방법 논문

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

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⸱

DOI:

10.3791/57330

⸱

2018년 4월 25일

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

이 논문에서

요약

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

초록

전기, 내 생 전기적 신호 이온 채널에 의해 중재 및 세포 막에 있는 펌프 고르기 신경 및 근육 세포의 프로세스와 같은 다른 많은 생물 학적 과정, 신호에 중요 한 역할 배아 개발 패턴입니다. 그러나, vivo에서 전기 활동 모니터링 척추 embryogenesis에 대 한 필요가 있다. 인코딩된 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs)의 진보는이 전에 대 한 솔루션을 제공할 수 만들었습니다. 여기, 우리 유전자 변형 전압 표시기 zebrafish 설립된 전압 표시기, ASAP1를 사용 하 여 만드는 방법에 설명 (가속 센서의 활동 전위 1), 예를 들어. Tol2 키트와 유비 쿼터 스 zebrafish 발기인, ubi, 이 연구에서 선정 됐다. 우리는 또한 게이트웨이 사이트 복제, Tol2 transposon 기반 zebrafish transgenesis, 그리고 일반 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 초기 단계 물고기 배아와 물고기 종양에 대 한 이미징 프로세스의 프로세스를 설명 합니다. 이 물고기 라인을 사용 하 여, 우리는 제 브라 embryogenesis, 그리고 물고기 애벌레 운동 하는 동안 세포 전기 전압 변화는 발견. 또한, 몇 가지 zebrafish 악성 말 초 신경 칼 집 종양, 셀은 일반적으로 편광 종양 주변 정상 조직에 비해 관찰 되었다.

서론

전기 이온 채널과1세포 막 있는 펌프에 의해 중재 생 전기 신호를 말합니다. 세포 막과 결합 된 전기 잠재력과 현재 변화, 이온 교환 프로세스 고르기 신경 및 근육 세포의 신호에 대 한 필수적입니다. 또한, 전기 및 이온 기온 변화도 다른 중요 한 생물 학적 기능 에너지 저장, 생 합성, 대사 산물 수송 등의 다양 한이 있다. 생체 전기 신호도 몸 축, 세포 주기, 세포 감 별 법1등 미 발달 패턴 형성의 레 귤 레이 터로 발견 되었다. 따라서, 그것은 이러한 유형의 신호의 미 규제에 기인 하 많은 인간의 선 천 성 질병을 이해 중요 합니다. 패치 클램프 널리 사용 되었습니다 단일 셀 기록, 배아 발달 비보중 여러 셀의 동시 모니터링에 이상적에서 멀리 아직도 이다. 또한, 전압 민감한 작은 분자는 또한 그들의 특이성, 감도, 및 독성 vivo에서 애플리케이션에 적합 하지.

창조의 다양 한 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs) 제공이이 문제를 극복 하기 위해 새로운 메커니즘이 인코딩되고 그들은 원래 신경 모니터링 위한 했다 비록 배아 개발 공부를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 허용 2,3세포. 현재 사용할 수 있는 GEVIs 중 하나는 가속 센서의 활동 전위 1 (ASAP1)4입니다. 그것은 전압 과민 한 인산 가수분해 효소와 원형으로 배치 된 녹색 형광 단백질의 전압 감지 도메인의 extracellular 루프의 구성 됩니다. 따라서, ASAP1 세포 전기 잠재적인 변화의 시각화 수 (분극: 밝은 녹색; 도발은: 진한 녹색). ASAP1 속도 론 온 오프 2 ms, 있으며 subthreshold 잠재적인 변경4를 추적할 수 있습니다. 따라서,이 유전 도구 라이브 셀에 실시간 생체 모니터링에 효능의 새로운 수준에 대 한 수 있습니다. 배아 발달에 많은 인간 질병, 암, 등 전기의 역할의 더 이해 것입니다 창 고 기본 메커니즘에 새로운 빛이는 질병 치료 및 예방에 매우 중요.

