Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Martin R. Silic; GuangJun Zhang

doi:10.3791/57330

Method Article

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

Martin R. Silic¹ , GuangJun Zhang¹^,²

¹Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, ²Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Abstract

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전기, 내 생 전기적 신호 이온 채널에 의해 중재 및 세포 막에 있는 펌프 고르기 신경 및 근육 세포의 프로세스와 같은 다른 많은 생물 학적 과정, 신호에 중요 한 역할 배아 개발 패턴입니다. 그러나, vivo에서 전기 활동 모니터링 척추 embryogenesis에 대 한 필요가 있다. 인코딩된 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs)의 진보는이 전에 대 한 솔루션을 제공할 수 만들었습니다. 여기, 우리 유전자 변형 전압 표시기 zebrafish 설립된 전압 표시기, ASAP1를 사용 하 여 만드는 방법에 설명 (가속 센서의 활동 전위 1), 예를 들어. Tol2 키트와 유비 쿼터 스 zebrafish 발기인, ubi, 이 연구에서 선정 됐다. 우리는 또한 게이트웨이 사이트 복제, Tol2 transposon 기반 zebrafish transgenesis, 그리고 일반 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 초기 단계 물고기 배아와 물고기 종양에 대 한 이미징 프로세스의 프로세스를 설명 합니다. 이 물고기 라인을 사용 하 여, 우리는 제 브라 embryogenesis, 그리고 물고기 애벌레 운동 하는 동안 세포 전기 전압 변화는 발견. 또한, 몇 가지 zebrafish 악성 말 초 신경 칼 집 종양, 셀은 일반적으로 편광 종양 주변 정상 조직에 비해 관찰 되었다.

Introduction

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전기 이온 채널과¹세포 막 있는 펌프에 의해 중재 생 전기 신호를 말합니다. 세포 막과 결합 된 전기 잠재력과 현재 변화, 이온 교환 프로세스 고르기 신경 및 근육 세포의 신호에 대 한 필수적입니다. 또한, 전기 및 이온 기온 변화도 다른 중요 한 생물 학적 기능 에너지 저장, 생 합성, 대사 산물 수송 등의 다양 한이 있다. 생체 전기 신호도 몸 축, 세포 주기, 세포 감 별 법¹등 미 발달 패턴 형성의 레 귤 레이 터로 발견 되었다. 따라서, 그것은 이러한 유형의 신호의 미 규제에 기인 하 많은 인간의 선 천 성 질병을 이해 중요 합니다. 패치 클램프 널리 사용 되었습니다 단일 셀 기록, 배아 발달 비보중 여러 셀의 동시 모니터링에 이상적에서 멀리 아직도 이다. 또한, 전압 민감한 작은 분자는 또한 그들의 특이성, 감도, 및 독성 vivo에서 애플리케이션에 적합 하지.

창조의 다양 한 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs) 제공이이 문제를 극복 하기 위해 새로운 메커니즘이 인코딩되고 그들은 원래 신경 모니터링 위한 했다 비록 배아 개발 공부를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 허용 ²<....

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Protocol

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Zebrafish는 AAALAC 승인 동물 시설에 보관 되어있습니다 그리고 모든 실험 프로토콜 퍼듀 동물 관리 및 사용 위원회 (PACUC)에 의해 승인에 따라 실시 했다.

1. Tol2 Transposon 플라스 미드 구조 준비

참고: Tol2, 메 다카 물고기에서 발견 되었다 transposon zebrafish 연구 커뮤니티⁸^,⁹사용 널리 있다. 그것은 되었습니다 성공적으로 게이트웨이 사이트 재결합 기반 복제 시스템에 채택 및 Tol2 키트¹⁰로 알려진. Tol2 키트는 또한 transgenesis의 효율성을 증가 하는 동안 사용자 지정된 식 구문을 만드는의 더 편리한 방법에 대 한 수 있습니다. 따라서,이 시스템을 활용 하 고 검증된 유비퀴틴 발기인 ASAP1¹¹를 사용 하 여 유비 쿼터 스 ASAP1 식 제 브라 라인 만들기 쉬운 결정 이었다.

중간 항목 ASAP1 구조를 만들기: pDONR221 ASAP1
1. Addgene에서 pcDNA3.1/순수 하....

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Results

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성공적인 주입, 주입 50% 물고기 배아는 체세포에 녹색 형광의 어느 정도 표시 됩니다 그리고 그들의 대부분은 Tol2 transposon 소비 분석 결과 (그림 2)에 의해 긍정적인 것 보다 더 많은. 후 2-4 세대-wildtype 물고기 (까지 형광 물고기 도달 예상된 Mendelian 비율 50%)와 교차, 유전자 변형 물고기 배아 개발 하는 동안 세포 막 잠재력을 추적 하기 위해 이미징 실험을 위해 사용 되었다. 첫째, 막 잠재적인 변경 zebrafish 초기 배아 발달 단계 동안 세포 주기 동안 시험 되었다. 세포 분열 밭 고 랑 형성 (-3C,그림 3A와 보조 비디오 1) 전에 hyperpolarized 관찰 되었다. 또한, 다른 조직 했다 막 잠재력의 다양 한 1 ~ 3 일에 오래 된 물고기.......

