Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

요약

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

초록

프로 테아 제 caspase 제품군 apoptosis와 타고 난 면제에 필수적인 역할을 한다. 이 중, 초기자 caspases로 알려진 네가이 경로에서 활성화 될 먼저 있습니다. 이 그룹 포함 caspase-2,-8, 및-9, 뿐만 아니라 염증 caspases, caspase-1,-4, 그리고-5. 초기자 caspases 모두 다음 모집 활성화 플랫폼 이라고 하는 특정 multiprotein 복합물을 이합체 화에 의해 활성화 됩니다. Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)은 어디 caspases 초기자 caspases 그들의 활성화 플랫폼 및 그 결과의 채용을 시각화 하는 데 사용 되는 시작자를 융합 하는 형광 단백질을 분할 영상 기반 접근 유도 근접입니다. 이 형광 판독을의 초기자 caspase 활성화에 필요한 초기 단계 중 하나를 제공 합니다. 다양 한 다른 현미경-기반 접근을 사용 하 여,이 기술은 caspase 활성화 크기 및 caspase 활성화의 활동 인구 수준에 caspase 활성화의 효율성에 양적 데이터를 제공할 수 있습니다. 셀 당 기초에 있는 복합물

서론

Caspase 프로 테아 제 가족은 apoptosis와 타고 난 면제 ¹에 그들의 중요 한 역할에 대 한 알려져 있다. 그들의 중요성 때문에 결정 언제, 어디서, 그리고 어떻게 효율적으로 특정 caspases 활성화 활성화 경로 caspase의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 이미징 기반된 프로토콜 caspase 활성화 폭포의 가장 이른 단계 시각화 수 있습니다. 이 기술은 활용 동적 단백질: 단백질 상호 작용의 그 드라이브 caspase 활성화.

Caspases는 두 그룹으로 분할 될 수 있다: 초기자 caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, 및-12)와 사형 집행 caspases (caspase 3-6과-7). 사형 집행 caspases 미리 형성한 이합체로 셀에 존재 하 고 크고 작은 소 단위 ²사이 분열에 의해 활성화 됩니다. 활성화 되 면, 그들은 apoptosis ³의 결과로 수많은 구조 및 규제 단백질을 쪼개 다. 초기자 caspases는 통로에서 활성화 될 및 일반적으로 사형 집행 caspases의 활성화를 방 아 쇠를 첫 번째 c....

프로토콜

1입니다. 셀 및 문화 요리 준비

참고: 조직 문화 층 류 두건에 1-3 단계를 수행 합니다. 장갑을 착용 한다.

1. 경우 유리 하단 요리에 사용 하 여, fibronectin 함께 유리 코트. 플라스틱 접시를 사용 하 여 경우 1.2 단계를 건너뜁니다.
   1. Fibronectin의 0.1 mg/mL 해결책 확인: 1 X PBS의 9 mL에 1 mg/mL fibronectin 솔루션의 1 mL를 희석.
   2. 0.5-1 각의 유리 하단 커버 fibronectin mL 및 실 온에서 1-5 분 동안 품 어.
   3. Fibronectin 솔루션을 수집 하 고 4 ° c.에서 저장 한 피 펫을 사용 하 여,
      참고: fibronectin 솔루션 여러 번 다시 사용할 수 있습니다.
   4. 일단 1-2 mL 1 X PBS 가진 유리를 세척 하 고 PBS에서 발음.
2. 플레이트 1 x 10⁵ 셀 해당 셀의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 당 문화 미디어 (다른 크기의 웰 스에 대 한 사용 하 여 셀 번호 표 1 참조). 셀 라인을 안정적으로 표현 하는 caspase BiFC 구성 요소 (내용 참조)를 사용....

결과

DNA 손상에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC의 예는 그림 3에 표시 됩니다. Camptothecin는 topoisomerase 나 억제제, DNA 손상 및 caspase-2 활성화를 유도 하는 데 사용 되었다. 빨간 형광 단백질 mCherry 셀 BiFC 프로브 표현 게재 하 고 셀의 총 수를 시각화 하기 기자로 서 사용 되었다. 금성 형광 녹색으로 표시 됩니다 및 큰 puncta는 caspase-2 대표 근접을 유도. 이 세포는 금성-긍정적인 세포의 백분율을 결정 하기 위해 계산 수 있습니다. Subcellular 지 방화에 대 한 결론도 같은 이미지를 만들 수 있습니다. 예, caspase-2 유도 근접 세포질 ¹⁷에서 또한 핵소체에서 발견 되었다. 복잡 한 caspase 활성화의 subcellular 지 방화의 고해상도 시각화를 제공 하려면 단일 셀 3 차원에.......

토론

이 프로토콜 caspase 유도 근접 측정을 분할 형광 단백질의 사용을 설명 합니다. 때문에 매우 밝은, 높은 photostable는 refolding 이며 빠른 ¹³분할 금성이이 기술을 위해 선택 되었다. 따라서, caspase 유도 근접 시 refolding 비너스의 분석은 caspase 단백질 상호 작용 역동성의 실시간 의견 가까이 제공할 수 있습니다. 금성 금성 (비너스-N 또는 VN) 구성 아미노산 1-173의 N terminus 두 약간 겹치는 조각으로 분할 하 고 C 터미널 조각 (금성 C 또는 VC) 이루어진 잔류물 155-239. 다른 분할 형광 단백질 존재 하지만 분할 mCherry 같은 일부 refolding ²¹에 대 한 최대 2 h 4 ° C에 외피를 필요 합니다. 추가 분할 형광 단백질 리안 (청록색 형광 단백질의 버전) 분할 등 고 멀리 빨간 분할 mLumin 아직이 컨텍스트 ¹³

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm 유리 바닥 접시	Mattek	P06G-1.5-20-F
인간 플라즈마 Fibronectin 정제 단백질	Millipore	FC010-10MG
DPBS	Sigma	D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 시약	Invitrogen	11668019
OPTI MEM I	Invitrogen	31985088
C2-Pro VC plasmid	Addgene	49261
C2-Pro VN plasmid	Addgene	49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids	available from LBH
			형광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene
HEPES	Invitrogen	15630106
2 Mercaptoethanol 1000X	Invitrogen	21985023
q-VD-OPH	Apex Bio	A1901

HeLa cells 안정적으로 발현되는 C2-Pro BiFC 성분을 LBH DsRed 미토 플라스미드 Clontech Cell의 요청에 의해 입수할 수 있는 Inflammatory caspase BiFC plasmids 632421 에서 찾을 수 있습니다.