Zebrafish 강력한 동물 모델 개발 생물학과 암5,6을 포함 하 여 인간의 질병을 입증 되었습니다. 인간, 70 %orthologous 유전자를 공유 하는 그들은 그리고 그들은 유사한 척 추가 있는 생물학7. Zebrafish는 비교적 쉽게 치료, 계란, 온순한 유전학, 쉬운 transgenesis, 그리고 투명 한 외부 배아 발달, 그들에 게 비보에 이미징5,6우수한 시스템의 큰 클러치 크기를 제공 합니다. 이미 존재 하는 돌연변이 물고기 선의 큰 소스와 완전히 시퀀스 게놈, zebrafish는 과학적 발견의 상대적으로 무제한 범위를 제공 합니다.

Vivo에서 실시간 전기 세포의 활동을 조사, 우리 활용 zebrafish 모델 시스템 및 ASAP1. 이 문서에서 우리는 형광 전압 바이오 센서 ASAP1 Tol2 transposon transgenesis를 사용 하 여 zebrafish 게놈으로 통합 하는 방법을 설명 하 고 배아 개발, 물고기 애벌레 움직임, 그리고 라이브 종양에서 세포 전기 활동을 시각화 .

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프로토콜

Zebrafish는 AAALAC 승인 동물 시설에 보관 되어있습니다 그리고 모든 실험 프로토콜 퍼듀 동물 관리 및 사용 위원회 (PACUC)에 의해 승인에 따라 실시 했다.

1. Tol2 Transposon 플라스 미드 구조 준비

참고: Tol2, 메 다카 물고기에서 발견 되었다 transposon zebrafish 연구 커뮤니티8,9사용 널리 있다. 그것은 되었습니다 성공적으로 게이트웨이 사이트 재결합 기반 복제 시스템에 채택 및 Tol2 키트10로 알려진. Tol2 키트는 또한 transgenesis의 효율성을 증가 하는 동안 사용자 지정된 식 구문을 만드는의 더 편리한 방법에 대 한 수 있습니다. 따라서,이 시스템을 활용 하 고 검증된 유비퀴틴 발기인 ASAP111를 사용 하 여 유비 쿼터 스 ASAP1 식 제 브라 라인 만들기 쉬운 결정 이었다.

  1. 중간 항목 ASAP1 구조를 만들기: pDONR221 ASAP1
    1. Addgene에서 pcDNA3.1/순수 하지 않아-CAG-ASAP1 (플라스 미드 #52519), 유전으로 인코딩된 전압 센서 ASAP1 구조를 취득 합니다. ASAP1 코딩 영역 증폭 PCR 뇌관 (그림 1)의 5' 끝에 attB 시퀀스 형벌 사용자 지정된 뇌관 (attB1-ASAP1F와 attB2-ASAP1R)를 사용 하 여 설정 합니다. Phusion DNA 중 합 효소의 높은 효율을 위해 선택 되었다 그리고 PCR 조건12이전 게시 된 프로토콜 따라 최적화 된 했다.
    2. 태 젤 200 µ L 팁, 일반 피 펫을 사용 하 여 1%로 50 µ L PCR 제품을 로드 하 고 약 30 분 동안 가로 젤 탱크에 160 V에서 전기 영동을 수행.
    3. UV transilluminator에서 젤 확인 (353 nm), UV transilluminator 아래 블레이드/메스를 사용 하 여 이전에 게시13,14, 원하는 밴드 소비 세 그리고 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge로 DNA 포함 하 젤 샘플을 넣어 튜브입니다.
    4. ASAP1 PCR 제품 젤 정화를 수행 합니다. 제조업체의 지시에 따라 상업 DNA 젤 정화 키트를 사용 하 여 삭제 젤에서 DNA를 복구 하 고 물 20 µ L로 DNA을 elute. 샘플으로 1 µ L를가지고 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정. 빈 컨트롤15로 물을 사용 하 여 소프트웨어 지침 흐름.
    5. 받아 100 ng의 PCR 제품을 정화 하 고 150 믹스 테의 10 µ L 플라스 미드 pDONR221의 ng 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. 반응으로 혈압 Clonase II의 2 µ L을 추가 하 고 품 어 하룻밤 실 온에서 반응.
    6. 둘째 날에는 반응으로 가수분해 K의 1 µ L을 추가 하 고 품 어 30 분 동안 37 ° C에서 반응.
    7. 변환을 수행 합니다. 반응 전송 및 Top10 유능한 대장균 세포 및 품 어 30 분 동안 얼음에 셀의 50 µ L 함께 섞는다. 다음 전송 1 분에 42 ° C 물 목욕으로 반응 관은 즉시 튜브를 제거 하 고 2 분 동안 얼음에 품 어. 다음, 튜브 37 ° C 통에 넣고 1 시간을 위해 그것을 품 어.
    8. 튜브를 꺼내와 대 파운드 플레이트에 셀 접시. 다음, 접시 하룻밤 (16-18 h) 37 ° c.에 품 어
    9. 단일과 잘 분리 된 식민지를 선택 하 고 14 mL 셀 문화 튜브 파운드 매체의 3 mL에 접종. 하룻밤 250 rpm (분당 회전)의 회전 속도 함께 통에 37 ° C에서 문화 그들.
    10. Miniprep의 명령 수동17다음 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
    11. 3-4 플라스 미드를 시퀀스 생어 시퀀싱 식별 긍정적인 pDONR221-ASAP1 M13F 및 M13R 시퀀싱 뇌관을 사용 하 여 복제.
  2. Microinjection에 대 한 Tol2 구조를 만들기: pDestTol2-유비-ASAP1
    1. 시퀀싱 확인 pDONR221 ASAP1 복제 및 측정의 DNA 농도 분 광 광도 계 다음 빈 제어15물을 사용 하 여 소프트웨어 명령을 사용 하 여 선택 합니다.
    2. PDONR221-ASAP1의 100 µ g을 100 µ g Tol2 키트 5-엔드 플라스 미드의 혼합 (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µ g (Tol2 키트 #302) p3E-polyA의 및 pDestTol2pA2의 150 µ g (Tol2 키트 #394). 8 µ L 총 볼륨 조정 튜브 1.5 mL microcentrifuge TE 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)를 사용 하 고 2-5 s 간단한 소용돌이 의해 잘 혼합. 그런 다음 LR Clonase 2 플러스, 2 µ L을 추가 하 고 품 어 하룻밤 실 온에서 반응.
    3. 두 번째 날, 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 반응에 가수분해 K의 1 µ L을 추가 하 고 품 어 30 분 동안 37 ° C에서 반응.
    4. 변환을 수행 하 고 (단계 1.1.7-11) 위에서 설명한 대로 긍정적인 클론을 식별 합니다.
    5. 시퀀싱의 DNA 농도 측정 pDestTol2-유비-ASAP1 복제 (그림 1B)15분 광 광도 계 사용 하 여 확인 합니다. 일반적으로 농도 200ng / µ L입니다.