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Discussion

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있지만 세포와 조직 수준의 전기 활동 배아 개발 및 인간 질병 동안 오래 전에 발견 되었다, vivo에서 동적 전기 변화 및 그들의 생물학 역할 여전히 남아 크게 알 수 없는. 주요 과제 중 하나는 시각화 하 고 계량 전기 변화입니다. 단일 셀을 추적 하기 위한 휴식 통해 패치 클램프 기술 이다 하지만 그들은 많은 세포의 구성 되어 있기 때문에 척추 동물 배아의 응용 제한 됩니다. 현재 화학 전압 염료는도 그들의 감도, 특이성, 및 독성 이상적 없습니다. GEVIs의 발명품에 최근 노력 vivo에서 세포 전기 활동을 시각화 하는 새로운 경로 제공 하 고 실시간으로. 여기, 우리가 zebrafish 전기 기자 선, Tg를 만드는 과정을 보여주었다 (ubi:ASAP1).

이 기자 물고기 라인을 사용 하 여, 우리 zebrafish 태아에 있는 세포 전기 활동을 모니터링할 수 있습니다을 보여줍니다. 높은 전기 전압 변화는 초기 미 발달 .......

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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이 간행물에 보고 된 연구 작업에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM124913, 퍼듀 대학 PI4D 인센티브 프로그램, 그리고 PVM 내부 경쟁에서 국립 보건원의 지원 기초 연구 자금 프로그램입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 자금 에이전트의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 우리 Tol2 구문, ASAP1 구문에 대 한 마이클 린 고이치 가와카미를 감사 하 고 레너드 Zon ubi 발기인에 대 한 Addgene를 통해 생성.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
14mL 세포 배양 튜브	VWR	60818-725	대장균 배양
아가로스 전기영동 탱크	Thermo Scientific	Owl B2	DNA 전기영동
아가로스 RA	Amresco	N605-500G	주입 젤
Attb1-ASAP1-F 프라이머	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	서브클로닝을 위한 ASAP1 코딩 영역 증폭
Attb2-ASAP1-R 프라이머	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA	서브클로닝을 위한 ASAP1 코딩 영역 증폭
명시야 해부 스코프	Nikon	SMZ 745	데코리오네이션, 미세주입,
마운트 컬러 카메라	Zeiss	AxioCam MRc	Fish embryo 이미지 기록
오목 슬라이드	VWR	48336-001	이미징 프로세스 중 물고기 배아 유지용
일회용 전달 피펫 3.4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	물고기 배아 및 물 전달
엔도뉴클레아제 효소, Not I	NEB	R0189L	플라스미드 DNA
에피푸오레성 화합물 스코프	Zeiss	Axio Imager.A2	Fish 배아 이미징
Epifuorescent stereo dissection scope	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Fish embryo imaging
형광 광원	Lumen dynamics	X-cite seris 120	형광 현미경용 광원
겸자 #5	WPI	500342	Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Thermo Scientific	11789020	Gateway BP 재조합 클로닝
Gateway LR Clonase II Plus 효소	Thermo Scientific	12538120	Gateway LR 재조합 클로닝
겔 DNA 회수 키트	Zymo Research	D4002	DNA 겔 정제
로딩 팁	Eppendorf	930001007	모세혈 바늘에 주입액 로딩용
메틸셀룰로오스(1600cPs)	Alfa Aesar	43146	물고기 배아 장착
메틸렌 블루	Sigma-Aldrich	M9140	페트리 접시의 곰팡이 발생 억제
미세 사출 금형	적응 과학 도구	TU-1	주입 중 물고기 배아를 보관하기 위한 아가르제 금형 트레이를 준비하기 위해
마이크로인젝터	WPI	공압 피코 펌프 PV820	마이크로사출 인젝터
마이크로 매니퓰레이터	WPI	마이크로인젝터 MM3301R	마이크로인젝션 작동
마이크로피펫 풀러	셔터 기기	P-1000	모세관 바늘 준비용
미네랄 오일	Amresco	J217-500ml	주입량 교정용
mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트	Thermo Scientific	AM1340	mRNA 체외 전사
단색 카메라	Zeiss	AxioCam MRm	물고기 배아 이미지 기록
플라스미드 Miniprep Kit	Zymo Research	D4020	소량의 플라스미드 DNA
준비 플라스틱 페트리 접시	VWR	25384-088	이미징 프로세스 중 물고기 또는 물고기 배아 보관용
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	mRNA 세척 후 체외 전사
분광 광도계	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	DNA 및 RNA 농도 측정용
스테이지 마이크로미터	Am Scope	MR100	미세주입 부피 보정
Thermocycler	Bio-Rad	T100	유전자 복제를 위한 DNA 증폭
얇은 벽 유리 모세관		WPI TW100F-4	원숭이 바늘
Tol2-exL1 프라이머	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC	Tol2 소비세 분석
Tol2-exR 프라이머	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Tol2 소비세 분석
TOP10 화학적으로 유능한 대장균	Thermo Scientific	C404006	유전자 클로닝
중 형질전환에 사용트리카인 메실레이트	시그마-알드리치	A5040	물고기 또는 물고기 배아 마취용
UV 트랜스 일루미네이터 302nm	UVP	M-20V	DNA 시각화
수조	Thermo Scientific	2853	유전자 클로닝의 형질전환 과정용

선형화용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
Storace, D., et al.

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