ng / µ L (0.5 ng 총)에서 2.5 µ L 입력 DNA를 추가 합니다. 5 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
3. 55 ° C에서 5 분 동안 품 어 다음 10 ° c.에서 개최 샘플에는 10 ° C에 도달 하면는 thermocycler에서 그것을 제거 하 고 즉시 각 샘플을 2.5 µ L transposase 정지 버퍼를 추가 합니다. 5 분 동안 실 온에서 샘플을 유지.
4. 7.5 µ L 도서관 준비 PCR 혼합, 인덱스 1 뇌관의 2.5 µ L 및 인덱스 2 뇌관의 2.5 µ L을 추가 하 여 전치 처리 샘플 증폭 PCR 반응 준비. 이 뇌관 독점 하 고 라이브러리 준비 키트의 제조 업체에 의해 제공 됩니다. 5 번 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
   참고: 각 샘플에 대 한 독특한 뇌관 조합 사용 됩니다 확인 하십시오. 12 다른 인덱스 1 뇌관 및 8 다른 인덱스 2 뇌관, 96 다른 샘플까지 레이블을 고유 하 게 수 있다. 각 샘플에 대 한 프라이 머의 독특한 조합을 선택 합니다.
5. PCR는 thermocycler에 다음 프로그램을 사용 하 여 수행 합니다. 샘플 볼륨 25 µ L입니다.
   3 분 동안 72 ° C
   30 초 동안 95 ° C
   12 주기:
   10 초 동안 95 ° C
   30 초 동안 72 ° C
   30 초 동안 55 ° C
   5 분 동안 72 ° C
   10 ° C에
6. SPRI 구슬 다음 8 단계에서 프로토콜을 사용 하 여 준비 된 라이브러리를 청소. 젤 전기 이동 법 또는 유사한 분석 결과 사용 하 여 라이브러리를 확인 합니다. 라이브러리를 확인 하는 방법에 대 한 내용은 라이브러리 준비 키트 설명서를 참조 하십시오. ¹⁷

8. 단단한 단계의 가역 Immobilization 비드 도서관 청소

1. 단단한 단계의 가역 immobilization (SPRI) 구슬과 1.5 mL aliquots에 저장 되어야 합니다 각 사용 하기 전에 실내 온도에 가져. 그것은 또한 각 실험에 대 한 신선한 80% 에탄올을 준비 하는 것이 좋습니다. 다음 단계는 기반으로 WTA 키트 설명서에서 SPRI 비드 프로토콜. ¹⁸
2. 각 PCR 제품에는 WTA 키트 세포의 용 해 버퍼의 1 µ l를 추가 합니다. SPRI 구슬까지 균일 하 게 혼합, 소용돌이 각 샘플에 SPRI 구슬의 50 µ l를 추가 합니다. 10 번 위아래로 샘플 pipetting으로 혼합 하 고 8 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
3. 짧게 샘플 튜브의 측면에서 액체를 수집을 회전 합니다. ~ 5 분까지 액체 나타납니다 완전히 취소에 대 한 샘플 자기 분리 장치에 놓습니다.
4. 샘플 자석 분리 장치에 있는 동안, 천천히 상쾌한 및 폐기 플라스틱-튜브에 구슬의 반지를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 다음 비즈를 방해 하지 않고 각 샘플을 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 30 초 동안 기다려야 하 고 신중 하 게는 상쾌한에서 플라스틱. 이 단계 (에탄올 세척)를 반복 한 번.
5. 샘플 30에 대 한 건조 허용 s-1 분. 할-건조 하지 샘플 큰 조각 구슬에 영구적으로 바운드 될 것입니다.
   참고: 짧은 건조 시간은 에탄올의 모든 흔적을 제거 되도록 것이 좋습니다. 에탄올의 상당량 뒤에 있어야 그들은 약간 다운스트림 반응 억제 수 있습니다.
6. 자기 분리 장치에서 샘플을 제거 하 고 추가 물 15 µ L elute 구슬에서 DNA를 각 샘플. 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 고 구슬 튜브의 측면에서 제거 됩니다 확인 합니다. 2 분 동안 실 온에서 품 어. 간단히 샘플을 회전 하 고 ~ 1 분 솔루션 분명 나타날 때까지 자기 분리 장치에 그들을 배치.
7. 샘플 자석 분리 장치에 있는 동안, 천천히는 상쾌한을 플라스틱 하 고 깨끗 한 관에 그것을 전송. 수 관에 구슬의 반지를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 구슬 튜브를 삭제 합니다.