2. Tol2 Transposase mRNA와 주입 솔루션 준비

  1. 행진 대장균 글리세롤 주식에 있는 파운드 판 (100 µ g/mL 암 피 실린) pCS2FA transposase 플라스 미드 (Tol2 키트 #396)의 멸 균된 접종 루프를 사용 하 여. 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. 다음 날, 단일 식민지를 선택 하 고 멸 균된 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 그것의 파운드 (100 µ g/mL 암 피 실린) 3 mL에 접종. 하룻밤 250 rpm의 회전 속도 함께 통에 37 ° C에서 문화.
  2. 그것의 사용 설명서에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 대장균 문화에 miniprep를 수행 합니다. 1 분 14000 rpm에서 원심 분리기로 TE 버퍼의 30-50 µ L에 플라스 미드 DNA elute 그리고 DNA 농도 분 광 광도 측정.
  3. 내가 가진 플라스 미드의 1-2 µ g endonuclease 선형화 하 고 정화 청소 키트 후 하지의 사용 설명서를 다음 DNA와 DNA 소화. 14000 rpm에서 1 분간 centrifuging 여 물 5 µ L로 DNA를 elute. 에 대 한 예상된 농도 200-300 ng / µ L.
  4. 녹음 방송 생체 외에서 수행 하지 나 상업 SP6 전송 키트를 사용 하 여 DNA 템플렛으로 pCS2FA transposase를 선형화.
  5. 반응이 완료 되 면 Tol2 transposase mRNA 상업적인 RNA 청소를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 장비를 정화. 마지막으로, 20 µ L RNAase 무료 물으로 mRNA elute 고는 분 광 광도 계에 RNA 농도 측정 한다. 에 대 한 예상된 농도 1-3 µ g / µ L. 견본-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다 필요한 경우.
  6. 20 ng / µ L pDestTol2-유비를 혼합 하 여 microinjection 솔루션 준비-ASAP1 및 Tol2 transposase mRNA (100 ng / µ L) pipetting으로 microcentrifuge 관에서. 반복 해빙과 튜브 당 거, aliquot 6 µ L로 인 한 핵 산 저하를 방지 하려면 나중에 사용-80 ° C 냉동 고에 보관.

3입니다. microinjection

  1. 주입 하기 전에 오후 4-6 번 식 탱크 2 남성 및 2 명의 여성을 설정 합니다. 이 물고기는 오후에 먹여야 하지 해야 합니다. 이 단계 물고기 낭비의 양을 줄일 하 고 다음날 아침 또한 번 식 응답을 유도 하는 동시에 밖으로 그들을 청소 하는 시간을 절약할 것 이다.
  2. 다음 아침, 제거 준비 주입 솔루션 (pDestTol2-유비-ASAP1 구문 및 Tol2 mRNA)-80 ° C 냉동 고에서 얼음에 놓습니다.
  3. 물고기 사육 탱크에에서 디바이 더를 당겨 하 고 물고기 친구를 허용 합니다. 일반적으로, 생선 알을 꺼내 구분선 후 20-30 분 이내. 그렇지 않은 경우 1-2 시간 이상 기다립니다. 일부 물고기 계란을 전혀 놓지 않을 수 있습니다. 이 경우에, 물고기 배아 컬렉션에 대 한이 실험을 반복 합니다.
  4. 기다리는 동안, 거기에 바늘 팁 겸 자, 또는 섬세 한 작업와이 퍼에 침입 하 여 3d 가장자리를 만드는 각도에 깨진 준비 있는지 확인 합니다.
    1. 다음 매개 변수를 사용 하 여 micropipette 끌어당기는 사람에 유리 모 세관에서 바늘을 당겨: 545;가 열 풀 60; 속도 80; 시간 250; 압력 500입니다. 각도 약 45 °에는 집게를 잡고 집게 (직경 추정에 대 한 눈 조각 통치자)와 절 개 범위 아래와 바늘을 휴식. 원하는 바늘 직경 microinjector 설정에 따라 변수가 될 수 있습니다 하지만 작은 직경은 태아 사망률 감소에 대 한 선호.
  5. 일단 물고기는 계란, 10 cm 직경 페 트리 접시에에서 그들을 수집 하 고 절 개 범위에 그들을. 모든 비정상적인 배아를 제거 하 고 폐기물을 물고기.
  6. 피펫으로 준비 3 %agarose 주입으로 수정 된 배아 금형. 장소에 배아를 유지할 수 있도록 초과 물을 제거 합니다.
  7. 일단 모든 행 가능한 배아 가득 정렬 있도록 모든 단일 셀 약 45 ° 각도 수평으로 바늘을 향해 같은 방향으로 얼굴. 이것을 쉽게 주입 훨씬 나중.
  8. 장갑을 끼고, 동안 20 µ L 로드 피펫으로 사용 팁과 얼음에 튜브에서 준비 된 구문 5 µ L를 제거.
  9. 신중 하 게 그것은 팁에 가까운 시를 얻을로 꼭지를 시작 하는 위치에 있는 모든 방법이 깨진된 모 세관 튜브의 백 엔드에 팁을 삽입 합니다. 경우 여전히 공기 방울, 바늘, 팁을 아프게 하지를 흔들.
  10. Microinjection 바늘 홀더 연속으로 바늘을 삽입 하 고 바늘 자리에 유지 될 때까지 신중 하 게 강화. 약 45 ° 각도 조정 합니다.
  11. 일단 바늘 준비 하 고 연결, 현미경 및 가스 압력 탱크를 켭니다. 상업 CO2 탱크는이 목적을 위해 일반적으로 좋다. 지주 및 방출 압력에 의해 분사 볼륨 조정: 대략 0.5 psi 지주 및 방출에 대 한 30 psi. 솔루션 때 페달을 누르면 밖으로 나오는 것을 확인 해야 합니다.
  12. ~ 150 µ m 직경에서 솔루션의 흐름과 볼륨 조정 미네랄 오일의 방울으로 무대 마이크로미터를 사용 하 여 (약 2 nL). 백 프레셔 바늘의 똑 작은 금액을 드릴 것입니다 확인 하십시오. 충분히 다시 압력 없는 경우 모 세관 작용 액체 바늘을 입력 하는 mRNA를 파괴 하면 됩니다.
  13. 일단 바늘 보정, 수정 된 배아의 단일 셀에는 구조 주입 시작.
    참고:이 연습, 인 내, 그리고 기교, 피어스 하드 되 세포 막 때문에 많은 양의 걸립니다. 그것은 셀, 아니라 노 른 자, 유전자 변형 zebrafish를 생성 하기 위한 솔루션을 주입 하는 것이 중요입니다. 이 morpholino 주입에 다릅니다. 그것은 어느 쪽 바늘 입력 셀 구성 셀에가 하는 만큼 중요 하지 않습니다. 노 른 자는 셀에 주입 하는 경우는 transgenesis 성공의 매우 낮은 속도 할 것 이다. 단일 셀 단계 주입은 또한 중요 하다, 또는 체세포 키메라 물고기를 만들 것입니다. 이 세균 세포에 들어가는 transgene의 가능성을 줄일 것 이다.
  14. 젤 노치의 가장자리를 사용 하 여 제공 하는 장소에서 태아를 유지 및 태아를 이동 하지 않고 압력을 적용 하 니 백업. 일단 바늘의 팁 단일 셀에 원하는 양의 솔루션 출시 페달을 누릅니다. 배아의 모든에 대해이 프로세스를 반복 합니다.
  15. 완료 되 면, 물고기 시스템 물과 일회용 3.4 mL 전송 피 펫 agarose 노치에서 그들을 rinsing 하 여 레이블이 지정 된 그릇에 주입 된 배아를 전송. 그들이 개발 하는 28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 저장 합니다. 죽은 물고기 배아를 제거 하는 하루 동안 다시 확인 하 고 0.1% 메 틸 렌 블루 물고기 물에서 물을 바꿉니다.
  16. 주입 후 약 6-8 시간 걸릴 10 개인 주입 배아 물고기 고18인가요 메서드 사용 하 여 그들에서 게놈 DNA를 준비 합니다.
  17. 다음 아침, 비 노 른 자 조직에 GFP를 보여주는 배아 밖으로 정렬 하려면 형광 광원으로 해 부 현미경을 사용 합니다. 이러한 물고기 배아 삽입 된 구문을 포함 해야 합니다.
  18. Tol2 소비 분석 결과 확인 앞에서 설명한19transposon 활동을 수행 합니다. 삭제 플라스 미드를 감지할 수 있습니다, 유지는 삽입 된 배아를 물고기와 그들을 인상. 아니 삭제 플라스 미드는 검출 될 수 있다, Tol2 소비 분석 결과의 긍정적인 결과 얻을 때까지 Tol2 mRNA 합성 및 microinjection 프로세스를 반복 합니다.