결과

젤-seq 장치에서 gDNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 물리적 분리 형광 젤 영상; 통해 구상 될 수 있다 대표 결과 그림 3에 표시 됩니다. 패널 A 표시 조작된 젤-seq 장치; 거짓 색상 구별 다른 젤 지역에 추가 되었습니다. B 패널의 유효성 검사에 사용 하는 4 개의 다른 분판을 가까이 나타난다. 3 레인, 부정적인 컨트롤 배경 나타내고 인터페이스에서 젤의 아무 autoflourescence는 보여줍니다. 우리는 DNA 사다리와 함께 첫 번째 및 두 번째 차선을 로드. 이 차선 표시 낮은 및 고밀도 세포 막, 작은 조각 저밀도 젤을 통해 전달할 수 있습니다 공개 간의 인터페이스에만 어두운 밴드. 4 레인의 생물 학적 샘플의 동작을 보여 줍니다: 500 PC3 셀. 우리는 프로토콜의 3 단계에서 설명한 대로 레인 4 로드. 이미지는 genomic DNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 분리를 보여줍니다. ...

토론

젤-seq 장치 제조 뿐만 아니라 프로토콜 자체와 관련 된 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 제조, 중 젤의 다양 한 지역에 대 한 소정의 레이어 두께 함께 시작 하는 것이 좋습니다. 우리는 다른 제조 옵션을 테스트 하는 중요 한 시간을 보냈다 고 여기에 설명 된 프로토콜 카세트에 테이블의 재료 및 시 약에대 한 가장 좋은 장치를 생성 합니다. 연구자는 다른 카세트 시스템을 사용 하는 경우 그들은 장치를 만들 때 사용 하는 볼륨을 조정 하는 데 필요한 찾을 수 있습니다. 제조의 주요 과제는 고밀도 젤 영역이 카세트의 가장자리에서 delaminate 하 고 전기 중단 됩니다 카세트의 내부에 공기 주머니를 만들 수 너무 큰 경우. 여러 다른 레이어 볼륨 여러 카세트를 캐스팅 하 여 연구원 신속 하 게 그들의 특정 하드웨어에 대 한 최적의 구성을 확인할 수 있어야 합니다.

젤-seq 프로토콜 또한 프로토콜 완료 되기 전에 유효성을 검사할 수 있는 몇 가...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
아크릴아미드 단량체	시그마 Aldrich	A8887-100G
과황산암모늄	시그마 Aldrich	A3678-25G
Ampure XP 비즈	Beckman Coulter	A63880	텍스트에서 고체상 가역성 고정화(SPRI) 비드로 언급됨
DNA 겔 로딩 염료(6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	본문에서 6X 로딩 염료
에틸 알코올	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST 원스텝 qRT-PCR 키트	Kapa BioSystems	7959613001	본문에서 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(아크릴아미드)로 언급됨	Sigma Aldrich	146072-100G	비스-아크릴아미드
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (본문에서는 library preparation kit라고 함)	Illumina	FC-131-1024	포함: TD (본문에서는 transposase buffer라고 함), ATM (본문에서는 transposase로 언급), NT (본문에서는 transposase stop buffer라고 함) 및 NPM (본문에서는 library prep PCR mix라고 함)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (본문에서는 전체 전사체 증폭(WTA) 키트라고 함)	Takara/Clontech	634888	포함: 용해 완충액, RNase 억제제, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (본문에서는 RT 프라이머), 5X Ultra Low First Strand Buffer (본문에서는 1차 가닥 완충액이라고 함), SMART-Seq v4 Oligonucleotide(본문에서는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)라고 함), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (본문에서는 역전사 효소라고 함) 및 PCR Primer II A (본문에서는 cDNA PCR 프라이머라고 함)
WTA 어댑터가 있는 무작위 헥사머	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
설탕	시그마 알드리치	S0389-500G
TEMED	시그마 알드리치	T9281-25ML
DNA 어웨이 표면 오염 제거	ThermoFisher Scientific	7010PK	본문에서는 DNA 제거 제품이라고 합니다
Tris-Borate-EDTA 완충액 (10X 농도)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (DMSO에 10,000X 농축액)	ThermoFisher Scientific	S11494	텍스트에서는 gel stain
Equipment
BD Precisionglide로 언급됨; 주사기 바늘, 게이지 18	Sigma Aldrich	Z192554	모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다
Branson CPX 시리즈 초음파 욕조	Sigma Aldrich	Z769363	모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다
빈 젤 카세트, 미니, 1.0mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다
.메쉬 필터 플레이트 - Corning  HTS Transwell 96 유정 투과성 지지체 - 8.0 &마이크로; m pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	본문에서 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	모든 동급 하드웨어 허용
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	모든 동급 하드웨어 허용
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	모든 동급 하드웨어 허용
XCell SureLock Mini-Cell 시스템	ThermoFisher Scientific	EI0001	모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	동등한 하드웨어가 허용됩니다.
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	중단, 모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다
. Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	텍스트에서 gel imager로 언급
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	텍스트에서 UV transilluminator로 언급됨
초음파  배스	브랜소닉	1207K35	이에 상응하는 모든 초음파 수조를 사용할 수 있습니다.