4. 유전자 변형 ASAP1 물고기, 안내 설정 (ubi: ASAP1)

  1. 앞에서 설명한 zebrafish 책20에서 성인 기에 주입 된 물고기를 (F0 세대)를 올립니다. 이 일반적으로 약 4 개월 걸립니다.
  2. 단일 성인 F0 물고기 고 성별 wildtype 물고기 반대 한 번으로 교차. 나중에 번 식 후 물고기 배아를 수집 합니다. 물고기에서 28.5 ° C 배양 기에서 수집한 물고기 배아 0.1% 메 틸 렌 블루 물 유지.
  3. 제 3의 날에 GFP 필터 형광 해 부 현미경 아래 물고기 배아를 확인 합니다. 있을 경우, 초록 물고기 배아 밖으로 정렬 하 고 F1 세대 유전자 변형 물고기, Tg 성인이 그들을 인상 (ubi: ASAP1).
    참고: 이후 부모의 F0 물고기의 대부분은 세균 선 유전자 키메라 Mendelian 비율 예상 하지는.
  4. 크로스 wildtype 물고기와 단일 F1 성인 물고기 고 물고기 배아를 수집 합니다. 초록 물고기 배아 밖으로 정렬 하 고 F2 세대 생선으로 성인 기에 발생.
    참고: 녹색과 비 그린 물고기 배아 가까이 있어야 한다 1:1 단일 transgene 인지.
  5. 악성 말 초 신경 칼 집 종양 (MPNST) 같은 종양에서 전기 잠재적인 변화를 보려면 F2 세대 Tg 크로스 (ubi: ASAP1) rpl35hi258/wt 물고기와 물고기. 보이는 종양 6-8 달 오래 된 성인21,22에서 찾을 수 시작을 알려졌다.

5입니다. 영상

  1. Zebrafish 태아 이미지, 여러 F2 세대 설립자 물고기 고 개별 쌍에서 wildtype 물고기와 그들을 교차 하는 것 하. 준비 가이드23zebrafish에 따르면 다른 원하는 발달 단계에서 물고기 배아를 수집 합니다.
  2. 물고기 배아의 초기 단계에 대 한 껍질 하 고 신중 하 게 집게의 쌍을 사용 하 여 10 cm 직경 물고기 시스템 물으로 페 트리 접시에에서 절 개 범위에서 배아의 chorions를 제거 합니다.
  3. 3.4 mL 처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 3% 스와 concaved 유리 슬라이드에 몇 가지 물고기 배아를 전송 합니다. 배아는 형광 절 개 범위 아래 바늘을 사용 하 여 셀룰러 GFP 활동을 볼 수 원하는 위치를 조정 합니다.
  4. 물고기의 이동 단계 배아 (12 somite 단계 보다 더 오래 된), 0.05% tricaine mesylate 물고기 배아 슬라이드에 그들을 전송 하기 전에 anesthetize를 사용 합니다. 간단히, 그들은 수영, 손실 신체 균형을 멈출 때까지 물고기 배아 물고기 물에서 0.05% tricaine mesylate에 등장 했다. 또한, 슬라이드에는 스와 0.05% tricaine mesylate 방울을 추가 합니다.
  5. 미만 12 somite 무대 물고기 배아에 대 한 호환 카메라와 소프트웨어 피 형광 화합물 현미경을 사용 하 여 이미징. 12 somite 무대 물고기 배아 보다 오래 된에 대 한 형광 해 부 현미경을 사용 합니다.
  6. 종양 세포 전압 이미지, 먼저 MPNST 종양 물고기를 식별. 그런 다음 anesthetize 0.05% tricaine mesylate와 물고기. 전체 산에 대 한 이미징, 10 cm 직경 페 트리 접시에 생선을 넣어. 종양 세포 전기 활동을 보려면 물고기 종양 수 수 해 부 밖으로 전체 마운트 영상 후.

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결과

성공적인 주입, 주입 50% 물고기 배아는 체세포에 녹색 형광의 어느 정도 표시 됩니다 그리고 그들의 대부분은 Tol2 transposon 소비 분석 결과 (그림 2)에 의해 긍정적인 것 보다 더 많은. 후 2-4 세대-wildtype 물고기 (까지 형광 물고기 도달 예상된 Mendelian 비율 50%)와 교차, 유전자 변형 물고기 배아 개발 하는 동안 세포 막 잠재력을 추적 하기 위해 이미징 실험을 위해 사용 되었다. 첫째, 막 잠재적인 변경 zebrafish 초기 배아 발달 단계 동안 세포 주기 동안 시험 되었다. 세포 분열 밭 고 랑 형성 (-3C,그림 3A와 보조 비디오 1) 전에 hyperpolarized 관찰 되었다. 또한, 다른 조직 했다 막 잠재력의 다양 한 1 ~ 3 일에 오래 된 물고기...

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토론

있지만 세포와 조직 수준의 전기 활동 배아 개발 및 인간 질병 동안 오래 전에 발견 되었다, vivo에서 동적 전기 변화 및 그들의 생물학 역할 여전히 남아 크게 알 수 없는. 주요 과제 중 하나는 시각화 하 고 계량 전기 변화입니다. 단일 셀을 추적 하기 위한 휴식 통해 패치 클램프 기술 이다 하지만 그들은 많은 세포의 구성 되어 있기 때문에 척추 동물 배아의 응용 제한 됩니다. 현재 화학 전압 염료는도 그들의 감도, 특이성, 및 독성 이상적 없습니다. GEVIs의 발명품에 최근 노력 vivo에서 세포 전기 활동을 시각화 하는 새로운 경로 제공 하 고 실시간으로. 여기, 우리가 zebrafish 전기 기자 선, Tg를 만드는 과정을 보여주었다 (ubi:ASAP1).

이 기자 물고기 라인을 사용 하 여, 우리 zebrafish 태아에 있는 세포 전기 활동을 모니터링할 수 있습니다을 보여줍니다. 높은 전기 전압 변화는 초기 미 발달 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 간행물에 보고 된 연구 작업에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM124913, 퍼듀 대학 PI4D 인센티브 프로그램, 그리고 PVM 내부 경쟁에서 국립 보건원의 지원 기초 연구 자금 프로그램입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 자금 에이전트의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 우리 Tol2 구문, ASAP1 구문에 대 한 마이클 린 고이치 가와카미를 감사 하 고 레너드 Zon ubi 발기인에 대 한 Addgene를 통해 생성.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
14mL 세포 배양 튜브VWR60818-725대장균 배양
아가로스 전기영동 탱크Thermo ScientificOwl B2DNA 전기영동
아가로스 RAAmrescoN605-500G주입 젤
Attb1-ASAP1-F 프라이머IDT DNAGGGGACAAGTTTGTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		서브클로닝을 위한 ASAP1 코딩 영역 증폭
Attb2-ASAP1-R 프라이머IDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA		서브클로닝을 위한 ASAP1 코딩 영역 증폭
명시야 해부 스코프NikonSMZ 745데코리오네이션, 미세주입,
마운트 컬러 카메라ZeissAxioCam MRcFish embryo 이미지 기록
오목 슬라이드VWR48336-001이미징 프로세스 중 물고기 배아 유지용
일회용 전달 피펫 3.4 mlThermo Scientific13-711-9AM물고기 배아 및 물 전달
엔도뉴클레아제 효소, Not INEBR0189L플라스미드 DNA
에피푸오레성 화합물 스코프ZeissAxio Imager.A2Fish 배아 이미징
Epifuorescent stereo dissection scopeZeissStereo Discovery.V12Fish embryo imaging
형광 광원Lumen dynamicsX-cite seris 120형광 현미경용 광원
겸자 #5WPI500342Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mixThermo Scientific11789020Gateway BP 재조합 클로닝
Gateway LR Clonase II Plus 효소Thermo Scientific12538120Gateway LR 재조합 클로닝
겔 DNA 회수 키트Zymo ResearchD4002DNA 겔 정제
로딩 팁Eppendorf930001007모세혈 바늘에 주입액 로딩용
메틸셀룰로오스(1600cPs)Alfa Aesar43146물고기 배아 장착
메틸렌 블루Sigma-AldrichM9140페트리 접시의 곰팡이 발생 억제
미세 사출 금형적응 과학 도구TU-1주입 중 물고기 배아를 보관하기 위한 아가르제 금형 트레이를 준비하기 위해
마이크로인젝터WPI공압 피코 펌프 PV820마이크로사출 인젝터
마이크로 매니퓰레이터WPI마이크로인젝터 MM3301R마이크로인젝션 작동
마이크로피펫 풀러셔터 기기P-1000모세관 바늘 준비용
미네랄 오일AmrescoJ217-500ml주입량 교정용
mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트Thermo ScientificAM1340mRNA 체외 전사
단색 카메라ZeissAxioCam MRm물고기 배아 이미지 기록
플라스미드 Miniprep KitZymo ResearchD4020소량의 플라스미드 DNA
준비 플라스틱 페트리 접시VWR25384-088이미징 프로세스 중 물고기 또는 물고기 배아 보관용
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015mRNA 세척 후 체외 전사
분광 광도계Thermo ScientificNanoDrop 2000DNA 및 RNA 농도 측정용
스테이지 마이크로미터Am ScopeMR100미세주입 부피 보정
ThermocyclerBio-RadT100유전자 복제를 위한 DNA 증폭
얇은 벽 유리 모세관WPI TW100F-4원숭이 바늘
Tol2-exL1 프라이머IDT DNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 소비세 분석
Tol2-exR 프라이머IDT DNAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGTol2 소비세 분석
TOP10 화학적으로 유능한 대장균Thermo ScientificC404006유전자 클로닝
중 형질전환에 사용트리카인 메실레이트시그마-알드리치A5040물고기 또는 물고기 배아 마취용
UV 트랜스 일루미네이터 302nmUVPM-20VDNA 시각화
수조Thermo Scientific2853유전자 클로닝의 형질전환 과정용
선형화용

참고문헌

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